Opracowa
ł: dr S. Wierzba
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej
Uniwersytetu Opolskiego
METODY PRZECHOWYWANIA
I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW
METODY ZAMRA
ŻANIA CZ.1
METODY ZAMRA
ŻANIA
Odporno
ść drobnoustrojów na niskie temperatury jest znacznie większa niż na wysokie
temperatury.
Redukcja OLB nast
ępuje głównie w wyniku przemian fazowych wody:
• po
żywka przechłodzona (-3
0
C) – prze
żywalność ok.. 97%,
• po
żywka zamrożona (-3
0
C) – prze
żywalność ok.. 2%
• bakterie G- bardziej wra
żliwe na niskie temperatury niż G+
• wi
ększa przeżywalność dla drobnoustrojów w fazie stacjonarnej niż logarytmicznej
• drobnoustroje patogenne i nie patogenne nie wykazuj
ą różnic pod względem
prze
żywalności
• Clostridium boutilinum nie rozwija si
ę poniżej -3,3
0
C
• Staphylococcus aureus, Sallmonella sp. – poni
żej -6,7
0
C
• dolne granice zdolno
ści rozmnażania:
• bakterie -5
¸-8
0
C
• dro
żdże -10
¸-12
0
C
• ple
śnie -12
¸-15
0
C
METODY ZAMRA
ŻANIA
Temperatury subminimalne
– ni
ższe od minimalnej temperatury wzrostu (rozmnażanie i
wi
ększość procesów metabolicznych ulega zahamowaniu), mogą być przyczyną: śmierci,
przej
ścia w stan anabiozy, zaburzeń metabolizmu:
•
subminimalne dodatnie:
„zimny szok” - krzepni
ęcie lipidów wchodzących w skład
biomembran – zaburzenia transportu:
•
szczególnie wra
żliwe G- w log fazie wzrostu
– szybkie obni
żenie temperatury do 0-5
0
C
śmierć większości komórek
•
sk
ład pożywki
:
- bogatszy sk
ład – większa wrażliwość
- ochronne dzia
łanie Mg
2+
i Ca
2+
, oraz ATP, kwasów nukleinowych, bia
łek,
aminokwasów (przenikaj
ących na zewnątrz wskutek utraty szczelności błon
biologicznych)
•
temperatura
– wi
ększa oporność bakterii hodowanych w niższych temperaturach (20
0
C)
•
subminimalne ujemne
: spadek liczebno
ści jest wynikiem:
• mechanicznego uszkodzenia - kryszta
ły lodu
• szoku osmotycznego – wzrost st
ężenia soli wywołany dehydratacją komórek
METODY ZAMRA
ŻANIA
Pod wzgl
ędem wrażliwości na
temperatury subminimalne ujemne
drobnoustroje dzielimy na:
• prze
żywające mrożenie i rozmrażanie (przetrwalniki bakterii, zarodniki grzybów),
• niewra
żliwe na zamrażanie, ale wymierające w czasie przechowywania,
• wra
żliwe na zamrażanie i wymierające w czasie przechowywania,
• nie prze
żywające procesu mrożenia niezależnie od warunków (glony, pierwotniaki)
METODY ZAMRA
ŻANIA
Schemat post
ępowania przy zamrażaniu
drobnoustrojów zaabsorbowanych na
pere
łkach szklanych, propylenowych –
wykorzystywany przy cz
ęstym pobieraniu
materia
łu
METODY ZAMRA
ŻANIA
Zamra
żanie kultur drożdży i grzybów
nitkowatych – w szklanych lub
propylenowych „s
łomkach”:
a. b. wzrost kultur na pod
łożu stałym
lub p
łynnym
c. sporz
ądzenie zawiesiny w
obecno
ści czynników ochronnych
d. nape
łnienie sterylnych „słomek”
propylenowych lub szklanych kapilar
e. wzrost grzybni na pod
łożu
agarowym z 5% glicerolem
f. g. h. nape
łnienie kapilar grzybnią
i. k. zamro
żenie w ciekłym azocie
METODY ZAMRA
ŻANIA
Utrwalanie drobnoustrojów w
warunkach beztlenowych –
konieczno
ść stosowania sterylnego,
gazu oboj
ętnego (N
2
, CO
2
)
METODY ZAMRA
ŻANIA
Wa
żnym czynnikiem w utrwalaniu drobnoustrojów jest
kontrola tempa zamra
żania
(du
ża
ilo
ść małych kryształków lodu) – znanych jest wiele metod kontrolowanego, stopniowego
zamra
żania:
• zamra
żarki – 1-2
0
C/minut
ę, do temperatury kilka stopni powyżej punktu przemiany
faz (-20/-30
0
C)
• ciek
ły azot – bardzo szybkie mrożenie, aż do przekroczenia temperatury przemiany
faz
• ewentualne ponowne wolne och
ładzanie 1
0
C/minut
ę, aż do właściwej temperatury
przechowywania
W przypadku d
ługotrwałego przechowywania (wartościowych tkanek) stosuje się
zamra
żanie w ciekłym azocie (-196
0
C), oraz
witryfikacj
ę
:
• jednostopniowe, g
łębokie zamrażanie w zawiesinie krioochronnej o bardzo dużym
ci
śnieniu osmotycznym (8 mol/dm
3
), gwa
łtowne zamrażanie - 1000
0
C/minut
ę:
• dehydratacja
• brak kryszta
łów – powstaje jednolita tafla lodu
METODY ZAMRA
ŻANIA
Zamra
żanie biopreparatów – powszechnie stosowana metoda utrwalania np. kultur
starterowych bakterii fermentacji mlekowej, dro
żdży piekarskich, zarodków zwierzęcych.
