Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (4) 2007
WPŁYW ANTYBIOTYKÓW NA EKSPLANTATY TRUSKAWKI
W KULTURACH IN VITRO
M
ARIA
K
OWALIK
,
M
ARTYNA
G
RÓDEK
Akademia Rolnicza
Katedra Ochrony Roślin
Al. 29 Listopada 54, 31-425 Kraków
mkowalik@ogr.ar.krakow.pl
I. WSTĘP
Stale wzrastające zapotrzebowanie na zdrowy materiał rozmnożeniowy narzuca ko-
nieczność stosowania antybiotyków w kulturach in vitro (Zenkteler 2001). W kulturach
in vitro, właściwy efekt leczniczy gwarantuje prawidłowo dobrany antybiotyk w odpo-
wiednim stężeniu, o dobrej rozpuszczalności, stabilny w pożywce, nie indukujący od-
porności, bez działań ubocznych, nie toksyczny dla tkanek roślinnych (Falkiner 1997),
a jednocześnie pozwalający uzyskać eksplantaty wolne od zakażeń mikrobiologicznych
i o prawidłowej zdolności regeneracyjnej.
Celem pracy było zbadanie wpływu antybiotyków na rozwój mikrorozmnażanej tru-
skawki i określenie możliwości ich zastosowania w kulturach in vitro.
II. MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły eksplantaty truskawki Elsanta, regenerujące w stadium
namnażania i ukorzeniania. Testowano 5 rodzajów antybiotyków, w 3 stężeniach, wpro-
Tabela 1. Wysokość stężeń antybiotyków [mg/dm
3
pożywki M-S]
Table 1. Concentrations of antibiotics [mg/dm
3
of the M-S medium]
Stężenie – Concentration
Antybiotyk – Antibiotic
C
1
C
2
C
3
Ampicylina – Ampicilin
50
100
150
Gentamycyna – Gentamycin
2,5
5,0
7,5
Neomycyna – Neomycin
25
50
75
Nystatyna – Nystatin
25
50
75
Streptomycyna – Streptomycin
50
100
150
C1, C2, C3 – stężenia antybiotyków [mg/dm
3
pożywki M-S]
C1, C2, C3 – concentrations of antibiotics [mg/dm
3
of the medium M-S]
Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (4) 2007
168
wadzonych do pożywki Murashige-Skooga (tab. 1). Kombinację kontrolną stanowiła
pożywka bez antybiotyków.
Określono wpływ antybiotyków na występowanie zakażeń mikrobiologicznych.
Analizowano objawy fitotoksyczności, zaburzeń wzrostu i rozwoju roślin, uwzględnia-
jąc liczbę rozet, liczbę i długość pędów oraz liczbę, długość i grubość korzeni. W po-
szczególnych kombinacjach uwzględniono 20 eksplantatów. Ogółem przeanalizowano
640 eksplantatów.
Obliczenia statystyczne wykonano za pomocą analizy wariancji dla doświadczeń
dwuczynnikowych według programu STAT. Istotność różnic obliczono za pomocą testu
t-Studenta, przy α = 0,05.
III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W kulturach in vitro truskawki, po zastosowaniu antybiotyków: ampicyliny, genta-
mycyny, neomycyny, nystatyny oraz streptomycyny (w trzech stężeniach) nie stwier-
dzono zakażeń powodowanych przez bakterie. W kombinacjach ze streptomycyną wy-
stąpiły zakażenia powodowane przez grzyby rodzaju Penicillium na 5 do 15% eksplan-
tatów w stadium namnażania.
Stwierdzono toksyczne oddziaływanie gentamycyny i streptomycyny (w badanych
stężeniach) na eksplantaty truskawki na etapie namnażania i ukorzeniania. Objawy
wystąpiły w postaci chloroz, mozaik, brunatnienia, zasychania oraz deformacji roślin.
Początkowo objawy miały charakter blado-żółtych przebarwień na blaszkach liścio-
wych, w czwartym tygodniu pasażu przebarwienia barwy biało-żółtej i różowej obej-
mowały blaszki liściowe i łodygi wszystkich roślin w kombinacji. Chlorozę obserwo-
wano częściej po zastosowaniu gentamycyny, a mozaiki – streptamycyny. Liście i pędy
były kruche, brunatniały i zasychały. Deformacje blaszek liściowych stwierdzono
w kombinacjach z gentamycyną. Na etapie ukorzeniania, rośliny truskawki na pożywce
z gentamycyną wykazywały całkowity brak korzeni.
