Techniki są jasne do państwa? 

Jeżeli ktoś czegoś nie rozumie to zapraszam do zadawania pytań, jeżeli nie to przejdziemy do 

innych problemów i innych metod analizy produktów ekspresji genów, bo o tym mówimy.

Taką grupę metod stanowią metody w których wykorzystujemy mutacje, a wiec kilka słów na 

temat mutagenezy. Mutageneza czy też mutacje, są czymś naturalnym. Wszyscy jak tu 

siedzimy, jesteśmy podlegamy temu zjawisku. Mutacje zachodzą cały czas w organizmach 

żywych, jest to proces indukowany przez różne czynniki też spontaniczne wynikające ze 

niedokładności na przykład procesu replikacji DNA, z transkrypcji też i oczywiście te mutacje 

spontaniczne są naprawiane w różnym zakresie ale oczywiście też nie są i to może prowadzić 

do zmian nowotworowych i innych problemów. Czyli jedna grupa mutacji są to mutacje 

spontaniczne i takie też często są wykorzystywane w laboratorium, do badania w genetyce 

szczególnie ale są też takie mutacje, które są indukowane specjalnie w laboratorium. Na 

przykład jeżeli jakiś organizm jest naświetlany promieniowaniem wysoko energetycznym 

częstość mutacji wzrasta i takie postępowania stosowano i stosuje się bardzo często po to aby 

wygenerować mutanty jakieś interesujące. Z kolei te mutacje czy ta mutageneza jest określana 

mianem mutagenezy nieukierunkowanej. Natomiast w laboratorium inżynierii genetycznej 

inżynierii białka albo (…) molekularnej metody inżynierii genetycznej po prostu są 

narzędziem. Najczęściej wprowadzamy mutacje ukierunkowane, zdefiniowane. Technika ta 

nosi nazwę (site directed mutagenesis)  mutageneza ukierunkowana. Opisowo możemy 

powiedzieć ze wprowadzamy mutacje tam gdzie chcemy czyli tak jak to jest na naszej 

ilustracji:

W sekwencji kodującej zamieniamy wybraną resztę i wprowadzamy te zmianę kodonu, istotą 

techniki mutagenezy czy też eksperymentu, w którym wykorzystuje się mutagenezę 

ukierunkowaną jest po pierwsze wprowadzenie mutacji a po drugie obserwowanie zmiany 

jaką ta mutacja wprowadza. Tak jak poprzednio mówiłem to jest możliwe tylko wtedy jeżeli 

mamy określony jakiś układ odniesienia, jeżeli możemy porównać do czegoś właściwości tak 

zmienionego produktu. Zatem w eksperymencie mutagenezy po pierwsze wprowadzamy 

mutację, zamienimy sekwencje kodującą w jakimś tam zakresie, to wprowadza mutację w 

białku, na przykładzie izoleucyna została zamieniona na leucynę i otrzymujemy produkt 

białkowy o określonych właściwościach. Ale te właściwości są dla nas istotne tylko wtedy 

gdy porównamy je z właściwościami białka typu dzikiego. Także każdy eksperyment 

mutagenezy polega na, że mamy produkt zmieniony i produkt typu dzikiego i je 

porównujemy ze sobą. Tak jak tutaj porównano czy też zilustrowano, te typ dzikiego służą do 

wytworzenia białka typu dzikiego określonych właściwościach i te właściwości są ze sobą 

zestawiane i porównywane 

Teraz chciałem omówić pobieżnie kilka technik mutagenezy ( tutaj wywód że jest to temat 

rzeka można by cały semestr wykładać).

Ja po prostu zwrócę uwagę na pewne problemy i metody. Różne są metody wprowadzania 

mutacji, na przykładzie który przed chwilą państwu pokazywałem na ilustracji była prosta 

mutacja, mutacja punktowa czyli zamiana jednej reszty aminokwasowej na druga, ale mutacje 

ukierunkowane to nie tylko zamiany reszt. Mutacje ukierunkowane czyli kierowane przez 

badacza mogą prowadzić do delecji fragmentu sekwencji w jakimś białku, do inercji to też 

mutacja czyli wbudowujemy w białko sekwencje której tam wcześniej nie było. Może to być 

również technika w której jakiś fragment w białku podstawimy fragmentem innego białka to 

jest też mutacja, także proszę nie myśleć ze mutacji ukireunkowanej jako tylko o zamianie 

jednej reszty. Chodzi o to, że każda z tych metod jest racjonalna, eksperymentator do końca 

panuje na tym i wie czego chce. A jeżeli nie panuje to jest to z zamysłem. Wiec pierwszym 

przykładem jest mutacja, technika w której zmierzamy do delecji fragmentu genu. Mamy 

sytuacje wyjściową czyli układ odniesienia. 

