str_29_32.indd

Wykorzystanie technik mikroskopowych w nauce o żywności jest niero-
zerwalnie związane z jej mikrostrukturą, która określa stopień organizacji
poszczególnych komponentów żywności oraz ich wzajemne interakcje.
Produkty żywnościowe charakteryzują się skomplikowaną strukturą, która
jest kreowana bądź to przez samą naturę (produkty nieprzetworzone), bądź
podczas procesów technologicznych. Wiele produktów żywnościowych
stanowi skomplikowane układy wielofazowe, emulsje, zawiesiny, piany, żele,
a wzajemna organizacja oraz interakcje pomiędzy składnikami, tworząc
strukturę produktu, decydują o jej cechach funkcjonalnych.
Techniki mikroskopowe to najodpowiedniejsze metody badania struktury
żywności, ponieważ wynikiem eksperymentu są obrazy odzwierciedlające
jej budowę, a wykorzystanie takich metod jak cyfrowa analiza obrazu lub
analiza fraktalna pozwala na matematyczny opis uzyskanych informacji.
Wiele przetworzonych produktów żywnościowych charakteryzuje się
całkowicie odmienną strukturą w porównaniu do surowca, z którego
powstały (np. produkcja sera z mleka, chleba z ziarna pszenicy). W tym
przypadku analiza mikroskopowa jest pomocna w ocenie skuteczności
poszczególnych zabiegów technologicznych podczas procesu produkcyj-
nego i w kreowaniu odpowiedniej struktury – tekstury produktu.
Techniki mikroskopowe wykorzystuje się również w badaniu za-
nieczyszczeń i zafałszowań żywności. Zakres zastosowania technik
mikroskopowych w nauce o żywności obejmuje więc:
• badania związku pomiędzy strukturą a funkcjonalnymi właściwo-

ściami surowców, parametrami procesów technologicznych oraz
jakością surowców i wyrobów gotowych,

• badania przebiegu zmian strukturalnych podczas produkcji żywności,
• badania przyczyn zmian jakościowych w żywności w czasie transportu

i składowania,

• badania wpływu substancji obcych (zanieczyszczeń, dodatków do

żywności) na strukturę produktów.

Ciągły rozwój technik mikroskopowych powoduje coraz większe za-
interesowanie badaczy mikrostrukturą żywności oraz jej wpływem na
teksturę i inne cechy funkcjonalne żywności. Obserwacje rzeczywistej
struktury żywności są jednak trudne w realizacji, gdyż każde działanie
związane z przygotowaniem preparatu mikroskopowego w większym lub
mniejszym stopniu może wpływać na zmiany w jej strukturze, co w kon-
sekwencji może prowadzić do fałszywych wniosków. W tym przypadku
najwłaściwszym postępowaniem jest wykorzystanie kilku różnych technik
mikroskopowych i porównanie uzyskanych rezultatów.

Mikroskopia świetlna (LM – light microscopy)

Najwcześniej zastosowaną techniką mikroskopową w badaniu struktury
żywności była mikroskopia świetlna (optyczna). Początkowo technika ta
była wykorzystywana do obserwacji zanieczyszczeń i badania zafałszowań

Metody mikroskopowe w badaniach
struktury produktów żywnościowych

dr Lesław Juszczak

Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności, Akademia Rolnicza w Krakowie

żywności. Dopiero dalsze wykorzystanie mikroskopii świetlnej związane było
z analizą struktury żywności oraz wpływem procesów technologicznych na
jej przemiany. Mikroskopia świetlna charakteryzuje się jednak stosunkowo
niską rozdzielczością (około 200 nm), którą można dwukrotnie zwiększyć,
stosując promieniowanie nadfioletowe. Obecnie rozwój tradycyjnej mikro-
skopii świetlnej dotyczy głównie poprawy jakości układów optycznych oraz
dodatkowego oprzyrządowania mikroskopów (aparaty cyfrowe, kamery
CCD, oprogramowanie do analizy obrazów oraz ich archiwizacji). Przydat-
nym narzędziem mikroskopii świetlnej w analizie żywności są różnorodne
techniki barwienia preparatów w celu ich skontrastowania. Należą do nich
m.in. metody: tworzenie barwnego kompleksu skrobi z jodem oraz lokalizacja
białek za pomocą fuksyny. Użytecznym barwnikiem w badaniu żywności
jest błękit toluidyny O (TBO), który barwi ściany komórkowe zawierające
substancje pektynowe na kolor od różowego do purpurowego, natomiast

