77

Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metod¹ microarray . . .

Badanie ekspresji genów metod¹ microarray –

perspektywy wykorzystania w medycynie

Analysis of gene expression with microarrays – application

in medicine

R

AFA£

P

AWLICZAK

1, 2/

, M

AREK

L. K

OWALSKI

1/

1/

Katedra i Zak³ad Immunologii Klinicznej AM w £odzi, ul. Pomorska 251, 92-213 £ódŸ

2/

Critical Care Medicine Department, Warren Grant Magnuson Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA

Ostatnia dekada przynios³a burzliwy rozwój technologii badania

ekspresji genów. Technologia odwrotnej transkrypcji po³¹czona

z reakcj¹ ³añcuchow¹ polimerazy monitorowanej komputerowo

w czasie rzeczywistym umo¿liwi³a jednoczesne badanie ekspresji do

kilkuset genów w ci¹gu kilkudziesiêciu minut. Kolejnym etapem

rozwoju biologii molekularnej sta³o siê opracowanie systemu

jednoczesnej hybrydyzacji cRNA bêd¹cego produktem kilku tysiêcy

genów, a zastosownie komputerowych technik odczytu i analizy

danych spowodowa³o, ¿e systemy microarray sta³y siê „z³otym

standardem” w badaniu ekspresji onkogenów, skutków dzia³ania

czynników chemicznych i fizycznych na organizm ¿ywy. Systemy

te pozwalaj¹ firmom farmaceutycznym na jednoczesne testowanie

wp³ywu wielu substancji chemicznych o potencjalnym dzia³aniu

przeciwnowotworowym na ekspresjê genów spe³niaj¹cych istotne

funcje w rozmna¿aniu siê komórek nowotworowych. W artykule

autorzy omawiaj¹ szczegó³owo techniczne aspekty technologii

microarray, jej odmiany oraz przedstawiaj¹ wyniki dotychczasowego

zastosowania tych systemów w reumatologii, onkologii i chorobach

p³uc. Autorzy przedstawiaj¹ równie¿ w³asne doœwiadczenia dotycz¹ce

wykorzystania cDNA arrayu w badaniu zapalenia alergicznego

w komórkach nab³onka dróg oddechowych.

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

S³owa kluczowe: mikromacierze RNA, ekspresja genów, metody

molekularne w medycynie

Microarrays are one of the latest breakthroughs in experimental

molecular biology, which allow monitoring of gene expression for tens

of thousands of genes in parallel and are already producing huge amounts

of valuable data. Microarray RNA expression on a genome-wide scale

is now a proven technology, although the idea of analysis of expression

many genes in one sample is not new. The development of clone

printing technology and oligonucleotide synthesis allowed to produce

high-density microarray. These systems together with more powerful

and fast computer and software systems were applied not only in basic

science but also in clinical medicine and pharmaceutical industry. In this

publication the authors provide the information about the technology,

available detection systems and data analysis software. Comprehensive

review of current and fundamental papers using microarray technology

application in rheumatoid arthritis, oncology, cystic fibrosis research,

and allergic airways inflammation is also included.

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

Key words: RNA microarrays, gene expression, molecular methods

in medicine

S³ownik skrótów i pojêæ stosowanych w pracy:

Ard-1 – czynnik transkrypcyjny
cDNA – komplementarne DNA, otrzymane w wyniku synte-

zy w oparciu o matrycê mRNA

CFTR – (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Re-

gulator) – regulator przewodnictwa b³onowego, od-

powiada za istnienie zale¿nej od cAMP regulacji ka-
na³u chlorkowego.

c-jun – czynnik transkrypcyjny wchodz¹cy w sk³ad kom-

pleksu AP-1

Col-1 – kolagenaza 1
CPX

– 8-cyklopentyl-1,3-dipropyl-ksantyna, anatagonista

receptora adenozynowego A1

cRNA – komplementarne RNA, otrzymane w wyniku synte-

zy RNA w oparciu o matrycê cDNA.

DB1

– (DNA binding protein 1) – bia³ko wi¹¿¹ce DNA,

czynnik transkrypcyjny

EST

– (Expressed Sequence Taq) – sekwencja koduj¹ca

(mRNA)

GelA – ¿elatynaza A
GSCF – czynnik stymuj¹cy wzrost kolonii granulocytów
HME – (human matrix metallo-elastase) – ludzka elastaza

substancji miedzykomórkowej

IVT

– (in vitro transcription) – synteza cRNA na matrycy

cDNA

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

IMMUNOLOGIA KLINICZNA

78

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

Jednoczesne badanie ekspresji wielu genów nie jest

pomys³em nowym. Od kilkunastu lat próbowano zastoso-

waæ technikê RPA (RNAase Protection Assay) do jedno-

czesnego iloœciowego i jakoœciowego badania kilku lub kil-

kunastu mRNA w jednej próbce. Wprowadzenie techniki

RT-PCR (odwrotna trankrypcja i ³añcuchowa reakcja po-

limerazy) umo¿liwi³o badanie ekspresji kilku mRNA w jed-

nej próbce biologicznej wykorzystuj¹c tzw. multiplex PCR.

Pomys³ jednoczesnego badania ekspresji wielu genów

nie pojawi³ siê w ci¹gu ostatniej dekady – kiedy to biolo-

gia molekularna rozwija³a siê szczególnie szybko. Zaled-

wie w rok po wynalezieniu przez Karry Mullis’a ³añcu-

chowej reakcji polimerazy, w 1987 roku L. Augenlicht

i wsp. zastosowali po raz pierwszy technologiê cDNA mi-

croarray [1]. Naniesiono wówczas na paski nitrocelulozy

4000 sklonowanych sekwencji cDNA. Nastêpnie wyko-

nano ich hybrydyzacjê ze znakowanymi radioaktywnie

cDNA uzyskanymi z mRNA pochodz¹cymi z komórek

raka okrê¿nicy oraz prawid³owych komórek jelita. Techni-

ka ta w istocie by³a niczym innym jak odwrócon¹ dot-blot

hybrydyzacj¹ i dostarczy³a tysiêcy radioaktywnych punk-

tów, dla których liczba rozpadów na sekundê by³a wprost

proporcjonalna do bezwzglêdnej ekspresji danego genu w

badanych komórkach. Autorzy opracowali wówczas rów-

nie¿ system komputerowy pozwalaj¹cy na odczyt, zapis,

analizê oraz graficzn¹ prezentacjê uzyskanych danych.

System ten pozwoli³ na wykrycie ró¿nic w ekspresji

genów pomiêdzy ró¿nymi typami histologicznymi raka

okrê¿nicy, umo¿liwi³ wskazanie genów, których ekspresja

by³a inna w próbkach pobranych od pacjentów i w ho-

dowlach in vitro [2].

W po³owie lat 90. pomys³ jednoczesnego badania eks-

presji wielu genów zosta³ przypomniany przez wiele grup

badawczych i firm biotechnologicznych. Zastosowano przy

tym wiele systemów pos³uguj¹c siê fragmentami genów

uzyskanymi w technice PCR, plazmidami zwieraj¹cymi

sekwencje genów oraz syntetycznymi oligonukleotydami.

Fragmenty cDNA lub oligonukleotydy by³y przy tym nano-

szone na szereg matryc, pocz¹wszy od membran nylono-

wych przez szklane szkie³ka mikroskopowe, a skoñczyw-

szy na plastikowych p³ytkach [3]. Do nanoszenia oligonu-

kleotydów zastosowano równie¿ systemy druku przypomi-

j¹ce komputerowe drukarki atramentowe. [4].

