Techniki są jasne do państwa?

Jeżeli ktoś czegoś nie rozumie to zapraszam do zadawania pytań, jeżeli nie to przejdziemy do

innych problemów i innych metod analizy produktów ekspresji genów, bo o tym mówimy.

Taką grupę metod stanowią metody w których wykorzystujemy mutacje, a wiec kilka słów na

temat mutagenezy. Mutageneza czy też mutacje, są czymś naturalnym. Wszyscy jak tu

siedzimy, jesteśmy podlegamy temu zjawisku. Mutacje zachodzą cały czas w organizmach

żywych, jest to proces indukowany przez różne czynniki też spontaniczne wynikające ze

niedokładności na przykład procesu replikacji DNA, z transkrypcji też i oczywiście te mutacje

spontaniczne są naprawiane w różnym zakresie ale oczywiście też nie są i to może prowadzić

do zmian nowotworowych i innych problemów. Czyli jedna grupa mutacji są to mutacje

spontaniczne i takie też często są wykorzystywane w laboratorium, do badania w genetyce

szczególnie ale są też takie mutacje, które są indukowane specjalnie w laboratorium. Na

przykład jeżeli jakiś organizm jest naświetlany promieniowaniem wysoko energetycznym

częstość mutacji wzrasta i takie postępowania stosowano i stosuje się bardzo często po to aby

wygenerować mutanty jakieś interesujące. Z kolei te mutacje czy ta mutageneza jest określana

mianem mutagenezy nieukierunkowanej. Natomiast w laboratorium inżynierii genetycznej

inżynierii białka albo (…) molekularnej metody inżynierii genetycznej po prostu są

narzędziem. Najczęściej wprowadzamy mutacje ukierunkowane, zdefiniowane. Technika ta

nosi nazwę (site directed mutagenesis) mutageneza ukierunkowana. Opisowo możemy

powiedzieć ze wprowadzamy mutacje tam gdzie chcemy czyli tak jak to jest na naszej

ilustracji:

W sekwencji kodującej zamieniamy wybraną resztę i wprowadzamy te zmianę kodonu, istotą

techniki mutagenezy czy też eksperymentu, w którym wykorzystuje się mutagenezę

ukierunkowaną jest po pierwsze wprowadzenie mutacji a po drugie obserwowanie zmiany

jaką ta mutacja wprowadza. Tak jak poprzednio mówiłem to jest możliwe tylko wtedy jeżeli

mamy określony jakiś układ odniesienia, jeżeli możemy porównać do czegoś właściwości tak

zmienionego produktu. Zatem w eksperymencie mutagenezy po pierwsze wprowadzamy

mutację, zamienimy sekwencje kodującą w jakimś tam zakresie, to wprowadza mutację w

białku, na przykładzie izoleucyna została zamieniona na leucynę i otrzymujemy produkt

białkowy o określonych właściwościach. Ale te właściwości są dla nas istotne tylko wtedy

gdy porównamy je z właściwościami białka typu dzikiego. Także każdy eksperyment

mutagenezy polega na, że mamy produkt zmieniony i produkt typu dzikiego i je

porównujemy ze sobą. Tak jak tutaj porównano czy też zilustrowano, te typ dzikiego służą do

wytworzenia białka typu dzikiego określonych właściwościach i te właściwości są ze sobą

zestawiane i porównywane

Teraz chciałem omówić pobieżnie kilka technik mutagenezy ( tutaj wywód że jest to temat

rzeka można by cały semestr wykładać).

Ja po prostu zwrócę uwagę na pewne problemy i metody. Różne są metody wprowadzania

mutacji, na przykładzie który przed chwilą państwu pokazywałem na ilustracji była prosta

mutacja, mutacja punktowa czyli zamiana jednej reszty aminokwasowej na druga, ale mutacje

ukierunkowane to nie tylko zamiany reszt. Mutacje ukierunkowane czyli kierowane przez

badacza mogą prowadzić do delecji fragmentu sekwencji w jakimś białku, do inercji to też

mutacja czyli wbudowujemy w białko sekwencje której tam wcześniej nie było. Może to być

również technika w której jakiś fragment w białku podstawimy fragmentem innego białka to

jest też mutacja, także proszę nie myśleć ze mutacji ukireunkowanej jako tylko o zamianie

jednej reszty. Chodzi o to, że każda z tych metod jest racjonalna, eksperymentator do końca

panuje na tym i wie czego chce. A jeżeli nie panuje to jest to z zamysłem. Wiec pierwszym

przykładem jest mutacja, technika w której zmierzamy do delecji fragmentu genu. Mamy

sytuacje wyjściową czyli układ odniesienia.