Food microstructure is the organization of elements within food and their interaction. Knowledge of food microstructure is
critical if food features are to be controlled properly since there is a causal connection between structure and functionality.
Microscopy and imaging techniques are the most appropriate way for evaluating food structure because they are the
only analytical methods that produce results in the form of images. However visualization of true food structure is very
difficult, since step of the preparation of food sample for microscopy alters food structure to some extent.

metody mikroskopowe w badaniach struktury...

| laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2005

następuje w polu elektrycznym. Koniecznym
warunkiem uformowania stabilnej wiązki jest
próżnia. Elektrony pierwotne wysyłane przez
emiter i przyspieszane w polu elektrycznym są
ogniskowane na badanym preparacie, a odchyla-
nie ich przez cewkę skanującą pozwala na analizę
całej powierzchni próbki. Po zetknięciu się wiązki
elektronów z próbką następuje szereg zjawisk:
absorpcja lub przejście (w przypadku cienkich
preparatów) elektronów przez próbkę (elektrony
pierwotne nierozproszone i rozproszone), odbi-
cie elektronów (elektrony pierwotne wstecznie
rozproszone) i emisja elektronów wtórnych oraz
promieniowania rentgenowskiego. W zależności
od sposobu powstawania obrazu wyróżnia się
transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM)
oraz skaningową mikroskopię elektronową
(SEM). W mikroskopie transmisyjnym obraz
powstaje na skutek ugięcia zogniskowanej
wiązki elektronów, które jest wynikiem ich
interakcji z chmurą elektronową otaczającą
atomy próbki. Następuje również redukcja
szybkości elektronów. Niewielka ilość elektro-
nów, penetrując chmurę elektronową atomu,
jest uginana pod znacznie większym kątem
i nie trafia na soczewkę obiektywu, dając od-
powiednio ciemne punkty na ekranie. Schemat
transmisyjnego mikroskopu elektronowego
przedstawiono na rysunku 2. W mikroskopie
transmisyjnym o zdolności rozdzielczej decyduje
w znacznej mierze grubość preparatu, która
powinna wynosić około 20 nm dla osiągnięcia
zdolności rozdzielczej rzędu 2 nm.
W skaningowym mikroskopie elektronowym
(rys. 3) sygnał z powierzchni próbki stanowią
elektrony wtórne lub pierwotne odbite (wstecz-
nie rozproszone). Docierają one do detektora,
którego istotną część stanowią scyntylator i fo-
topowielacz. Obrazy mikroskopowe wykonane
w skaningowym mikroskopie elektronowym

Rys. 2. Schemat budowy układu tworzącego obraz
w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

w kompleksach z ligniną wykazuje barwę
ciemnoniebieską. W produktach mięsnych kom-
pleksy tkanka mięśniowa – TBO są bladoróżowe,
a włókna elastyny – turkusowe.
Inną odmianą mikroskopu świetlnego jest
mikroskop polaryzacyjny, wykorzystywany do
badań układów krystalicznych w świetle linio-
wo spolaryzowanym. W obrazie mikroskopo-
wym amorficzne obszary preparatu pozostają
ciemne, natomiast rejony krystaliczne – jasne.
Najlepszym przykładem są tutaj ziarna skrobio-
we, zawierające zarówno obszary amorficzne,
jak i krystaliczne. W tym przypadku mikroskop
polaryzacyjny można wykorzystać do badania
procesu kleikowania skrobi.
Kolejną techniką mikroskopową wykorzystywaną
w badaniach struktury żywności jest mikroskopia
fluorescencyjna. Opiera się ona na pomiarach
fluorescencji barwników fluorescencyjnych (flu-
orochromów), które wybiórczo mogą się wiązać
z wybranymi strukturami subkomórkowymi lub
grupami chemicznymi. Zjawisko fluorescencji
jest określane jako zdolność do emitowania
światła o określonej długości fali pod wpływem
absorpcji promieniowania pochodzącego z ob-
cego źródła. W mikroskopie fluorescencyjnym
preparat napromieniowuje się światłem o okre-
ślonej długości fali z wydzielonego przez filtry
wzbudzające widma lampy. Wiele składników
żywności wykazuje autofluorescencję. Należą
do nich: chlorofil, karotenoidy, ligniny, kolagen,
elastyna oraz niektóre tłuszcze. Stosowanie trady-
cyjnej mikroskopii fluorescencyjnej związane jest
jednak ze skomplikowanymi procedurami przy-
gotowania preparatów. Warunkiem otrzymania
obrazu o dobrej jakości (wysokiej rozdzielczości
i właściwym kontraście) jest odpowiednia gru-
bość preparatu. W przypadku gdy preparat jest
zbyt gruby, otrzymany obraz mikroskopowy

Rys. 1. Schemat optyki mikroskopu konfo-
kalnego.

zawiera poświatę i zarysy szczegółów znajdują-
cych się na różnych głębokościach preparatu, co
znacznie utrudnia obserwację.