W ci¹gu ostatniej dekady udoskonalono precyzjê

i powtarzalnoœæ wyników uzyskiwanych przy zastosowa-

niu microarray’u, obni¿ono dramatycznie iloœæ mRNA nie-

zbêdnego do uzyskania nie budz¹cych w¹tpliwoœci wyni-

ków, zwiêkszono równie¿ liczbê genów, których ekspre-

sjê mo¿na badaæ w jednym eksperymencie. Firmowy mi-

croarray jest w chwili obecnej w stanie mierzyæ ekspre-

sjê ponad 10 000 genów w jednej próbce. Wydaje siê, ¿e

jedynym ograniczeniem dla zwiêkszenia liczby genów

w komercyjnie dostêpnych microaaray’ach jest stopieñ

z sekwencjonowania genomu cz³owieka (lub organizmu

zwierzêcia doœwiadczalnego) oraz publiczna dostêpoœæ

tych sekwencji.

Ostatnie prace wykonane przy zastosowaniu techno-

logii microarray wskazuj¹, ¿e przy jej u¿yciu mo¿liwe jest

wykrycie ju¿ dwukrotnego wzrostu ekspresji genu, dys-

ponuj¹c zaledwie jedn¹ kopi¹ transkryptu na komórkê [5].

Dalszy rozwój systemów mikrodrukowania, syntezy

oligonukleotydów, a tak¿e gromadzenia i analizy danych

spowoduje prawdopodobnie dalszy postêp i zwiêkszenie

dostêpnoœci microaarrayu, któremu bêdzie towarzyszy³

wzrost wymagañ potencjalnych u¿ytkowników.

JAK

– grupa czynników transkrypcyjnych

MIF

– (migration inhibitory factor) – czynnik hamuj¹cy mi-

gracjê

MMP

– (matrix degrading metalloproteinase) – metalo-

proteinaza trawi¹ca substancjê miêdzykomórkow¹

MUC 18 – mucyna 18 – jedno z wielu bia³ek wydzielanych przez

gruczo³y œluzowe oskrzeli

Multipleks PCR – ³añcuchowa reakcja polimerazy z wykorzy-

staniem wielu par starterów; umo¿liwia badanie eks-

presji wielu genów podczas jednej reakcji PCR

NF-E1 – czynnik transkrypcyjny
ORF

– (Open Reading Frame) – otwarta ramka odczytu,

sekwencja dojrza³ego mRNA koduj¹ca sekwencjê

aminokwasów

PKA

– kinaza bia³kowa A

PMA

– ester forbolu

RAGE – (Rapid Gene Expression) – technologia RT-PCR

wykorzystuj¹ca uniwersalne startery, umo¿liwiaj¹-

ce uzyskanie wstêpnego produktu reakcji PCR jako
wielu fragmentów koduj¹cych geny; ciêcie tak uzy-

skanego produktu przy u¿yciu odpowiednich en-
zymów restrykcyjnych pozwala na uzyskanie w wy-

niku elektroforezy kilkudziesiêciu fragmentów swo-

istych dla badanych genów

RPA

– (RNAase Protection Assay) – technika iloœciowej

oceny mRNA

RT-PCR – (reverse transcription polymerase chain reaction)

– reakcja odwrotnej transkrypcji i ³añcuchowa reak-
cja polimerazy

STAT

– grupa czynników traskrypcyjnych

Strom-1 – stromelizyna 1
TIMPS – (tissue inhibitor of metalloproteinase) – tkanko-

wy inhibitor metaloproteinazy

79

Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metod¹ microarray . . .

Technologia

Technicznie wyro¿nia sie dwa odrêbne systemy:

cDNA microarray jest zwykle szkie³kiem podstawowym

preparatu mikroskopowego, na którym mikrodrukarka dru-

kuje seryjnie cDNA o d³ugoœci 0,5-2kb – uzyskane w wy-

niku klonowania produkty reakcji RT-PCR. Obecne mo¿-

liwoœci techniczne pozwalaj¹ potencjalnie na naniesienie

25 000 cDNA na powierzchni jednego szkie³ka mikro-

skopowego. Szklana p³ytka jest zwykle pokrywana poli-

L-lizyn¹, do której cDNA zawieszone w 3xSSC wi¹¿e

siê spontanicznie. Inkubacja w temperaturze 100°C po-

woduje denaturacjê cDNA i umo¿liwia usuniêcie niezwi¹-

zanych cz¹steczek. Alternatywn¹ technik¹ jest niekowa-

lencyjne wi¹zanie cDNA do powierzchni szk³a przygoto-

wanej uprzednio aminopropyletoksylenem przy u¿yciu 6M

tiocyjanianu sodu. Produkt otrzymany w wyniku reakcji

PCR mo¿e zostaæ równie¿ zmodyfikowany przy u¿yciu

amin i zwi¹zany do szk³a pokrytego warstw¹ silikonu.

Z opisanych powy¿ej systemów nanoszenia cDNA

na powierzchniê szkie³ka mikroskopowego najczêœciej

stosowany jest sposób pierwszy, zapewniaj¹cy stosunko-

wo pewne wi¹zanie i równomierne rozproszenie cz¹ste-

czek kwasu nukleinowego.

Podstawow¹ zalet¹ tej technologii jest mo¿liwoœæ za-

stosowania w³asnych sekwencji oligonukleotydów, które

nie zosta³y jeszcze opublikowane lub zg³oszone do Gene

Bank’u. Technika ta pozwala równie¿ na zwiêkszenie

czu³oœci metody w stosunku do systemu Gene Chip,

przez wyeliminowanie wplywu polimorfizmu genów na

stopieñ ekspresji. Umo¿liwia poza tym pe³n¹ kontrolê nad

liczb¹ i sekwencj¹ badanych genów.

GeneChip (lub inaczej microarray oligonukleotydo-

wy) natomiast jest plastykow¹ p³ytk¹, na której bezpo-

œrednio (in situ) wykonano syntezê oligonukleotydów tech-

nik¹ fotolitograficzn¹. Po syntezie ³añcucha oligonukle-

otydów lampa rtêciowa oœwietla powierzchniê p³ytki przez

odpowiedni¹ przes³onê, powoduj¹c ich deprotekcjê przez

usuniêcie wra¿liwych na œwiat³o grup chemicznych. Jest

to typowy proces technologiczny, maj¹cy miejsce w ka¿-

dej syntezie oligonukleotydów (np. starterów do reakcji

PCR). W technologii GeneChip nie jest mo¿liwe jednak

oczyszczanie produktu (jak ma to miejsce podczas typo-

wej syntezy oligonukleotydów). St¹d te¿ wydajnoœæ re-

akcji jest stosunkowo niska i wynosi ok. 90%. Syntetyzo-

wane oligonukleotydy zwykle maj¹ d³ugoœæ mniejsz¹ ni¿

30bp (zazwyczaj s¹ to 25-mery). Fizycznie ich rozmiar

nie przekracza zazwyczaj 10µm. Na powierzchni 2cm

2

mo¿e wiêc zmieœciæ siê do 300 000 oligonukleotydów.

U¿ytkownik ma mo¿liwoœæ wyboru miêdzy kilkunastoma

dostêpnymi zestawami genów pochodz¹cych z genomu

cz³owieka, szczura lub myszy.

