Ćwiczenie nr 3,4

dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska

Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego

OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII

ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS.

I. Charakterystyka mikrobiologiczna bakterii At. ferrooxidans.

Gramujemne bakterie wyodrębnione przez Colmera i Hinkla w 1947r. Kształt krótkich pałeczek o rozmiarach 0,4
μm – 0,7-1,1 μm z jedną polarną rzęską. Błona komórkowa ma liczne wewnątrzkomórkowe wgłębienia. Bakterie te
posiadają zdolność utleniania różnych związków siarki, a nawet siarki elementarnej do jonów siarczanowych.
Spośród związków siarki jony S

2

O

3

2-

i S

2-

są utleniane najszybciej. Najbardziej charakterystyczne dla tych bakterii

jest utlenianie jonów Fe

2+

w środowisku H

+

do Fe

3+

gdyż ilość energii wydzielająca się w tej reakcji jest większa od

ilości energii wydzielającej się w czasie utleniania S

2

O

3

2-

czy S

2-

.

4FeSO

4

+ 2H

2

SO

4

+ O

2

→ 2Fe

2

(SO

4

)

3

+ 2H

2

O

ΔH 30

0

C = -38 kJxmol

-1

Bakterie te utleniają również siarczki metali, w których utlenieniu ulega zarówno S

2-

do SO

4

2-

jak i jon metalu. At.

ferrooxidans należą do chemoautotrofów. Reakcje utleniania jonów Fe

2+

i jonów S

2-

sprzężone są z reakcjami

fosforylacji i energia magazynowana jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Energia ta jest następnie
wykorzystywana do chemolizy wody. Powstający przy tym czynnik zredukowany [H], redukuje produkt asymilacji
CO

2

. Czynnik utleniony [OH], redukowany jest przez ten sam związek nieorganiczny. Rozwój At. ferrooxidans

najlepiej przebiega przy pH około 2-2,5 a zanika przy pH = 4,5 . Optymalna temperatura wzrostu 28-37

0

C ,

powyżej 65

0

C ulegają zniszczeniu. Ponieważ są to bakterie aerobowe ich hodowla wymaga ciągłego

napowietrzania .

II. Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii At. ferrooxidans.

Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9g
żelaza w 1dm

3

roztworu.

Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory,
w proporcji 7: 3 (I i II roztwór).

I roztwór
(NH

4

)

2

SO

4

- 0,6 g

KCl

- 0,02 g

K

2

HPO

4

- 0,1 g

MgSO

4

x 7H

2

O

- 0,1 g

Ca(NO

3

)

2

- ślad

H

2

O

- 140 cm

3

Pożywkę sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie.

II roztwór
FeSO

4

x 7H

2

O

- 8,84 g

10n H

2

SO

4

- 0,2 cm

3

H

2

O

- 60 cm

3

Pożywkę sterylizuje się przesączając przez lejek Schotta G-5.

III. Wykonanie ćwiczenia.

1. Sporządzić roztwór II w kolbie stożkowej o pojemności 250-300 cm

3

. Do przygotowanego roztworu II

dolać roztwór I (dostarczony przez prowadzącego) i całość wymieszać.

2. Do dwóch sterylnych kolb o poj. 250-300 cm

3

rozlać po 100 cm

3

przygotowanej wcześniej pożywki 9K.

Do nalewania pożywki używać cylindrów miarowych.

3. Do jednej kolby wprowadzić 2 cm³ aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans - HODOWLA. Do drugiej

kolby wprowadzić niewielką ilość sproszkowanego tymolu – KONTROLA.

Do pobierania hodowli bakteryjnej używać sterylnych pipet.
Kolby zatkać korkami z waty lub ligniny, które należy wykonać samemu.

Ćwiczenie nr 3,4

dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska

Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego

4. Opisać kolby wg wzoru:

HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych
bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.

5. W obydwu kolbach oznaczyć zawartość jonów Fe

2+

i Fe

3+

metodą podaną poniżej. Po wykonaniu

pomiarów, opisane kolby odstawić na miejsce wskazane przez prowadzącego.

6. Oznaczenie powtórzyć po tygodniu. Po zakończeniu ćwiczenia należy umyć używane szkło laboratoryjne.

Wyniki muszą być podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylać
zawartość kolb i umyć je.

Sprawozdanie do ćwiczenia:

7. Na podstawie uzyskanych wyników przedstawić na wykresie zmianę zawartości jonów Fe

2+

i Fe

3+

w

obydwu układach.

8. Znając ilość utlenionego przez bakterie żelaza (wykresy) obliczyć ilość energii zmagazynowanej w ATP, w

oparciu o równanie reakcji utleniania żelaza. Obliczenia można wykonać dla żelaza Fe

2+

lub Fe

3+

.

IV. Oznaczanie zawartości jonów Fe

2+

i Fe

3+

.

1. Oznaczenie przeprowadzić metodą kompleksometryczną, miareczkując roztwór z jonami żelaza roztworem

EDTA wobec wskaźnika, którym jest roztwór kwasu sulfosalicylowego.

2.

Do każdej z dwóch starannie umytych kolb stożkowych o pojemności 50 cm

3

wprowadzić po 1 cm

3

hodowli i po 10cm

3

wskaźnika (jeżeli w roztworze są obecne jony Fe

3+

powinien się on zabarwić na kolor

fioletowy). Kolby ogrzewać do początku wrzenia roztworów, a następnie gorące roztwory miareczkować
0,025M roztworem EDTA do odbarwienia z koloru fioletowego na słomkowy. Zanotować ilości a cm

3

EDTA. Następnie do kolb dodać nadsiarczanu amonu do zmiany barwy na fioletową i powtórnie
miareczkować EDTA do odbarwienia – b cm

3

.

Ilość nadsiarczanu amonu powinna być tak dobrana, żeby po zakończonym miareczkowaniu i
wprowadzeniu niewielkiej ilości utleniacza barwa roztworu nie uległa zmianie.

3. Powyższe czynności powtórzyć dla próby kontrolnej.

4.

Ze wzorów obliczyć zawartość jonów Fe

2+

i Fe

3+

w 1 dm

3

badanego roztworu:

A g/dm

3

Fe

3+

= a cm

3

x 1.396

B g/dm

3

Fe

2+

= b cm

3

x 1.396

UWAGA!!!

roztwory pobierać sterylnymi pipetami

V. Zag

adnienia teoretyczne:

1. Charakterystyka bakterii At. ferrooxidans.
2. Autotrofizm.
3. Chemosynteza.
4. Sposoby odżywiania bakterii.
5. Miareczkowanie kompleksometryczne.
6. Umiejętność wyliczania ilości utlenionego żelaza.

VI. Literatura:

1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
2. Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
3. Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
4. Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedź – czytelnia (B.W. ul. Oleska).