Mikroskopia konfokalna
(CLSM – confocal laser
scanning microscopy)

Mikroskop konfokalny (rys. 1) jest jedną z naj-
nowszych modyfikacji mikroskopii świetlnej
(optycznej) i może być stosowany do obserwacji
z użyciem konwencjonalnej fluorescencji, jak
również w świetle odbitym, generowanym
z płaszczyzny fokalnej próbki. Zasadnicze
modyfikacje polegają na tym, że wiązka światła
ogniskowana przez obiektyw wybiórczo oświe-
tla obszar na określonej głębokości preparatu,
a światło odbite od tego obszaru (lub emitowane
przez wzbudzony fluorochrom) jest ogniskowa-
ne w cienką wiązkę przepuszczaną przez aperturę
konfokalną (mały otwór w przesłonie znajdującej
się pod detektorem światła), co umożliwia jed-
noczesne eliminowanie promieni pochodzących
z innych płaszczyzn. Dodatkowo, przesuwając
próbkę w osi Z, otrzymuje się obrazy poszcze-
gólnych płaszczyzn. Cały układ wspomagany
jest oprogramowaniem, które analizuje nie tylko
jasność i barwę wszystkich punktów, ale również
ich położenie na płaszczyźnie X-Y oraz na
głębokości (Z). W mikroskopach konfokalnych
jako źródło światła stosuje się lasery (argonowe,
kryptonowo-argonowe, helowo-neonowe), dzięki
czemu można znacznie zmniejszyć wiązkę
oświetlającą, co w konsekwencji powoduje
wzrost intensywności świecenia. Mikroskopia
konfokalna znajduje szerokie zastosowanie
w analizie struktury produktów żywnościowych,
szczególnie tych o dużej zawartości tłuszczu
(masło, tłuszcze śniadaniowe, majonez, sosy
sałatkowe) oraz układów wielofazowych. Przy-
kładem może być tutaj krem na bazie mleka,
do którego podczas ubijania wtłaczane jest
powietrze. Wykorzystanie mikroskopu konfo-
kalnego pozwoliło zaobserwować, że banieczki
powietrza stabilizowane są otaczającymi je
kuleczkami tłuszczowymi, a pozostałą przestrzeń
wypełnia matryca białkowa. Szczegółowa analiza
takiego układu pozwala zaobserwować korelacje
pomiędzy rozmiarami i dystrybucją poszczegól-
nych komponentów a cechami strukturalnymi
i funkcjonalnymi gotowego produktu.

Mikroskopia elektronowa
(EM – electron microscopy)

Podstawą tej techniki jest bombardowanie próbki
wiązką elektronów, której źródłem jest katoda
dostarczająca cząstki w wyniku termoemisji lub
emisji polowej. Przyspieszenie wiązki elektronów

laboratorium przemysłowe |

metody mikroskopowe w badaniach struktury...

Laboratorium |

/2005

przedstawiają topografię powierzchni próbki.
W mikroskopii elektronowej niezmiernie
istotnym zagadnieniem jest technika przygo-
towywania preparatów. Wybór metody prepa-
rowania zależny jest od rodzaju mikroskopu
oraz specyfiki analizowanego materiału. Takie
produkty żywnościowe, jak ziarna zbóż, nasiona
roślin strączkowych oraz produkty ich przero-
bu, żywność sproszkowana czy koncentraty,
ze względu na niską wilgotność nie wymagają
wstępnego przygotowania do analizy w SEM.
Niewielkich rozmiarów preparaty napyla się
w napylarkach próżniowych cienką warstwą

lub octanie uranylu). Zjawisko emisji promienio-
wania rentgenowskiego jako efekt oddziaływania
elektronów z atomami analizowanego materiału
jest podstawą mikroanalizy rentgenowskiej.
Wykorzystuje się tu zależność energii i natężenia
promieniowania charakterystycznego od składu
chemicznego badanego mikroobszaru preparatu.
Przykładowe obrazy uzyskane z wykorzystaniem
skaningowej mikroskopii elektronowej pokazano
na fotografiach 1-4. Fotografia 1 przedstawia
fragment powierzchni ziarna skrobi ziemniacza-
nej. Obserwowane uszkodzenie jest wynikiem
działania wiązki elektronów w komorze mikro-
skopu. Na fotografii 2 pokazano nieregularną
strukturę liofilizowanego żelu skrobiowego.