Porównanie zalet i wad obu systemów przedstawio-

no w tabeli I.

Tabela I Porównanie dwóch systemów microarray’ów

cDNA microarray

Microarray oligonukleotydowy

(Gene Chip)

Zalety

• Du¿a elestycznoœæ

• Dowolne kszta³towanie EST

• Dowolne kszta³towanie EST • Wysoka specyficznoœæ
• Niezale¿noœæ od komercyj-

• Mo¿liwoœæ detekcji olbrzy-

nych Ÿróde³ sekwencji

miej iloœci genów w czasie

• Mo¿liwoœæ badania genów

jednego array’u

o nieznanej sekwencji

Wady

• Pracoch³onnoœæ (klonowanie, • Mo¿liwoœæ stosowania

sekwencjonowanie)

array’u tylko do czêœciowo

• K³opotliwe przechowywanie

(lub ca³kowicie) zsekwen-

cDNA

cjonowanych genomów

• Stosunkowo niewielka liczba • Wysoki koszt

badanych jednoczeœnie genów • Ograniczona przez dostawcê

• Brak wp³ywu na sekwencje

liczba EST

oligonukleotydów

• W¹tpliwe definicje funkcji

niektórych genów

Istniej¹ rownie¿ alternatywne technologie syntezy lub

(i) deprotekcji oligonukleotydów – deprotekcja elektrycz-

na opisana przez Southerna (US Patent 5667667, 1997),

drukowanie oligonukleotydów na ¿elach o gruboœci 20µm

i inne.

Oprócz dwóch najszerzej stosowanych technik opra-

cowano równie¿ mniej popularne systemy wytwarzania

microarray’ów, jak np. technologia mikrokuleczek, na po-

wierzchni których osadzono oligonukleotydy (Luminex),

które nastêpnie hybrydyzuje siê ze znakowanym fluore-

scencyjnie RNA i odczytuje w cytofluorymetrze przep³y-

wowym. Kanonen i wsp. [6] opracowali tak¿e system

hybryzyzacji in situ pozwalaj¹cy na jednoczesny odczyt

ekspresji do 1000 mRNA w próbce.

Uzyskiwanie cRNA i hybrydyzacja

Materia³em wyjœciowym do microarray’u s¹ zwykle

komórki pobrane od pacjenta, tkanki lub komórki hodo-

wane in vitro, tkanki lub narz¹dy zwierz¹t doœwiadczal-

nych. Czynione s¹ równie¿ próby zastosowania materia³u

biopsyjnego z biopsji cienkoig³owej i wymazów z b³on œlu-

zowych. Materia³em, który poddaje siê procedurze hy-

brydyzacji s¹ fragmenty znakowanego fluorescencyjnie

lub izotopowo cRNA. Aby z tkanki lub hodowli komórko-

wej otrzymaæ cRNA konieczne s¹ nastêpuj¹ce etapy

(przedstawione na rycinie 1):

80

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

1. Izolacja RNA

Powszechnie stosuje sie izolacjê ca³kowitego RNA

lub te¿ izolacjê poli(A) RNA, która zwykle umo¿li-

wia otrzymanie wyników lepszej jakoœci.

2. Odwrotna transkrypcja (RT)

W wyniku typowej reakcji RT otrzymuje siê dwuni-

ciowe cDNA. Reakcja ta sk³ada siê z dwóch eta-

pów – pierwotnie syntetyzowana jest pierwsza niæ

DNA na matrycy RNA, a nastêpnie niæ ta jest u¿y-

wana jako matryca do syntezy komplementarnego

DNA. W ten sposób powstaje dwuniciowy cDNA.

3. Transkrypcja in vitro (IVT reaction – in vitro trans-

cription) z towarzysz¹cym, wbudowaniem barwni-

ka fluorescencyjnego

W wyniku reakcji IVT powstaje antysensowna niæ

cRNA, na któr¹ sk³adaj¹ siê znakowane oligonukleo-

zydy. Do znakowania mo¿na stosowaæ zarówno izo-

topy promieniontwórcze, jak i biotynê.

4. Fragmentacja cRNA

Proces ten pozwala na uzyskanie fragmentów cRNA

o d³ugoœci 35-200 par zasad, które mog¹ ³¹czyæ siê

z cDNA lub oligonukleotydami.

5. Hybrydyzacja do wybranego zestawu cDNA lub oli-

gonukleotydów (ryc. 2.)

Temperatura i czas hybrydyzacji zale¿y od buforu,

w którym proces ten nastêpuje. Najczêœciej stosuje

siê zakres temperatur 45-65°C przez oko³o 16h.

Ostatnim etapem jest barwienie kompleksu cRNA –

oligonukleotydy streptawidyn¹ i fikoerytryn¹.

Szczegó³owy opis metodyki jest dostêpny w wielu

podrêcznikach microarray, nie mniej jednak nie sposób nie

poczyniæ kilku uwag dotycz¹cych powy¿szych procedur.

Zwykle podkreœla siê du¿e znaczenie wysokiej czy-

stoœci (ma³ej zawartoœci bia³ka) RNA. Wiêkszoœæ firm

produkuj¹cych microarray’e nie poleca do uzyskiwania

RNA z tkanek i komórek klasycznej metody izolacji RNA

wg Chomczyñskiego (TriReagent, Trizol, a nastêpnie wi-

rowanie w gradiencie fenol: chloroform i precypitacja

RNA izopropanolem), ze wzglêdu na ma³¹ wydajnoœæ tej

techniki oraz du¿e zanieczyszczenie produktu bia³kami

i DNA. Standardem jest izolacja zestawem RNeasy (Qu-

iagen). Iloœæ RNA niezbêdna do dalszych etapów waha

siê (w zale¿noœci od wydajnoœci RT i IVT) od 30 do 50µg.

Liczba komórek niezbêdna do uzyskania takiej iloœci RNA

jest ró¿na w zale¿noœci od tkanki i wynosi od 0,5x10

7

do

5x10

7

. Po uzyskaniu RNA konieczne jest okreœlenie jego

stê¿enia oraz przeprowadzenie elektroforezy na ¿elu 1%

agaroza/MOPS celem upewnianie siê, ¿e uzyskane RNA

nie jest zdegradowane i zawiera typowe pr¹¿ki dla rybo-

somalnego RNA.