Zamra
żanie biomas mikroorganizmów:
• zamra
żarki mechaniczne od -10
0
C do -80
0
C
• ciek
łe gazy (azot -196
0
C)
Prze
żywalność mikroorganizmów uzależniona jest od:
•
rodzaju mikroorganizmów
np. Lactobacillus acidophilus
• wolne tempo (stres przedzamra
żalniczy) – mała przeżywalność
• gwa
łtowne zamrożenie z 37
0
C do -80
0
C – ma
ła przezywalność (ok.. 40%)
• wolne, stopniowe obni
żanie temperatury (adaptacja do niższych temperatur –
wst
ępna inkubacja 6h – 22
0
C, itd..) – wysoka prze
żywalność (ok.. 75%)
• oddzia
ływanie na skład lipidów ścian komórkowych, adaptacja zwiększa udział
nienasyconych kwasów t
łuszczowych, znacznie poprawia termotolerancyjność
komórek
•
warunki hodowli
• pH (Lactococcus sp.)
• pH < 5,5 znaczne obni
żenie krioodporności
• pH ok.. 6,0 mniejsza podatno
ść komórek na pogorszenie żywotności
• podwy
ższone ciśnienie osmotyczne (dehydratacja, bisynteza trehalozy)
METODY ZAMRA
ŻANIA
•
sk
ład pożywki
– udzia
ł krioprotektantów
• zewn
ątrzkomórkowych: manitol, sorbitol, dekstran, metoloceluloza, żelatyna,
• wnikaj
ących do wnętrza komórki: DMSO, alkohole polihydroksylowe
•
wiek kultury
– najodporniejsze komórki w stacjonarnej fazie wzrostu
Reakcja dro
żdży na stres temperaturowy – synteza protektorów – czynników ochronnych
komórek:
• „bia
łka szoku cieplnego” – przeciwdziałają agregacji białek o zmienionej termicznie
strukturze:
• NSR1 – warunkuj
ących syntezę mRNA w niskich temperaturach
• TIP1, TIP1/2 – reguluj
ących funkcje ściany komórkowej
• CSF1 – umo
żliwiające aktywność fermentacji w niskich temperaturach
• glikogen
• trehaloza (disacharyd) – najwa
żniejszy metabolit stresowy drożdży (szok temperaturowy,
osmotyczny), oddzia
ływuje na ściany komórkowe drożdży
METODY ZAMRA
ŻANIA
Rozmra
żanie bioproduktów
– proces zmiany stanu zawartej w nich wody i przywrócenie
produktom ich w
łasności naturalnych (poprzez doprowadzenie ciepła z zewnątrz):
• proces przebiega na zasadzie odwróconej krzywej zamra
żania,
• znacznie wolniej (ciep
ło jest doprowadzane z zewnątrz przez rozmrożoną powierzchnie o
ni
ższej przewodności cieplnej, wyższym cieple właściwym, większej gęstości)
• 3-4 krotnie zmniejszony wspó
łczynnik dyfuzyjności cieplnej (mniejsza prędkość i czas
wyrównania temperatur)
• niebezpiecze
ństwo powierzchniowego przegrzania produktu – zbyt intensywne ogrzewanie
METODY ZAMRA
ŻANIA
Przemys
łowe metody rozmrażania produktów
:
•
ogrzewanie powierzchniowe
– doprowadzenie ciep
ła do powierzchni produktu:
• w powietrzu o temperaturze 0-4
0
C (wolne)
• para wodna – powietrze w temperaturze 25-40
0
C (szybkie)
• woda lub solanka w temperaturze 4-20
0
C przez zanurzenie
• w lodzie (bardzo wolne)
• na gor
ącej metalowej powierzchni (bardzo szybkie) - kontaktowe
•
ogrzewanie wewn
ętrzne
ca
łej objętości produktu w polu elektrycznym wysokiej
cz
ęstotliwości: dielektryczne, mikrofalowe, oporowe
Ogrzewanie w powietrzu:
• 1 etap – ogrzewanie do temperatury krioskopowej na powierzchni produktu
• 2 etap – w