węgla i złota lub platyny. Pozostałe surowce
i produkty żywnościowe wymagają bardziej
skomplikowanych procedur przygotowania
preparatów, które obejmują: utrwalanie z wyko-
rzystaniem aldehydów (formaldehyd, aldehyd
glutaronowy), manganianu(VII) potasu lub
tetrachlorku osmu, płukanie, odwadnianie
w roztworach etanolu lub acetonu i suszenie. Tak
przygotowane preparaty napyla się warstwą prze-
wodnika i poddaje analizie w mikroskopie SEM.
Natomiast w przypadku mikroskopii TEM pre-
paraty poddawane są dalszej obróbce: zatapianiu
w żywicach (metakrylany, żywice epoksydowe),
cięciu ultracienkich skrawków w mikrotomach
oraz kontrastowaniu (np. w cytrynianie ołowiu

Rys. 3. Schemat budowy układu tworzącego ob-
raz w skaningowym mikroskopie elektronowym.

Fot. 1. Fragment powierzchni ziarna skrobi
ziemniaczanej (B. Trybalska, AGH, Kraków).

Fot. 2. Mikrostruktura liofilizowanego żelu
skrobiowego (B. Trybalska, AGH, Kraków).

metody mikroskopowe w badaniach struktury...

| laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

/2005

zastosowaniu specjalnego gazowego detektora
elektronów wtórnych (GSED). Pozwala to na
obserwacje materiałów biologicznych, w tym
próbek żywności, bez wcześniejszych zabiegów
związanych z przygotowaniem preparatów. Daje
to możliwość obserwacji rzeczywistej struktury
próbek o dużej zawartości wody (np. struktury
żelowe i żelopodobne, lody).

Mikroskopia sił
atomowych
(AFM – atomic force
microscopy)

Mikroskop sił atomowych należy do grupy
skaningowych mikroskopów próbkujących
(SPM), zwanych również mikroskopami sond
skanujących. Zasadniczą zaletą tej mikroskopii
jest możliwość badania materiałów nieprze-
wodzących, a więc próbek biologicznych, bez
wstępnego ich preparowania. Obrazy uzyskane
z wykorzystaniem mikroskopii AFM odzwiercie-
dlają strukturę powierzchniową próbki w skali
nanometrycznej. W mikroskopie sił atomowych
próbnik skanujący powierzchnię próbki umiesz-
czony jest na wsporniku (rys. 4). Oddziaływania
na poziomie sił van der Waalsa pomiędzy po-
wierzchnią próbki a próbnikiem powodują jego
ugięcie lub odchylenie, co jest rejestrowane przez
detektor i przekształcane w obraz powierzchni.
Mikroskopy AFM mogą pracować w trzech
trybach. W trybie kontaktowym odległość
pomiędzy powierzchnią próbki a próbnikiem
wynosi ułamek nanometra, natomiast w bezkon-
taktowym – kilkanaście nanometrów. Trzeci tryb
pracy mikroskopu AFM – „tapping” – stanowi
pośrednią metodę w stosunku do dwóch pozo-
stałych. Dodatkową zaletą mikroskopii AFM
jest możliwość pracy w roztworach. Przykładowe
obrazy mikrostruktury powierzchniowej poka-
zano na fotografiach 5-7. Fotografia 5 przed-
stawia obraz powierzchni ziarna skrobiowego,
natomiast fotografie 6 i 7 obrazują strukturę
powierzchniową czekolady.
Dalszy rozwój i wykorzystanie technik mikro-
skopowych w badaniu struktury żywności mogą
być również związane z zastosowaniem technik
zespolonych, np. połączenie mikroskopii optycz-
nej z metodami spektroskopowymi (absorpcja
UV, mikrospektroskopia w podczerwieni z trans-
formacją Fouriera), co pozwala na lokalizację
i mapowanie specyficznych grup chemicznych.
Natomiast zespolenie mikroskopii z reometrami
pozwala na obrazowanie zmian strukturalnych
indukowanych przyłożonymi naprężeniami. No-
woczesną techniką opartą na bazie spektroskopii
NMR jest obrazowanie rezonansu magnetycz-
nego (MRI), która jako metoda bezinwazyjna