Detekcja sygna³u w microarray’u

Powszechnie stosowanym systemem detekcji jest

odczyt fluorescencji wzbudzonej za pomoc¹ lasera przy

u¿yciu odpowiedniego systemu optycznego. Typowo kom-

pleks cRNA-matryca oligonukleotydowa jest oœwietlany

swiat³em o d³ugoœci fali 488nm (dla biotyny i barwienia

streptawidyna-fikoerytryna). Powoduje to wzbudzenie flu-

orescencji o d³ugoœci fali 570nm. Natê¿enie fluorescencji

jest proporcjonalne do liczby cz¹steczek cRNA ulegaj¹-

cych hybrydyzacji do matrycy. System komputerowy prze-

twarza te dane na odpowiedni¹ skalê kolorów. Zwykle

kolor czerwony oznacza geny, których ekspresja wzros³a

przynajmniej piêciokrotnie w stosunku do dowolnie wy-

branych genów kontrolnych (ich liczba jest ró¿na w za-

le¿noœci od eksperymentu; autorzy stosuj¹ zwykle od 4

do 80 „houskeeping genes” jako kontrolê ekspresji),

0

2 3 24

czas [h]

0

10 0

Ryc. 1. Schemat analizy ekpresji genów przy u¿yciu microarray’u

Komórki lub tkanki pobrane od pacjenta

Komórki lub tkanki w hodowli in vitro

Wzglêdny

poziom

ekspresji

ca³kowite RNA lub poli(A) RNA

cDNA

antysensowne znakowane

cRNA

Kompleks cRNA-cDNA (lub

oligonukleotyd)

Izolacja ca³kowitego RNA

lub poli(A) RNA

Odwrotna transkrypcja

Transkrypcja in vitro (IVT) oraz

znakowanie fluorochromem

Hybrydyzacja

Barwienie i odczyt

Analiza wyników

Ryc 2. Uproszczony schemat hybrydyzacji w microarray’u oli-

gonukleotydowym

C
U
G
G
C
U
U
A
C
G
A
A
U
C
C
A

C
G
G
G
C
U
U
G
C
U
A
A
U
C
G
U

C
C
G
G
C
G
U
U
G
G
A
A
U
C
U
G

U
G
C
U
A
C
G
A
A
U
C
A
G
U
G
U

U
G
A
C
C
G
A
A
U
G
C
U
U
A
G
G

C
G
G
C
C
G
C
A
A
C
C
U
U
A
G
A

Plastikowa p

³ytka matrycy

UGCUACGAA –

fragment oligonukleotydu stanow i

¹cego matrycê

UGACCGAAU

–

fragment cRNA ulegaj

¹cego hybrydyzacji do matrycy oligonukleotydowej

–

znacznik fluorescencyjny

81

Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metod¹ microarray . . .

kolorem niebieskim oznacza siê zazwyczaj geny, których

ekspresja jest na poziomie kontroli.

Systemy analizy i obróbki danych otrzymywanych

przy u¿yciu microarray’u

Typowy, pojedynczy eksperyment, sk³adaj¹cy siê na-

wet z jednego punktu czasowego tworzy zbiór danych

zawieraj¹cy co najmniej kilka tysiêcy punktów. Stwarza

to powa¿ny problem techniczny zarówno dla gromadze-

nia danych, jak i dla ich analizy. Dane z odczytu groma-

dzone s¹ zwykle na dyskach CD-RW.

Istnieje kilka programów komputerowych, s³u¿¹cych

do analizowania danych uzyskanych z microarray’u. Jed-

nym z najpopularniejszych jest GeneSpring firmy Silicon

Genetics.
Analiza typowego eksperymentu sk³ada sie z kilku etapów:

1. instalacji nowego genomu (czyli zestawu informacji

pozwalaj¹cych na identyfikacjê poszczególnych ge-

nów i EST). Zwykle genom dostarczany jest przez

producenta oprogramowania i na bie¿¹co aktualizo-

wany przez internet z tak¹ sam¹ czestotliwoœci¹ jak

modyfikacji ulegaj¹ array’e.

2. budowy nowego eksperymentu – czyli pobrania przez

program grupy plików uzykanych ze skanera,

uwzglêdnienia punktów czasowych lub nazw stymu-

latorów, wybrania zakresu wzglêdnej i bezwglêdnej

ekspresji sygna³u. Zwykle istnieje równie¿ mo¿liwoœæ

przygotowania nowego eksperymentu korzystaj¹c

z nowych danych, lecz pos³uguj¹c siê poprzednio u¿y-

wanym algorytmem, wprowadzaj¹c (lub nie) koniecz-

ne modyfikacje.

3. standaryzacji ekspresji genów (zwykle program anali-

zy danych pozwala na standaryzacjê wyników w sto-

sunku do ekperymentu kontrolnego (np. RNA uzyka-

nego z niestymulowanych komórek) lub do ekspresji

okreœlonego (dowolnie wybranego przez u¿ytkownika

genu lub nawet kilkudziesiêciu genów). Standaryzacja

umo¿liwia przypisanie genowi lub genom ekspresji rów-

nej dowolnej liczbie, zwykle jest to zero lub 9,95.

4. analizy eksperymentu, na któr¹ sk³ada siê zwykle:

– wybranie listy interesuj¹cych badacza genów po-

s³uguj¹c siê odpowiednimi kryteriami np. piêcio-

krotn¹ zmian¹ ekspresji w stosunku do kontroli,

– przygotowanie graficznej ekspresji pseudogenu,

a nastêpnie znalezieniem wszystkich genów o po-

dobnym wzorze ekspresji,

– przeszukanie bazy danych pos³uguj¹c siê nazw¹

genu, skrótem lub numerem dostêpu do GeneBan-

ku, a nastêpnie wyszukanie genu lub genów cha-

rakteryzuj¹ch siê podobn¹ ekspresj¹.

5. analiza statystyczna. Zwykle stosowany jest test

t-Studenta lub jego modyfikacje.

Koñcowe wyniki eksperymentu s¹ zwykle przedsta-

wiane za pomoc¹ szeregu wykresów i diagramów oraz den-

drogramów popartych wynikami analizy statystycznej.

Zastosowanie technologii microarray

Z chwil¹ opracowania technologii RT-PCR badacze

zaczêli odpowiadaæ na coraz bardziej z³o¿one pytania doty-

cz¹ce ekspresji genów pod wp³ywem ró¿norodnych czyn-

ników, zarówno endogennych (cytokin, hormonów, pozio-

mu jonów, cz¹steczek adhezyjnych, niedokrwienia, niedo-

tlenienia), jak i egzogennych (stres, promieniowanie). Wspó-

³czesna technologia umo¿liwia³a jednak jednoczesne bada-

nie ekspresji nie wiêcej ni¿ 8-10 genów w jednym mRNA.

Differential display mia³ umo¿liwiæ badanie ekspresji kil-

kunastu - kilkudziesiêciu genów w jednej próbce. Okaza³

siê jednak technik¹ niezwykle pracoch³onn¹, a przy tym

obarczon¹ stosunkowo du¿¹ zmiennoœci¹, niejednokrotnie

uniemo¿liwiaj¹c¹ prawid³ow¹ interpretacjê wyników eks-

perymentu. Dopiero jednoczesny postêp techniki syntezy

oligonukleotydów (a w³aœciwie jej miniaturyzacja) oraz po-

prawienie wydajnoœci klonowania genów, wraz z powszech-

n¹ dostêpnoœci¹ stosunkowo wydajnych systemów kom-

puterowych, umo¿liwi³y opracowanie i czêœciowe wdro¿e-

nie technologii microarray. Nale¿y podkresliæ, ¿e jednocze-

sna analiza wielu genów jest mo¿liwa nie tylko przy u¿yciu

tego systemu. DoϾ powszechnie w dalszym ciagu stosuje

siê Northern-Blotting (który pozostaje „z³otym standardem”

w naukach podstawowych), wielogenowy RT-PCR (mul-

tiplex RT-PCR), czy jego zmodyfikowan¹ wersjê znan¹ jako

RAGE (Rapid Gene Expression) [7]. Wspó³czeœnie sto-

suje siê równie¿ wielogenowy RT-PCR w technologii Ta-

qMan opracowny przez firmê Perkin Elmer. Wydaje siê

jednak, ¿e mimo stosunkowo wysokich kosztów oraz skom-

plikowanej i d³ugotrwa³ej obróbki danych uzyskanych w tej

technologii, microarray zrewolucjonizuje zarówno techno-

logiê badania ekspresji genów, jak i sposób analizy wyni-

ków i zapewne umo¿liwi lepsze poznanie szlaków metabo-

licznych, powi¹zañ miêdzy genami oraz czynników wp³y-

waj¹cych na ich ekspresjê. Wybrane zastosowania micro-

array’u przedstawiono w tabeli II.