łaściwe rozmrażanie przemiana fazowa lodu w całej objętości produktu
Urz
ądzenia tunelowe (obieg ciepłego, wilgotnego powietrza)
METODY ZAMRA
ŻANIA
Rozmra
żanie przez ogrzewanie wewnętrzne
– produkty o jednolitej strukturze i regularnych
kszta
łtach:
•
mikrofalowe
• fale elektromagnetyczne o cz
ęstotliwości 915 i 2450 MHz, fale są absorbowane przez
substancje dielektryczne powoduj
ąc efekt grzejny
• efekt grzejny zale
ży od właściwości dielektrycznych produktów (tłuszcz, tkanka
mi
ęśniowa)
• zaletami s
ą duża równomierność nagrzewania, znaczne skrócenie czasu
rozmra
żania, możliwość kontroli przebiegu procesu i jego automatyzacji
•
dielektryczne, oporowe
– pole elektryczne jest wytwarzane przez elektrody otaczaj
ące
produkt, cz
ęstotliwość fal 27-100 MHz
• du
ża szybkość, lepsza jakość produktu w porównaniu do innych metod rozmrażania,
mo
żliwość rozmrażania wewnątrz opakowań
Rozmra
żanie drobnoustrojów:
•
łaźnia wodna 20-35
0
C
• powietrze 20
0
C i
łaźnia wodna
• wa
żne usunięcie, rozcieńczenie krioprotektantów
METODY ZAMRA
ŻANIA
Czynniki ch
łodnicze
Woda
–
środowisko chłodzące stosowane w metodach wstępnego wychładzania produktów:
• zimna woda wodoci
ągowa
• woda lodowa temperatura ok.. 0
0
C (zraszanie woda wodoci
ągową lodu)
Solanki
– wodne roztwory chlorków sodu, wapnia, magnezu:
• zakres stosowania jest ograniczony w
łaściwościami fizycznymi (punkt eutektyczny)
• NaCl
MgCl
2
CaCl
2
• zamra
żanie przez zanurzenie (ograniczenie – przenikanie soli do produktu)
METODY ZAMRA
ŻANIA
Amoniak (R717)
-33,3
0
C – du
że instalacje przemysłowe
• du
ża wydajność chłodnicza, ciepło parowania
• ma
ła rozpuszczalność w oleju (pompy olejowe)
• toksyczno
ść – dopuszczalne stężenie 0,01%
Freony
– halogenowe zwi
ązki węglowodorów nasyconych, mają różny potencjał zagrożenia
ekologicznego (stopniowo wycofywane z u
życia), duża sprawność, rozpuszczają olej:
• CFC – w pe
łni halogenowe związki węgla (chlorofluorokarbony), wszystkie atomy
wodoru zast
ąpione chlorem i fluorem np.. R12 (CF
2
Cl
2
) wydajno
ść ok.. 35% mniejsza
ni
ż amoniak, duże zagrożenie ekologiczne, wycofany z użycia,
• HCFC – wodorochlorofluorokarbony, nie wszystkie atomy wodoru zast
ąpione chlorem
i fluorem np.. R22 (CHF
2
Cl) wydajno
ść zbliżona do amoniaku, powszechnie stosowany
zamiennik R12,
• HFC – wodorofluorokarbony, cz
ęść atomów wodoru zastąpiona fluorem np. R134a
(CH
2
FCF
3
), nieco mniejsza wydajno
ść w porównaniu do R22, przewidziany jako
g
łówny zamiennik R12,
• FC – w
ęglowodory w pełni halogenowe, wszystkie atomy wodoru zastąpione fluorem
Ciek
ły azot (LIN):
-195,8
0
C, z uwagi na bardzo nisk
ą sprawność procesu (ok.. 10-krotnie
mniejsza ni
ż w przypadku amoniaku) stosuje się na małą skalę do celów specjalnych, lub w
kombinacji z tradycyjnymi metodami
Ciek
ły dwutlenek węgla (LIC)
pod ci
śnieniem 2MPa, temperatura -20/-30
0
C,
• wspó
łczynnik wnikania ciepła ok.. 2-krotnie mniejszy niż w LN
2
• d
łuższy czas zamrażania
• korzystny pod wzgl
ędem ekonomicznym