Zastosowane antybiotyki w różny sposób wpływały na rozwój mikrorozmnażanych
roślin. Stwierdzono, że we wszystkich kombinacjach liczba rozet była niższa, niż
w kontroli. Najwięcej rozet uzyskano w kombinacji z neomycyną w stężeniu C
1
. Ko-
rzystnie na tworzenie rozet oddziaływały ampicylina i nystatyna, we wszystkich kombi-
nacjach. Niekorzystny wpływ gentamycyny udokumentowano statystycznie (tab. 2).
Na etapie namnażania najwięcej pędów uzyskano w kombinacji z ampicyliną w stę-
żeniu C
1
. Ampicylina zastosowana w tym stężeniu stymulowała powstawanie pędów
również na etapie ukorzeniania. Najmniej korzystna okazała się gentamycyna. Stwier-
dzono istotny statystycznie wpływ antybiotyków i ich stężeń na długość pędów. Naj-
dłuższe pędy uzyskano z neomycyną na etapie namnażania oraz ampicyliną i neomycy-
ną na etapie ukorzeniania. W przypadku fitotoksycznej gentamycyny i streptomycyny
udokumentowano istotny wpływ antybiotyków na długość pędów na etapie ukorzenia-
nia (tab. 3).
Tworzenie korzeni stymulowały ampicylina, neomycyna oraz nystatyna, zaś
w kombinacji z gentamycyną rośliny nie wytworzyły korzeni. W kombinacjach z ampi-
cyliną i neomycyną stwierdzono, generalnie, dłuższe i grubsze korzenie, niż w kontroli
(tab. 4).
Wpływ antybiotyków na eksplantaty truskawki
169
Tabela 2. Wpływ antybiotyków na liczbę rozet, liczbę i długość pędów truskawki na etapie nam-
nażania
Table 2. Effect of antybiotics on the number of rosettes and the number and length of strawberry
shoots at the proliferation stage
Liczba rozet [szt.]
Number of rosettes [No.]
Liczba pędów [szt.]
Number of shoots [No.]
Długość pędów
Length of shoots
[mm]
Antybiotyk
Antibiotic
Stężenie
Concentration
C
1
C
2
C
3
C
1
C
2
C
3
C
1
C
2
C
3
Ampicylina
Ampicilin
7,35
defg
10,0
fg
9,25
fg
6,25
h
5,47
g
4,67
def
12,45
bc
11,47
abc
14,32
cd
Gentamycyna
Gentamycin
1,15
ab
1,05
a
1,1
a
3,4
bc
3,0
ab
2,57
a
14,27
cd
10,8
ab
9,17
a
Neomycyna
Neomycin
10,5
gh
4,55
bcde
4,4
abcd
4,77
defg
4,77
defg
4,37
de
14,37
cd
13,42
bc
16,8
d
Nystatyna
Nystatin
7,45
defg
6,75
cdef
8,35
fg
5,2
fg
5,37
fg
5,2
fg
11,82
abc
12,75
bc
10,37
ab
Streptomycyna
Streptomycin
7,85
efg
3,75
abc
1,6
ab
5,07
efg
4,95
efg
4,12
cd
11,47
abc
10,47
ab
11,4
ab
Kontrola
Control
13,75 h
4,82 defg
13,2 bc
Liczby oznaczone identycznymi literami oznaczają różnice nieistotne (α = 0,05)
Mean values marked by the same letter do not differ significantly (α = 0.05)
Tabela 3. Wpływ antybiotyków na liczbę i długość pędów truskawki na etapie ukorzeniania
Table 3. Effect of antybiotics on the number and length of strawberry shoots at the stage of
rooting
Liczba pędów [szt.]
Number of shoots [No.]
Długość pędów
Length of shoots
[mm]
Antybiotyk – Antibiotic
Stężenie – Concentration
C
1
C
2
C
3
C
1
C
2
C
3
Ampicylina – Ampicilin
4,6 gh
3,6 bc
4,4 efg
32,62 de 34,9 e
34,05 de
Gentamycyna – Gentamycin
2,25 a
2,05 a
2,55 a
12,6 ab
15,17 ab 11,12 a
Neomycyna – Neomycin
4,5 fgh
3,95 cde 4,0 cdef
32,82 de 34,25 de 35,0 e
Nystatyna – Nystatin
4,1 cdefg 3,85 cd
4,35defg 32,2 de
29,2 cd
25,32 c
Streptomycyna – Streptomycin 3,7 bc
3,6 bc
3,3 b
17,32 b 16,6 ab
12,67 ab
Kontrola
Control
4,95 h
32,3 de
Liczby oznaczone identycznymi literami oznaczają różnice nieistotne (α = 0,05)
Mean values marked by the same letter do not differ significantly (α = 0.05)
Za najbardziej przydatne antybiotyki w mikrorozmnażaniu truskawki uznano:
ampicylinę w stężeniu 50–150 mg/dm
3
, nystatynę 25–50 mg/dm
3
oraz neomycynę
25–75 mg/dm
3
wprowadzone do pożywki Murashige-Skooga.