Dotychczas opublikowane prace, wykorzystuj¹ce

technikê jednoczesnego badania ekspresji wielu genów,

mo¿na podzieliæ na kilka grup:

- badanie wp³ywu egzogennych lub endogennych czyn-

ników na ekspresjê genów u pacjentów, w liniach ko-

mórkowych lub ca³ych organizmach (Saccharomyces

cerevisiae) [8,9,10];

- poszukiwanie powi¹zañ pomiêdzy genami ulegaj¹cy-

mi ekspresji w okreœlonych warunkach (struktura pro-

motorów, rozmieszczenie sekwencji wi¹¿¹cych czyn-

niki transkrypcyjne, dystans pomiêdzy nimi, odleg³oœæ

od miejsca rozpoczêcia transkrypcji, badanie alterna-

tywnych promotorów i dodatkowych ORF) [11];

- identyfikacja genów koduj¹cych ekspresjê bia³ek cy-

toplazmatycznych, b³onowych i j¹drowych [12];

- badanie ekspresji genów w nowotworach (ró¿nice

w ekspresji pomiêdzy tkank¹ zdrow¹, stanem przed-

rakowym oraz zmian¹ nowotworow¹). Badanie ró¿nic

w ekspresji genów w zale¿noœci od typu histologicz-

nego nowotworu [13,14,15].

82

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

W dalszej czêœci pracy zostanie omówionych kilka

istotnych historycznie lub wa¿nych naukowo oryginalnych

prac z tego zakresu.

Analiza ekspresji genów w reumatoidalym zapale-

niu stawów

Jedn¹ z najwczeœniejszych prac, wykorzystuj¹cych

microarray by³a publikacja Heller i wsp. [16] badaj¹ca

ekspresjê ponad 1000 genów w tkance maziówki pocho-

dz¹cej od pacjentów w póŸnym stadium reumatoidalnego

zapalenia stawów. Autorzy wykorzystali technologiê

cDNA array’u. Tkanka maziówki wykazywa³a w wa-

runkach spoczynkowych stosunkowo nisk¹ ekspresjê

c-jun, GCSF, IL-3, TNF-β, MIF oraz RANTES. Podob-

nie ekspresja MMPs, GelA, Strom-1, Col-1 oraz TIMPS

by³a niska. Nastêpnie pobran¹ od pacjentów maziówkê

hodowano in vitro poddaj¹c stymulacji PMA, IL-1, lub

TNF-α. Stymulacja ta powodowa³a dramatyczny wzrost

ekspresji IL-6, IL-8, GRO-1α, VCAM-1 oraz Strom-1,

Col-1, Col-3 i HME. Podobny profil ekspresji wykazywa-

³y równie¿ chondrocyty pobrane od pacjentów z reuma-

toidalnym zapaleniem stawów. Praca ta potwierdza fun-

damentaln¹ rolê TNF-α w rozwoju reumatoidalnego za-

palenia stawów. Wzrost ekspresji tego genu wyprzedza³

znacz¹co ekspresjê IL-1α, IL-1β oraz IL-6 i GCSF, wska-

zuj¹c na kolejnoœæ aktywacji scie¿ki cytokinowej w tej

jednostce nozologicznej. Jednoczeœnie autorzy wykazali

znacz¹c¹ przydatnoœæ microarrayu do analizy nastêpstwa

zdarzeñ w przebiegu zapalenia. Wiêkszoœæ genów opisy-

wanych przez autorów jest powszechnie znana jako me-

diatory procesu zapalnego. Dotychczas jednak niejasna

by³a kolejnoœæ wzrostu ich ekspresji. Po raz pierwszy na-

tomiast opisano wzrost ekspresji IL-3, HME, enzymu kon-

wertuj¹cego IL-1, oraz GRO-α w reumatoidalnym zapa-

leniu stawów. Interleukina 3 zwykle jest wytwarzana przez

aktywowane limfocyty T i fakt jej produkcji przez syno-

wiocyty i chondrocyty jest ca³kowicie now¹ obserwacj¹.

Szczególnie interesuj¹cy wydaje siê fakt, ¿e HME jest

jednym z bia³ek bêd¹cych celem terapii w reumatoidal-

nym zapaleniu stawów. Enzym konwertuj¹cy IL-1 jest pro-

teaz¹ cysteinow¹, która spe³nia istotn¹ rolê w indukcji apop-

tozy. Autorzy przedstawili równie¿ analizê porównawcz¹

ekspresji genów w tkankach objêtych procesem zapalnym

w dwóch chorobach – reumatoidalnym zapaleniu stawów

oraz chorobie Crohna, wykazuj¹c zbli¿ony stopieñ ekspre-

sji IL-3, chemokiny GRO-α oraz metalo-elastaz.

Ró¿nice ekspresji genów w tkance zdrowej i ulega-

j¹cej transformacji nowotworowej

cDNA microarray umo¿liwia precyzyjne grupowanie

genów wed³ug szeregu kryteriów tworz¹cych patern eks-

presji zwany klasterem [17]. Perou i wsp. [18] zastoso-

wali powy¿sz¹ technikê analizy ekspresji genów do po-

równania profilu ekspresji genów w normalnym nab³onku

przewodowym sutka oraz w tkance pobranej od pacjen-

tek z nowotworem tego gruczo³u. Autorzy stwierdzili ist-

nienie podobnych profilów ekspresji genów w liniach ko-

mórkowych podczas zahamowania wzrostu pod wp³ywem

osiagniêcia zlewnoœci (zjawisko zahamowania kontakto-

wego), jak w tkance nowotworowej inkubowanej w obec-

noœci TGF-β1, IFN-γ, α oraz po inkubacji w medium po-

zbawionym obecnoœci EGF (Epidermal Growth Factor).

Szczególnie uderzaj¹cy jest wzrost ekspresji zale¿nych od

interferonów genów, takich jak: 2’-5’ syntaza oligoadeny-

lowa E, bia³ko 17kD stymulowane IFN czy STAT1. Induk-

cja powy¿szych genów zachodzi w wyniku aktywacji scie¿ki

JAK/STAT. Praca ta potwierdza potencjalne mo¿liwoœci

zastosowania TGF-β1, IFN-γ oraz interferonów w terapii

raka sutka. Wydaje siê równie¿, ¿e zastosowanie antago-

nistów EGF mo¿e przynieœæ istotny postêp terapeutyczny

w leczeniu tego nowotworu.

