Układy grupowe krwinek czerwonych

Antygeny erytrocytów – 23 układy.

Układy grupowe cechuje:

✔

duża immunogenność

✔

częste występowanie naturalnych przeciwciał

➔

Antygeny grupowe są związane z różnymi strukturami błony krwinki czerwonej (białka
błony zawierają liczne reszty cukrowe (glikoproteiny) i lipidowe (lipoproteiny) będące
nośnikami większości antygenów grupowych krwi.

➔

Swoistość antygenów grupowych krwinek zależy od rodzaju cząsteczki cukru lub białka
obecnego w błonie krwinki.

➔

Immunogenność (mierzona zdolnością indukcji przeciwciał u biorcy, zależy od:

1. chemicznej budowy antygenu, przy czym glikoproteiny i lipoproteiny są silniejszymi

antygenami niż proste polipeptydy

2. gęstości determinant antygenowych na powierzchni erytrocytu.

Układ Grupowy ABO

Antygeny układu ABO

➔

na powierzchni krwinek czerwonych i na pozostałych komórkach organizmu, z wyjatkiem
neuronów.

➔

układ po raz pierwszy opisano w roku 1909 przez Landsteinera – nagroda Nobla

➔

współcześnie używane nazewnictwo – Ludwik Hirszfeld

➔

Synteza antygenów układu ABO pozostaje pod kontrolą co najmniej 3 niezależnych locus
(miejsc) zawierających jeden z poniższych alleli:

1. H lub h
2. A

1

, A

2

, B i 0

3. Se i se

➔

Swoistość antygenu warunkuje cukier zajmujący ostatnią pozycję łańcucha

➔

Dwie potencjalne cząsteczki prekursorów antygenów AB0, typ I i II, które zawierają
identyczne reszty cukrowe.
Różni je wiązanie pomiędzy końcowymi resztami cukrowymi łańcucha:

1. prekursor typu I – galaktoza połączona z N-acetyloglukozoaminą wiązaniem α(1→3)-

glikozydowym

2. prekursor typu II – te same cukry wiążą się wiązaniem α(1→4)-glikozydowym.

➔

Krwinki czerwone – wyłącznie typ II łańcucha

➔

Pozostałe komórki organizmu – typ I i II

Powstawanie antygenów układu grupowego ABO:

1. końcowa galaktoza łańcucha II + cząst. fukozy

antygen H (0)

2. końcowa galaktoza łańcucha I + cząst. fukozy

antygen H (0)

3.

antygen H(0)

+ reszta N-acetylogalaktozoamina

antygen grupowy A

4.

antygen H(0)

+ cząsteczka galaktozy

antygen grupowy B

transferaza H

transferaza Se

transferaza A

transferaza B

➔

Transferazy (przenoszące reszty cukrowe na końcowe miejsce łańcucha prekursorowego
kodowane są przez geny warunkujące posiadanie odpowiedniego antygenu grupowego:

1. Gen H (FUT1, locus H) – transferazę H
2. Gen A – transferazę A
3. Gen B – transferazę B
4. Gen Se – synteza fukozylotransferazy (FUT2), ktora wykazuje duże powinowactwo do

łańcucha prekursorowego typu I – głównie na powierzchni nabłonków.

➔

Antygeny układu ABO – 6 tydzień życia płodowego, pełna ekspresja w 6 – 18 m-cy po
urodzeniu.

➔

Poszczególne antygeny układu ABO maja wiele odmian, z których największe znaczenie ma
grupa A

1

(z silnym antygenem – 80%) i A

2

(słabiej wyrażony antygen – czterokrotnie mniej

determinant antygenowych na powierzchni krwinek czerwonych – 20%).