Widzą Państwo gen, w którym są jakieś przykładowe dwie sekwencje wyróżnione w tym

przypadku sekwencje Alu i one są tak ułożone w tym genie, że z możemy z nich korzystać do

przeprowadzenia delecji. Czyli wytrawiając enzymem AluI i usuwamy fragment genu

następnie używamy ligazy i otrzymujemy gen z delecją. Oczywiste to wygląda bardzo pięknie

jeżeli taka delecja nie spowoduje przesunięcia ramki odczytu, jeżeli ramka odczytu jest

zachowana to otrzymujemy produkt białkowy który dokładnie odpowiada delecji bez

przesunięcia ramki. To jest pierwszy sposób gdzie korzystamy z miejsca restrykcyjnego aby

otrzymać delecję.

Delecja ale wykonana w trochę inny sposób. Wyobrażamy sobie sytuacje gdzie mamy tylko

jedno miejsce restrycyjne np. EcoR1, nie ma dwóch dowolnych żeby taka sporą delecja jaką

była na poprzednim schemacie można było zrobić. Zatem przy pomocy enzymu

restrykcyjnego przecinamy sekwencje i następnie używamy enzymu przy Bal31 do dokonania

delecji obu produktów. Pamiętacie Państwo, że Bal31 jest taką egzonukleaza, która nie

wykazuje preferencji w odniesieniu do sekwencji i naprawia 3’ i 5’ końce (szczerze mówiąc

ja bym nigdy takiej metody nie użył, ale warto wiedzieć, że jak ktoś bardzo chce to może.

Dlaczego bym nie użył? Dlatego, że nie miałbym kontroli nad tym jak duża jest ta delecja i na

pewno powstałby by tutaj tez produkty, których ramka odczytu byłaby za duża (niewyraźnie?)

ale teoretycznie można otrzymać całą bibliotekę mutantów a potem wybrać te właściwe)

A wiec jeden i drugi produkt EcoR1 są nacinane i traktowane Bal31, potem wprowadzamy

ligazę- one podlegają ligacji i otrzymujemy gen z delecja a w konsekwencji białko z delecją.

Tu jest napisane „protein with a minor deletion” ale to niekoniecznie musi być prawda,

ponieważ to czy ona będzie duża czy mała zależy od czasu w jakim Bal31 działało. Zwrócicie

uwagę, tak zupełnie na marginesie że te „narzędzia”, enzymy którymi się posługujemy są

nam znane, ale od ich układu, kolejności wykorzystania zależy to co… Kolejna metoda

(bardzo ciekawa) otóż tutaj możemy wprowadzić insercję, mianowicie widzimy sekwencję

typu „dzikiego”, gdzie jest znów EcoR1 miejsce.

Przy pomocy EcoR1 trawimy sekwencję i po przecięciu ligujemy z oligonukleotydem , który

oczywiście ma końce komplementarne do sekwencji EcoR1- w ten sposób otrzymujemy gen z

insercją, który daje produkt białkowy już zmieniony. Ten produkt, w tym konkretnym

eksperymencie uległ destabilizacji- wpłynęliśmy jakoś na jego strukturę no i mogło tak być że

się niezestabilizowałą, tutaj są różne powody dla których można taką insercję robić, ale

zostawmy je na boku. Tutaj teraz pokazaliśmy sobie jak można insercję zobaczyć. Z Ilustracji

dodatkowych… ( tu już niewyraźnie, jakieś szmery „ o ja pierdole, rozlało się”)

Metoda mutagenezy zwana metodą mutagenezy kasetowej, otóż jak sama nazwa wskazuje

jest wymieniamy fragment sekwencji kodującej czyli kaseta. Metoda jest niezwykle prosta,

musimy mieć po prostu sekwencję lub gen, któremu chcemy wymienić kasetę i co do tej

sekwencji, na której pracujemy jest tylko jedno wymaganie czyli jedna jakieś założenie, że w

niej występują dwa miejsca restrykcyjne dogodne do tego aby kasetę wymienić. Popatrzcie na

ilustrację.