Badaniem ró¿nic w ekspresji genów pomiêdzy tkan-

k¹ zdrow¹ a komórkami nowotworu wywodz¹cego siê

z tej tkanki zajmowa³a siê równie¿ grupa Laeikauf’a, któ-

ra opublikowa³a w tym roku pracê porównuj¹c¹ ekspre-

sjê genów w miêdzyb³oniaku oraz zdrowych komórkach

nab³onka op³ucnej [19]. Autorzy wyró¿nili prawie trzysta

genów (spoœród ponad 6500 badanych przy u¿yciu cDNA

microarrayu), których ekspresja by³a ró¿na w komórkach

tkanki zdrowej i miêdzyb³oniaku op³ucnej. Wspomniane

300 genów podzielono na cztery grupy w zale¿noœci od

spe³nianej funkcji. Pierwsza, wyró¿niona przez autorów

grupa, to geny odpowiedzialne za metabolizm wewn¹trz-

komórkowy i stabilizacjê DNA i mRNA. Komórki miê-

dzyb³oniaka wykazywa³y ponad dwukrotnie zwiêkszon¹

ekspresjê syntetaz aminoacylo-tRNA, oraz innych bia³ek

odpowiedzialnych zarówno za transport j¹drowy, jak

Tabela II. Obecne i potencjalne zastosowania microarray’u

Zastosowanie microarray’u

Przyk³ad praktycznego

do badania ekspresji genów

zastosowania

Badanie ekspresji genów

Poszukiwanie skutecznych

na poszczególnych etapach

leków przeciwmalarycznych

rozwojowych drobnoustrojów
Wp³yw czynników fizycznych Rola bia³ek naprawczych

na ekspresjê genów

w odbudowie uszkodzeñ

DNA wywo³anych promie-

nowaniem jonizuj¹cym

Ró¿nicowanie ekspresji genów Analiza patogenezy nowo-

w tkankach zdrowych

tworów. Nowe leki przeciw-

i zmienionych nowotworowo

nowotworowe

Zapalenie alergiczne

Rola glikokorykosteroidów

w modyfikowaniu ekspresji

genów w nab³onku oskrzeli

Mukowiscydoza

Badanie potencjalnych

mo¿liwoœci terapeutycznych

nowych leków i wp³ywu

terapii genowej

83

Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metod¹ microarray . . .

i wewn¹trz siateczki endoplazmatycznej (np. karioptery-

na β-1, translokaza preprotein). Natomiast geny koduj¹-

ce bia³ka odpowiedzialne za hydrolizê protein (proteaza

serynowa 11, a tak¿e katepsyna H) wykazywa³y ponad

trzykrotnie zmniejszon¹ ekspresjê. Komórki miêdzyb³o-

niaka wykazywa³y równie¿ zwiêkszon¹ ekspresjê genów

odpowiedzialnych za stabilizacjê mRNA (ponad cztero-

krotnie zwiêkszona ekspresja inhibitora rybonukleaz L)

oraz zmniejszon¹ ekspresjê genów koduj¹cych enzymy

odpowiedzialne za degradacjê kwasów nukleinowych (np.

rybonukleazy 4). Autorzy obserwowali równie¿ zwiêk-

szon¹ ekspresjê genów koduj¹cych enzymy metabolizu-

j¹ce lipidy oraz wp³ywaj¹ce na ró¿nicowanie siê keraty-

nocytów. Podobne wyniki otrzymali Khan i wsp. [13] ba-

daj¹c ekspresjê genów odpowiadaj¹cych za nowotworze-

nie w miêsaku pêcherzykowym. Druga badana przez au-

torów grupa genów odpowiada za procesy adhezji i ko-

munikacji wewn¹trzkomórkowej. Komórki mesothelio-

ma wykazywa³y zwiêkszon¹ ekspresjê integryn (α3, α4,

α6, a tak¿e β-1). Powy¿sze cz¹steczki adhezyjne spe-

³niaj¹ istotn¹ rolê w rozwoju nowotworu zwiêkszaj¹c jego

zdolnoœæ do nowotworzenia naczyñ. Zwiêkszona ponad

trzykrotnie ekspresja CD59 oraz zmniejszona (2,3 raza)

ekspresja MIF wskazuje, ¿e bia³ka te dzia³aj¹ lokalnie prze-

ciwzapalnie umo¿liwiaj¹c ekspansjê komórek nowotwo-

rowych. Miêdzyb³oniak, w przeciwieñstwie do innych no-

wotworów p³uc, rzadko daje przerzuty. Przyczyn¹ tego

zjawiska jest ponad trzydziestokrotnie zwiêkszona ekspre-

sja PAI-2 – genu, który równie¿ zwi¹zany jest z nisk¹ in-

wazyjnoœci¹ niedrobnokomórkowych nowotworów oskrzeli.

Innym genem, prawdopodobnie odpowiedzialnym za ma³¹

inwazyjnoœæ miêdzyb³oniaka, jest trombospodyna 1. Oba

geny zosta³y przez badaczy zaliczone do grupy genów od-

powiadaj¹cych za inwazyjnoœæ nowotworów. Kolejn¹

wyró¿nion¹ grup¹ genów s¹ geny maj¹ce bezpoœredni

wp³yw na rozmna¿anie siê i wzrost komórek. Do grupy

tej nale¿a³y g³ównie proto-onkogeny Ki-ras, c-myc, oraz

bia³ko wi¹¿¹ce c-myc. Podobnie ekspresja podstawowe-

go czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) oraz kinazy in-

dukowalnej surowic¹ by³y znacz¹co zwiêkszone w ko-

mórkach miêdzyb³oniaka.

Miêdzyb³oniak op³ucnej jest nowotworem znanym z ol-

brzymiej opornoœci na chemioterapiê, niemniej jednak

molekularne mechanizmy tego zjawiska nie by³y dotych-

czas jasne. Rihn i wsp. wyró¿nili wœród badanych genów

grupê opornoœci na ksenobiotyki. Zaliczono do niej 4 geny

koduj¹ce S-transferazê glutationu, 9 genów koduj¹cych

grupê cytochromu P450 oraz geny o aktywnoœci detok-

sykacyjnej: hydrolazê epoksydow¹ 2 i DPYD – bior¹ce

udzia³ w detoksykacji 5-FU. Autorzy stwierdzili równie¿

zwiêszon¹ ekspresjê genów istotnych w odpowiedzi na

wolne rodniki (m.in. dysmutaza ponadtlenkowa Cu/Zn, an-

neksyna I). Praca ta wskazuje na zasadnicze ró¿nice po-

miêdzy ekspresj¹ genów w tkance nowotworowej i zdro-

wej. Nie odpowiada co prawda na podstawowe pytanie

– które z nich s¹ bezpoœrednio odpowiedzialne za trans-

formacjê nowotwor¹, wskazuje jednak na te z nich, które

umo¿liwiaj¹ ekspansjê oraz zapobiegaj¹ niszczeniu komó-

rek nowotworu przez cytostatyki. Wykrycie grup genów

odpowiedzialnych za opornoœæ na chemioterapiê umo¿li-

wia poszukiwanie i badanie skutecznoœci nowych leków

przeciwnowotworowych. Jest to ca³kowicie nowe zasto-

sowanie tej technologii [20,21].

