Ćwiczenie nr 3,4
dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII
ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS.
I. Charakterystyka mikrobiologiczna bakterii At. ferrooxidans.
Gramujemne bakterie wyodrębnione przez Colmera i Hinkla w 1947r. Kształt krótkich pałeczek o rozmiarach 0,4
μm – 0,7-1,1 μm z jedną polarną rzęską. Błona komórkowa ma liczne wewnątrzkomórkowe wgłębienia. Bakterie te
posiadają zdolność utleniania różnych związków siarki, a nawet siarki elementarnej do jonów siarczanowych.
Spośród związków siarki jony S
2
O
3
2-
i S
2-
są utleniane najszybciej. Najbardziej charakterystyczne dla tych bakterii
jest utlenianie jonów Fe
2+
w środowisku H
+
do Fe
3+
gdyż ilość energii wydzielająca się w tej reakcji jest większa od
ilości energii wydzielającej się w czasie utleniania S
2
O
3
2-
czy S
2-
.
4FeSO
4
+ 2H
2
SO
4
+ O
2
→ 2Fe
2
(SO
4
)
3
+ 2H
2
O
ΔH 30
0
C = -38 kJxmol
-1
Bakterie te utleniają również siarczki metali, w których utlenieniu ulega zarówno S
2-
do SO
4
2-
jak i jon metalu. At.
ferrooxidans należą do chemoautotrofów. Reakcje utleniania jonów Fe
2+
i jonów S
2-
sprzężone są z reakcjami
fosforylacji i energia magazynowana jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Energia ta jest następnie
wykorzystywana do chemolizy wody. Powstający przy tym czynnik zredukowany [H], redukuje produkt asymilacji
CO
2
. Czynnik utleniony [OH], redukowany jest przez ten sam związek nieorganiczny. Rozwój At. ferrooxidans
najlepiej przebiega przy pH około 2-2,5 a zanika przy pH = 4,5 . Optymalna temperatura wzrostu 28-37
0
C ,
powyżej 65
0
C ulegają zniszczeniu. Ponieważ są to bakterie aerobowe ich hodowla wymaga ciągłego
napowietrzania .
II. Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii At. ferrooxidans.
Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9g
żelaza w 1dm
3
roztworu.
Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory,
w proporcji 7: 3 (I i II roztwór).
I roztwór
(NH
4
)
2
SO
4
- 0,6 g
KCl
- 0,02 g
K
2
HPO
4
- 0,1 g
MgSO
4
x 7H
2
O
- 0,1 g
Ca(NO
3
)
2
- ślad
H
2
O
- 140 cm
3
Pożywkę sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie.
II roztwór
FeSO
4
x 7H
2
O
- 8,84 g
10n H
2
SO
4
- 0,2 cm
3
H
2
O
- 60 cm
3
Pożywkę sterylizuje się przesączając przez lejek Schotta G-5.
III. Wykonanie ćwiczenia.
1. Sporządzić roztwór II w kolbie stożkowej o pojemności 250-300 cm
3
. Do przygotowanego roztworu II
dolać roztwór I (dostarczony przez prowadzącego) i całość wymieszać.
2. Do dwóch sterylnych kolb o poj. 250-300 cm
3
rozlać po 100 cm
3
przygotowanej wcześniej pożywki 9K.
Do nalewania pożywki używać cylindrów miarowych.
3. Do jednej kolby wprowadzić 2 cm³ aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans - HODOWLA. Do drugiej
kolby wprowadzić niewielką ilość sproszkowanego tymolu – KONTROLA.
Do pobierania hodowli bakteryjnej używać sterylnych pipet.
Kolby zatkać korkami z waty lub ligniny, które należy wykonać samemu.