Pracujemy na tej zielonej sekwencji, umówmy się. Tu było jedno miejsce restrykcyjne a tu

drugie, korzystając z tych z miejsc restrykcyjnych, odtrawiliśmy ten fragment DNA, to jest

nasza kaseta typu dzikiego i na jej miejsce wstawiamy teraz sekwencję zmutowana i to jest ta

sekwencja. Widzimy, że tu jest wprowadzona mutacja, zaznaczona kolorem, po ligacji

dostajemy sekwencję zmutowaną. To byłaby mutageneza kasetowa, jeżeli tylko można tak

postąpić to oczywiście polecałbym dlatego że tutaj efektywność wprowadzenia mutacji jest

niemal 100%. Oczywiście na schemacie mamy bardzo prostu przypadek, wymianie uległa

pojedyncza para zasad, możemy w ogóle wiele par wymienić jednocześnie. Możemy

posługując się taką metodą wprowadzić kasetę zupełnie nieadekwatną dla danego genu

białka. Możemy wprowadzić bardzo długo fragment i wtedy otrzymamy białko nieistniejące

do tej pory.

(niedosłyszane pytanie od publiczności coś o insercjach, odtrawianiu, miejscach

restrykcyjnych- lepiej dwa a nie jedno bo wtedy klonowanie jest ukierunkowane, w tym

czasie ktoś zasnął i spadł z krzesła :D )

Ale proszę Państwa ta metoda niepozorna ze schematów ma przeogromny potencjał,

mianowicie, wyobraźcie sobie Państwo eksperyment następujący: trawimy, usuwamy tą

sekwencję typu dzikiego a na jej miejsce wstawiamy niejeden fragment o określonej

sekwencji, nie używamy do ligacji jednego fragmentu o określonej ale całą biblioteką, a więc

zrandomizowane sekwencje czyli pracujemy z całą biblioteką. Na przykład wszystkich

przypadkowych sekwencji, które dotyczą jakiegoś fragmentu kodującego fragment białka.

Wyobraźmy sobie problem, bardzo praktyczny, mamy gen na przykład jakiejś lipazy, która

jest lipazą którą możemy potencjalnie wykorzystać w proszku, który zawiera ( jak to się

pięknie mówi w reklamach) nową formułę (nikt nie wie co to jest ta formuła, może chodzi o

jakiś nowy związek chemiczny albo właśnie nowy enzym) ale trudno oczekiwać, aby Pan czy

tez Pani z reklamy tłumaczyła, że właśnie otrzymaliśmy nową wersję enzymu lipazy

metodami inżynierii genetycznej i dlatego ten proszek będzie w jeszcze niższej temperaturze,

jeszcze szybciej usuwał te wstrętne plamy z ukochanej koszulki dziecka, albo mamy

(koszulkę nie mamę mam nadzieję?) którą dziecko użyło do wytarcia podłogi. Mamy problem

z tym żeby wprowadzić ten proszek z nową formułą na rynek i poszukujemy nowej lipazy i

poznaliśmy gen, poznaliśmy tę sekwencję, która jest istotna dla centrum katalitycznego

pamiętając ciągle że właśnie mamy jakiś deadline (…) Chcemy ulepszyć enzym, ale

ulepszanie enzymów rzadko jest procesem racjonalnym, oczywiście są takie opowieści o

racjonalnych ulepszeniach, ale metody racjonale ulepszania enzymów nie są pewne zatem

bardzo często stosuje się metody randomiczne czyli własnie takie że korzysta się z metod

mutagenezy w której jednocześnie generujemy cała szereg mutantów a więc jeżeli byśmy

mieli gen, w którym akurat jakis fragment odpowiada za kodowanie reszty istotnie dla

kataliazy tego wspomnianego enzymu.