Microarray zosta³ równie¿ zastosowany do analizy

wp³ywu cytostatyków na wzrost linii komórkowych wy-

wodz¹cych siê z nowotworów. Scherf i wsp. [22] pos³u-

guj¹c siê grup¹ danych uzyskanych z 60 linii nowotworo-

wych, wykorzystywanych przez National Cancer Insti-

tute przeanalizowali wp³yw typowych leków przeciwno-

wotworowych na ekspresjê markerów wzrostu komórek

na poziomie RNA. Wœród 60 linii nowotworowych znala-

zly siê zarówno raki nerki, jajników, prostaty, p³uc, jak i linie

bia³aczkowe, ch³oniaki czy czerniak. Autorzy wykonali

analizê ekspresji genów dla ponad 70 000 zwi¹ków che-

micznych o udowodnionym lub potencjalnym dzia³aniu

przeciwnowotworowym. Praca ta umo¿liwi³a pogrupowa-

nie nowotworów oraz leków (zarówno wspó³czeœnie sto-

sowanych w terapii przeciwnowotworowej, jak i poten-

cjalnie mo¿liwych do zastosowania) w zale¿noœci od sku-

tecznoœci hamowania wzrostu linii nowotworowej oraz

wzajemnych interakcji lekowych. Autorzy przyznaj¹, ¿e

nie s¹ wspó³czeœnie w stanie przeanalizowaæ wszystkich

uzyskanych danych koncentruj¹c siê zaledwie na kilku

substancjach biologicznie czynnych. W ten sposób auto-

rzy stwierdzili istnienie ujemnej korelacji pomiêdzy eks-

presj¹ DPYD (genu koduj¹cego dehydrogenazê dyhydro-

pirymidyny) a skutecznoœci¹ 5-fluorouracylu (5-FU) w le-

czeniu nowotworów, których komórki wykazuj¹ ekspre-

sjê DPYD. 5-fluorouracyl okaza³ siê lekiem skutecznym

w terapii nowotworów, których komórki wykazywa³y ni-

sk¹ lub nieobecn¹ ekspresjê DPYD. Wysoka ekspresja

DPYD umo¿liwia komórkom nowotworu obni¿enie eks-

pozycji na aktywn¹, ufosforylowan¹ formê 5-FU. Do-

œwiadczenie to wskazuje na nowe, choæ ci¹gle potencjal-

ne, zastowanie 5-FU w leczeniu nowotworów innych, ni¿

rak okrê¿nicy czy niektóre postacie raka sutka, w któ-

rych to chorobach jest on stosowany wspó³czeœnie. Au-

torzy wykazali równie¿ bardzo wysok¹ skutecznoœæ

L-asparaginazy w stosunku do linii nowotworowych po-

chodz¹cych z komórek ostrej bia³aczki limfatycznej. Cie-

kawe wydaje siê równie¿ bardzo wysoka skutecznoœæ tego

leku wobec linii komórkowej wywodz¹cej siê z raka jajni-

ka. Dwa opisane powy¿ej przyk³ady wskazuj¹ na szero-

kie mo¿liwoœci zastosowania technologii microarray’u

w badaniu skutecznoœci leków przeciwnowotworowych

w zale¿noœci od histologicznego typu nowotworu, a tak¿e

umo¿liwiaj¹ potencjalny dobór leku w zale¿noœci od spe-

cyficznych, indywidualnych dla pacjenta w³aœciwoœci ko-

mórek nowotworowych. cDNA microarray umo¿liwia

zarówno szybk¹ jak i mo¿liwie pe³n¹ analizê wp³ywu prak-

84

Alergia Astma Immunologia, 2001, 6(2), 77-85

tycznie dowolnie szerokiego panelu substancji biologicz-

nie czynnych na ekpresjê wielu tysiêcy genów w komór-

kach nowotworowych. Systemy microarray’u s¹ aktual-

nie szeroko wykorzystywane przez firmy farmaceutycz-

ne w testowaniu zarchizowanych substancji o potencjal-

nym dzia³aniu przeciwnowotoworowym [23].

Zastosowanie microarray’u w mukowiscydozie

Wspó³czesna genetyka molekularna specjalizuje siê

w poszukiwaniu zwi¹zków pomiêdzy fenotypem a okreœ-

lon¹ mutacja (lub polimorfizmem) [24]. Rzadko jednak

jesteœmy w stanie ustaliæ mikromolekularne konsekwen-

cje zmiany genotypu, wyra¿aj¹ce siê zmian¹ ekspresji ge-

nów. Nie jesteœmy równie¿ w stanie przewidzieæ skutków

terapii genowej na poziomie mRNA. Mukowiscydoza by³a

jedn¹ z pierwszych chorób, w których zastosowano tera-

piê genow¹. Jest ona zwykle zwi¹zana z obecnoœci¹ mu-

tacji ∆F508 genu CFTR. Powy¿sza mutacja zaburza trans-

port bia³ka CFTR z siateczki œródplazmatycznej do b³ony

komórkowej. Uniemo¿liwia to prawid³ow¹ regulacjê elek-

trolitow¹ zale¿n¹ od cAMP przy u¿yciu kana³u chlorko-

wego. Srivastava i wsp. [25] badali ró¿nice w ekspresji

genów w komórkach transfekowanych plazmidem zawie-

raj¹cym gen CFTR lub jego mutacjê ∆F508. Mutacja

∆F508 powodowa³a istotn¹ zmianê ekspresji 26 genów,

co ciekawe by³y to g³ównie bia³ka wi¹¿¹ce DNA (NF-

E1, DB1, ard-1). Nastêpnie autorzy inkubowali obie linie

komórkowe w obecnoœci CPX (lek bêd¹cy w tracie ba-

dañ klinicznych w mukowiscydozie). Lek ten nale¿y do

grupy ksantyn. Zmutowane bia³ko CFTR charakteryzuje

siê zaburzon¹ strukturê trzeciorzêdow¹. CPX wi¹¿e siê

ze zmutowanym bia³kiem ∆F508-CFTR, co powoduje

zmianê jego struktury przestrzennej i umo¿liwia prawid³o-

wy transport z siateczki endoplazmatycznej do b³ony ko-

mórkowej [26]. CPX posiada równie¿ w³aœciwoœci akty-

wuj¹ce ∆F508-CFTR. CPX jest równie¿ agonist¹ recep-

tora adenozynowego, co potencjalnie mo¿e wp³ywaæ na

ekspresjê wielu genów. Inkubacja CPX z komórkami

transfekowanymi wariantami genu CFTR pozwoli³a na

wykrycie 69 genów, których ekspresja wzrasta³a znacz¹-

co w komórkach transfekowanych ∆F508-CFTR. Wiêk-

szoœæ z nich nie by³a dotychczas kojarzona z mukowiscy-

doz¹. Czêœæ z nich, jak MUC18, IL-10, PKA wydaje siê

spe³niaæ istotn¹ rolê w przebiegu choroby.

Microarray a proces zapalny w komórkach nab³onka

Glikokortykosteroidy s¹ podstawowym lekiem prze-

ciwzapalnym stosowanym w chorobach alergicznych.

Dotychczas nie jest jasny profil ekspresji genów, na który

wp³ywaj¹. Niepublikowane badania prowadzone w Cri-

tical Care Medicine Department (National Institutes

of Health) (Pawliczak i wsp. [28]) wskazuj¹, ¿e stosunko-

wo niewielkie ste¿enie glikokorykosteroidów (10

-9

M) po-

woduje istotne zmiany ekspresji genów w nab³onku oskrzeli,

indukuj¹c wczesny i znacz¹cy wzrost ekspresji receptora

beta2-adrenergicznego, IL-10 oraz β podjednostki jej re-

ceptora, a tak¿e TGF-beta 2. Grupa genów charakteryzu-

j¹cych siê póŸnym wzrostem ekspresji to anneksyna II i in-

hibitor proteaz 1. Wyró¿niono równie¿ grupê genów, któ-

rych ekspresja zmniejsza³a siê dramatycznie ju¿ po dwóch

godzinach inkubacji z deksametazonem – by³y to IL-12β,

IL-18, VCAM-1, TGF-β 3 oraz CCR3. Dane te wskazu-

j¹, ¿e ju¿ stosunkowo niskie stê¿enie glikokortykostero-

idów wykazuje silne miejscowe dzia³anie przeciwzapalne

w komórkach nab³onka oskrzeli.