znalazła zastosowanie do lokalizacji cząsteczek
wody i tłuszczu w produktach żywnościowych
oraz badania zjawiska krystalizacji tłuszczu. Ko-
lejną bezinwazyjną techniką, która może znaleźć
zastosowanie w badaniu struktury żywności, jest
mikroskopia akustyczna.

Piśmiennictwo
1. Aguilera J.M., Why food microstructure? „Journal of Food

Engineering”, 2005, 67, 3-11.

2. Aguilera J.M., Stanley D.W., Baker K.W., New dimensions in

microstructure of food products. „Trends in Food Science
and Technology”, 2000, 11, 3-9.

3. Barbacki A. (red.), Mikroskopia elektronowa. Wydawnictwo

Politechniki Poznańskiej, Poznań, 2003.

4. Brooker B.E., The study of food systems using confocal laser

scanning microscopy. „Microscopy and Analysis”. 1991, 13-15.

5. Dürrenberger M.B., Handschin S., Conde-Petit B., Escher F., Visu-

alization of food structure by confocal laser scanning microscopy
(CLSM). „Lebensm.-Wiss. u.-Technol.“, 2001, 34, 11-17.

6. Fornal J., Aktualny stan metod badawczych żywności w dziedzi-

nie mikroskopii elektronowej. [W:] Postępy w Analizie Żywności
(Tyszkiewicz S., red), tom II, Warszawa, 1990, 147-154.

7. Fornal J., Błaszczak W., Mikrostruktura a funkcjonalne właści-

wości żywności. „Przemysł Spożywczy”, 2001, 55, 8, 34-37.

8. Kaláb M., Allan-Wojtas P., Shea Miller S., Microscopy and

other imaging techniques in food structure analysis. „Trends
in Food Science and Technology”, 1995, 6, 177-185.

9. Kirby A.R., Gunning A.P., Morris V.J., Atomic force microsco-

py in food research: A new technique comes of age. „Trends
in Food Science and Technology”, 1995, 6, 359-365.

10. van de Velde F., Tromp H., What does mouth feel look like?

„Food Engineering & Ingredients”, 2002, 27, 6, 38-43.

Mikrostrukturę jogurtu oraz sera miękkiego
pokazano na fotografiach 3 i 4. Przedstawiają
one przestrzenną sieć strukturalną zbudowaną
z miceli kazeinowych. Dodatkowo na fotografii 4
można zaobserwować obecność bakterii fermen-
tacyjnych w postaci łańcuszka paciorków.
Próbki żywności o wysokiej zawartości wody
lub tłuszczu, z których trudno przygotować
preparaty do analizy z wykorzystaniem trady-
cyjnej mikroskopii SEM, mogą być obserwo-
wane po wstępnym zamrożeniu poniżej -80

(cyro-SEM). W tym przypadku niezmiernie
ważne są wielkość próbki, szybkość zamrażania
i temperatura, gdyż formowanie kryształów
lodu może w znacznym stopniu wpływać na
zmiany wyjściowej struktury materiału. Jedną
z nowszych modyfikacji SEM jest środowiskowy
(„mokry”) skaningowy mikroskop elektronowy
(ESEM). Mikroskop ten pracuje w środowisku
pary wodnej, a obraz próbki powstaje dzięki

Fot. 7. Mikrostruktura powierzchni czekolady
(A. Ptaszek, AR, Kraków).

Fot. 5. Powierzchnia ziarna skrobiowego
(F. Krok, UJ, Kraków).

Fot. 6. Mikrostruktura powierzchni czekolady
(A. Ptaszek, AR, Kraków).

Rys. 4. Schemat budowy układu tworzącego
obraz w mikroskopie sił atomowych.

Fot. 4. Mikrostruktura matrycy białkowej
sera miękkiego (J. Domagała, AR, Kraków).

Fot. 3. Mikrostruktura matrycy białkowej jogur-
tu z mleka koziego (J. Domagała, AR, Kraków).

laboratorium przemysłowe |

metody mikroskopowe w badaniach struktury...

Laboratorium |

/2005