Widzą Państwo gen, w którym są jakieś przykładowe dwie sekwencje wyróżnione w tym 

przypadku sekwencje Alu i one są tak ułożone w tym genie, że z możemy z nich korzystać do 

przeprowadzenia delecji. Czyli wytrawiając enzymem AluI i usuwamy fragment genu 

następnie używamy ligazy i otrzymujemy gen z delecją. Oczywiste to wygląda bardzo pięknie 

jeżeli taka delecja nie spowoduje przesunięcia ramki odczytu, jeżeli ramka odczytu jest 

zachowana to otrzymujemy produkt białkowy który dokładnie odpowiada delecji bez 

przesunięcia ramki. To jest pierwszy sposób gdzie korzystamy z miejsca restrykcyjnego aby 

otrzymać delecję.

Delecja ale wykonana w trochę inny sposób. Wyobrażamy sobie sytuacje gdzie mamy tylko 

jedno miejsce restrycyjne np. EcoR1, nie ma dwóch dowolnych żeby taka sporą delecja jaką 

była na poprzednim schemacie można było zrobić. Zatem przy pomocy enzymu 

restrykcyjnego przecinamy sekwencje i następnie używamy enzymu przy Bal31 do dokonania 

delecji obu produktów. Pamiętacie Państwo, że Bal31 jest taką egzonukleaza, która nie 

wykazuje preferencji w odniesieniu do sekwencji i naprawia 3’ i 5’ końce (szczerze mówiąc 

ja bym nigdy takiej metody nie użył, ale warto wiedzieć, że jak ktoś bardzo chce to może. 

Dlaczego bym nie użył? Dlatego, że nie miałbym kontroli nad tym jak duża jest ta delecja i na 

pewno powstałby by tutaj tez produkty, których ramka odczytu byłaby za duża (niewyraźnie?) 

ale teoretycznie można otrzymać całą bibliotekę mutantów a potem wybrać te właściwe)

A wiec jeden i drugi produkt EcoR1 są nacinane i traktowane Bal31, potem wprowadzamy 

ligazę- one podlegają ligacji i otrzymujemy gen z delecja a w konsekwencji białko z delecją. 

Tu jest napisane „protein with a minor deletion” ale to niekoniecznie musi być prawda, 

ponieważ to czy ona będzie duża czy mała zależy od czasu w jakim Bal31 działało. Zwrócicie 

uwagę, tak zupełnie na marginesie że te „narzędzia”, enzymy którymi się posługujemy  są 

nam znane, ale od ich układu, kolejności wykorzystania zależy to co… Kolejna metoda 

(bardzo ciekawa) otóż tutaj możemy wprowadzić insercję, mianowicie widzimy sekwencję 

typu „dzikiego”, gdzie jest znów EcoR1 miejsce.

 

Przy pomocy EcoR1 trawimy sekwencję i po przecięciu ligujemy z  oligonukleotydem , który 

oczywiście ma końce komplementarne do sekwencji EcoR1- w ten sposób otrzymujemy gen z 

insercją, który daje produkt białkowy już zmieniony. Ten produkt, w tym konkretnym 

eksperymencie uległ destabilizacji- wpłynęliśmy jakoś na jego strukturę no i mogło tak być że 

się niezestabilizowałą, tutaj są różne powody dla których można taką insercję robić, ale 

zostawmy je na boku. Tutaj teraz pokazaliśmy sobie jak można insercję zobaczyć. Z Ilustracji 

dodatkowych… ( tu już niewyraźnie, jakieś szmery „ o ja pierdole, rozlało się”)

Metoda mutagenezy zwana metodą mutagenezy kasetowej, otóż jak sama nazwa wskazuje 

jest wymieniamy fragment sekwencji kodującej czyli kaseta. Metoda jest niezwykle prosta, 

musimy mieć po prostu sekwencję lub gen, któremu chcemy wymienić kasetę i co do tej 

sekwencji, na której pracujemy jest tylko jedno wymaganie czyli jedna jakieś założenie, że w 

niej występują dwa miejsca restrykcyjne dogodne do tego aby kasetę wymienić. Popatrzcie na 

ilustrację.