Podsumowanie

Microarray sta³ siê w ci¹gu ostatnich kilku lat techno-

logi¹ pozwalaj¹c¹ badaæ ekspresjê nie tylko grup poje-

dynczych genów, ale wrêcz ca³ego genomu. Kolejne pra-

ce powstaj¹ce w tej technologii przynosz¹ coraz lepsze

i pe³niejsze zrozumienie szlaków metabolicznych, procesów

nowotworzenia, odpowiedzi immunologicznej czy kontroli

procesu zapalnego. Co wiêcej, wraz z rozwojem badania

ekspresji RNA pojawiaj¹ siê DNA microarray’e badaj¹ce

strukturê genomu i jego polimorfizm oraz pierwsze

microarray’e badaj¹ce ekspresjê bia³ka [27]. Coraz do-

skonalsze techniki ekperymentalne stanowi¹ jednak nie-

spe³nione wyzwanie dla systemów analizy danych. Uzy-

skujemy z nich informacje, których, w chwili obecnej, nie

jesteœmy w stanie w pe³ni wykorzystaæ. Pojawiaj¹ siê tak¿e

wtórne prace, wykorzystuj¹ce powszechnie dostêpne, pu-

bliczne dane uzyskane z microarray’u. W tabeli III przed-

stawiono krótk¹ listê stron internetowych dotycz¹cych mi-

croarray’u. Lista ta zawiera adresy zarówno firm, labora-

toriów, a tak¿e naukowców zajmuj¹cych siê t¹ tematyk¹.

Tabela III. Strony internetowe dotycz¹ce microarray’u

www.affymetrix.com
cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html
http://www.nhgri.nih.gov/DIR/LCG/15K/HTML/
Chroma.mbt.washington.edu/mod_www/
www.genomicsolutions.com
http://www.genescan.com/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/
www.tigr.org
www.biorobotics.co.uk
cmgm.stanford.edu/~kimlab/wmdirectorybig.html

Najbli¿sze miesi¹ce i lata powinny przynieœæ zarówno

zwiêkszenie liczby genów dostêpnych w microarray’u, chi-

py dla nowych mikroorganizmów oraz coraz doskonalsze

systemy analizy danych.

85

Pawliczak R., Kowalski M.L. Badanie ekspresji genów metod¹ microarray . . .

1. Augenlicht LH, Wahrman MZ, Halsey H i wsp. Expression of

cloned sequences in biopsies of human colonic tissue and in

colonic carcinoma cells induced to differentiate in vitro. Cancer

Res 1987; 47: 6017-6021.

2. Augenlicht LH, Taylor J, Anderson L i wsp. Patterns of gene

expression that characterize the colonic mucosa in patients at

genetic risk for colonic cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:

3286-3289.

3. Schena M, Heller RA, Theriault TP i wsp. Microarrays:

biotechnology’s discovery platform for functional genomics.

Trends Biotechnol 1998; 16: 301-306.

4. Bowtell DD. Options available—from start to finish—for obtaining

expression data by microarray. Nat Genet 1999; 21: 25-32.

5. Iyer VR, Eisen MB, Ross DT i wsp. The transcriptional program

in the response of human fibroblasts to serum. Science 1999;

283: 83-87.

6. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A i wsp. Tissue

microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor

specimens. Nat Med 1998; 4: 844-847.

7. Wang A, Pierce A, Judson-Kremer K i wsp. Rapid analysis of

gene expression (RAGE) facilitates universal expression profiling.

Nucleic Acids Res 1999; 27: 4609-4618.

8. Amundson SA, Do KT, Shahab S i wsp. Identification of potential

mRNA biomarkers in peripheral blood lymphocytes for human

exposure to ionizing radiation. Radiat Res 2000; 154: 342-346.

9. Holden PR, James NH, Brooks AN i wsp. Identification of a

possible association between carbon tetrachloride-induced

hepatotoxicity and interleukin-8 expression. J Biochem Mol

Toxicol 2000; 14: 283-290.

10. Koenen M, Scherf A, Mercereau O i wsp. Human antisera detect

a Plasmodium falciparum genomic clone encoding a nonapeptide

repeat. Nature 1984; 311: 382-385.

11. Heerdt BG, Che, Stewart LR i wsp. Polymorphisms, but lack of

mutations or instability, in the promotor region of the

mitochondrial genome in human colonic tumors. Cancer Res 1994;

54: 3912-3915.

12. Diehn M, Eisen MB, Botstein D i wsp. Large-scale identification

of secreted and membrane associated gene products using DNA

microarrays. Nat Genet 2000; 25: 58-62.

13. Khan J, Simon R, Bittner M i wsp. Gene expression profiling of

alveolar rhabdomyosarcoma with cDNA microarrays. Cancer

Res 1998; 58: 5009-5013.

14. Howell SB. DNA Microarrays for Analysis of Gene Expression.

Mol Urol 1999; 3: 295-300.

15. Khan J, Saal LH, Bittner ML i wsp. Expression profiling in cancer

using cDNA microarrays. Electrophoresis 1999; 20: 223-229.

16. Heller RA, Schena M, Chai A i wsp. Discovery and analysis of

inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays.

Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 2150-2155.

17. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO i wsp. Cluster analysis and

display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci

USA 1998; 95: 14863-14868.

18. Perou CM, Jeffrey SS, van de Rijn M i wsp. Distinctive gene

expression patterns in human mammary epithelial cells and breast

cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 9212-9217.

19. Rihn BH, Mohr S, McDowell SA i wsp. Differential gene

expression in mesothelioma. FEBS Lett 2000; 480: 95-100.

20. Cole KA, Krizman DB, Emmert-Buck MR. The genetics of

cancer—a 3D model. Nat Genet 1999; 21: 38-41.

21. Kennedy GC. The impact of genomics on therapeutic drug

development [In Process Citation]. EXS 2000; 89: 1-10.

22. Scherf U, Ross DT, Waltham M i wsp. A gene expression

database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet

2000; 24: 236-244.

23. Debouck C, Goodfellow PN. DNA microarrays in drug discovery

and development. Nat Genet 1999; 21: 48-50.

24. Califano A, Stolovitzky G, Tu Y. Analysis of gene expression

microarrays for phenotype classification. ISMB 2000; 8 75-85.

25. Srivastava M, Eidelman O, Pollard HB. Pharmacogenomics of

the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)

and the cystic fibrosis drug CPX using genome microarray

analysis. Mol Med 1999; 5: 753-767.

26. Pollard HB. Role of CPX in promoting trafficking and chloride

channel activity of wildtype and mutant CFTR. Pediatr Pulmonol

1997; S14: 128-131.

27. Lueking A, Horn M, Eickhoff H i wsp. Protein microarrays for

gene expression and antibody screening. Anal Biochem 1999;

270: 103-111.

28. Pawliczak R, Logun C, Danner R, Shelhamer J. Gene expression

in human airway cells after dexamethasone treatment. J Allergy

Clin Immunol 2001; 107(suppl.1): 108.

Piœmiennictwo