Antybiotyki te elimino-
Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (4) 2007
170
wały zakażenia powodowane przez bakterie i grzyby oraz korzystnie wpływały na two-
rzące się rozety, pędy i korzenie truskawki.
Tabela 4. Wpływ antybiotyków na liczbę, długość i grubość korzeni truskawki na etapie ukorze-
niania
Table 4. Effect of antybiotics on the number, length and thickness of strawberry roots at the
stage of rooting
Liczba korzeni [szt.]
Number of roots [No.]
Długość korzeni
Length of roots
[mm]
Grubość korzeni
Tickness of roots
[mm]
Antybiotyk
Antibiotic
Stężenie
Concentration
C
1
C
2
C
3
C
1
C
2
C
3
C
1
C
2
C
3
Ampicylina
Ampicilin
9,45
ef
9,15
ef
8,75
ef
57,0
ef
55,12
def
60,65
f
2,85
bcd
2,65
bcd
2,8
bcd
Gentamycyna
Gentamycin
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
0,0
a
Neomycyna
Neomycin
7,95
de
9,6
ef
9,65
f
51,0
bcde
48,32
bcd
53,65
cdef
2,85
bcd
3,15
d
2,9
b
Nystatyna
Nystatin
10,1
f
9,0
ef
6,0
c
46,1
bc
45,7
bc
44,72
b
3,1
cd
2,75
bcd
1,9
b
Streptomycyna
Streptomycin
4,05
b
1,65
a
0,55
a
1,8
a
1,22
a
0,3
a
0,7
a
0,35
a
0,2
a
Kontrola
Control
6,75 cd
50,92 bcde
2,1 bc
Liczby oznaczone identycznymi literami oznaczają różnice nieistotne (α = 0,05)
Mean values marked by the same letter do not differ significantly (α = 0.05)
Wykazano, że streptomycynę i gentamycynę należy wykluczyć ze stosowania
w kulturach in vitro truskawki, ze względu na fitotoksyczność oraz niekorzystny wpływ
na rozwój pędów i systemu korzeniowego truskawki.
O przydatności antybiotyków w uzyskiwaniu kultur in vitro wolnych od zakażeń
powodowanych przez grzyby i bakterie, ale cechujących się wysokim współczynnikiem
namnażania i dobrymi parametrami wzrostu i rozwoju piszą Buckley i Reed (1994).
W niniejszych badaniach potwierdzono przydatność ampicyliny i nystatyny, którą sto-
sowano w kulturach in vitro syningii (Kowalik i Reby 2006), natomiast uzyskane wyni-
ki co do przydatności gentamycyny i streptomycyny, wskazują, że konieczny jest indy-
widualny dobór antybiotyków w kulturach in vitro, uwzględniający rodzaj eksplantatu.
IV. LITERATURA
Buckley P.M., Reed B.M. 1994. Antibiotic suscceptibility of plant-asociated bacteria. Hort. Sci.
25 (5), s. 434.
Falkiner F.R. 1997. Antibiotics in plant tissue culture and micropropagations. s. 155–161.
W: ,,Pathogen and Microbial Contamination Management in Micropropagation” (A.C. Cas-
sells, red.). Kluwer Acad. Publ., 371 ss.
Wpływ antybiotyków na eksplantaty truskawki
171
Kowalik M., Reby E. 2006. Wpływ antybiotyków na eksplantaty Sinningia x hybrida w kulturach
in vitro. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 46 (2): 124–127.
Zenkteler E. 2001. Materiał rozmnożeniowy o wysokiej jakości. s. 273–291. W: ,,Biotechnologia
Roślin” (S. Malepszy, red.). PWN, Warszawa, 608 ss.
M
ARIA
K
OWALIK
,
M
ARTYNA
G
RÓDEK
AN INFLUENCE OF SELECTED ANTIBIOTICS ON EXPLANTS
OF STRAWBERRY IN CULTURES IN VITRO
SUMMARY
The effects of ampicilin, gentamycim, neomycin, nystatin and streptomycin on the occurrence
of fungal and bacterial infections and on the regeneration of strawberry were investigated. It was
ascertained that the antibiotics eliminated the infections, except streptomycin. Ampicilin, nystatin
and neomycin were found useful. They did not affected the regeneration abilities of strawberry
and stimuleted the developing rosettes, shoots and roots. It was proved that streptomycin and
gentamycin should not be used in in vitro strawberry cultures.
Key words: antibiotics, phytotoxicity, in vitro, strawberry