Pracujemy na tej zielonej sekwencji, umówmy się. Tu było jedno miejsce restrykcyjne a tu 

drugie, korzystając z tych z miejsc restrykcyjnych, odtrawiliśmy ten fragment DNA, to jest 

nasza kaseta typu dzikiego i na jej miejsce wstawiamy teraz sekwencję zmutowana i to jest ta 

sekwencja. Widzimy, że tu jest wprowadzona mutacja, zaznaczona kolorem, po ligacji 

dostajemy sekwencję zmutowaną. To byłaby mutageneza kasetowa, jeżeli tylko można tak 

postąpić to oczywiście polecałbym dlatego że tutaj efektywność wprowadzenia mutacji jest 

niemal 100%. Oczywiście na schemacie mamy bardzo prostu przypadek, wymianie uległa 

pojedyncza para zasad, możemy w ogóle wiele par wymienić jednocześnie. Możemy 

posługując się taką metodą wprowadzić kasetę zupełnie nieadekwatną dla danego genu 

białka. Możemy wprowadzić bardzo długo fragment i wtedy otrzymamy białko nieistniejące 

do tej pory.

(niedosłyszane pytanie od publiczności coś o insercjach, odtrawianiu, miejscach 

restrykcyjnych- lepiej dwa a nie jedno bo wtedy klonowanie jest ukierunkowane, w tym 

czasie ktoś zasnął i spadł z krzesła :D )

Ale proszę Państwa ta metoda niepozorna ze schematów ma przeogromny potencjał, 

mianowicie, wyobraźcie sobie Państwo eksperyment następujący: trawimy, usuwamy tą 

sekwencję typu dzikiego a na jej miejsce wstawiamy niejeden fragment o określonej 

sekwencji, nie używamy do ligacji jednego fragmentu o określonej ale całą biblioteką, a więc 

zrandomizowane sekwencje czyli pracujemy z całą biblioteką. Na przykład wszystkich 

przypadkowych sekwencji, które dotyczą jakiegoś fragmentu kodującego fragment białka. 

Wyobraźmy sobie problem, bardzo praktyczny, mamy gen na przykład jakiejś lipazy, która 

jest lipazą którą możemy potencjalnie wykorzystać w proszku, który zawiera ( jak to się 

pięknie mówi w reklamach) nową formułę (nikt nie wie co to jest ta formuła, może chodzi o 

jakiś nowy związek chemiczny albo właśnie nowy enzym) ale trudno oczekiwać, aby Pan czy 

tez Pani z reklamy tłumaczyła, że właśnie otrzymaliśmy nową wersję enzymu lipazy 

metodami inżynierii genetycznej i dlatego ten proszek będzie w jeszcze niższej temperaturze, 

jeszcze szybciej usuwał te wstrętne plamy z ukochanej koszulki dziecka, albo mamy 

(koszulkę nie mamę mam nadzieję?) którą dziecko użyło do wytarcia podłogi. Mamy problem 

z tym żeby wprowadzić ten proszek z nową formułą na rynek i poszukujemy nowej lipazy i 

poznaliśmy gen, poznaliśmy tę sekwencję, która jest istotna dla centrum katalitycznego 

pamiętając ciągle że właśnie mamy jakiś deadline (…) Chcemy ulepszyć enzym, ale 

ulepszanie enzymów rzadko jest procesem racjonalnym, oczywiście są takie opowieści o 

racjonalnych ulepszeniach, ale metody racjonale ulepszania enzymów nie są pewne zatem 

bardzo często stosuje się metody randomiczne czyli własnie takie że korzysta się z metod 

mutagenezy w której jednocześnie generujemy cała szereg mutantów a więc jeżeli byśmy 

mieli gen, w którym akurat jakis fragment odpowiada za kodowanie reszty istotnie dla 

kataliazy tego wspomnianego enzymu.