Przeciwciała układu ABO

➔

Przeciwciała „naturalne”, fizjologiczne (powstają bez uprzedniego kontaktu z antygenem),
głównie klasa IgM (nie przechodzą przez łożysko), zwykle mają charakter kompletnych
aglutynin o optimum działania w zakresie temperatur 4-20

0

C (wywołują aglutynację) –

występują regularnie u osób nie mających odpowiedniego antygenu, np.
anty-A u osób z grupą krwi B,
anty-B w grupie krwi A,
anty-A+anty-B w grupie krwi 0 – klasa IgG
całkowity brak przeciwciał przeciwko substancjom grupowym – grupa krwi AB

➔

Przeciwciała odpornościowe – powstają w wyniku immunizacji antygenami grupowymi,
należą do klasy IgG i IgM; mają najczęściej charakter niekompletnych przeciwciał
(opłaszczające, ale nie aglutynujace), optimum działania w 37

0

C.

➔

Wytwarzanie przeciwciał – zaraz po urodzeniu;

•

do 3-6 m-ca miano zbyt niskie, aby mogło zostać wykryte

•

największe stężenie – między 5 a 10 rokiem życia

➔

Anty-H – u ludzi, którzy nie mają łańcucha H na powierzchni erytrocytu (nosiciele antygenu
A

1

i/lub B oraz posiadacze niezwykle rzadkiej grupy krwi Bombay (0

h

) (nie mają aktywnej

fukozylotransferazy na skutek mutacji genu grupowego H).

Układ grupowy Rh (Rhesus)

➔

Antygen wyizolowany od małp Rhesus

➔

Antygeny Rh:
6 tydzień życia płodowego
znajdują się wyłącznie na krwinkach czerwonych
kodowane przez 2 wysoce homologiczne leżące blisko siebie locus: RHD – antygen D i G

RHCE – antygeny C, c
E i e.

➔

Antygeny D – peptyd D, najważniejszy, najsilniej immunogenny

➔

'Rh +' - krwinki zawierają antygen D

➔

'Rh -' - brak antygenu D (20%) - brak locus RHD w genomie

➔

słaby antygen D (nazywany wcześniej D

u

) – występuje u około 1% osób pierwotnie

sklasyfikowanych jako Rh ujemne; prawidłowy gen RHD, na erytrocytach mniejsza liczba
cząsteczek polipeptydu D.

Przeciwciała anty-Rh

➔

powstają w wyniku uczulenia w czasie ciąży lub po przetoczeniu krwi niezgodnej w
układzie Rh

➔

przeciwciała odpornościowe, niekompletne, zlepiające krwinki w środowisku koloidowym
(albumina); reakcja może być wzmocniona przez nadtrawienie krwinek enzymami: papaina,
trypsyna, ficyna.

Stymulacja antygenem swoiste IgM IgG

➔

przeciwciała anty-Rh należą zwykle do podklasy IgG1, słabo wiążą dopełniacz i mogą
długo utrzymywać się w krążeniu.

Oznaczanie grup krwi

Na podstawie obecności antygenu A i B w erytrocytach ludzkich można wyróżnić 4 grupy

krwi: A, B, AB i 0.

Grupa 0 oznacza brak w erytrocytach antygenów A i B, ale erytrocyty te zawierają

substancję H.

➔

Układ AB0 i Rh.

➔

Oznaczanie antygenów A i B w badanych krwinkach: przy użyciu wzorcowych surowic oraz
przeciwciała grupowe za pomocą wzorcowych krwinek. Wykonuje się również (w
przypadku transfuzji krwi) reakcję między krwinkami dawcy a surowicą biorcy – tzw. próba
krzyżowa.

➔

Określanie (typowanie) grup krwi – hemaglutynacja (metody serologiczne wykrywania
antygenów na powierzchni komórek z użyciem odpowiednich surowic).

Określanie grup krwi za pomocą wzorcowych surowic

Grupa

krwi

anty-B

anty-A

anty-A+B

A

-

+

+

B

+

-

+

AB

+

+

+

0

-

-

-

Oznaczanie grup krwi za pomocą wzorcowych krwinek

Grupa krwi

A

B

0

A

-

+

-

B

+

-

-

AB

-

-

-

0

+

+

-

2-3 tyg.

Czynniki wpływające na szybkość i wydajność łączenia się przeciwciał z antygenami
erytrocytu:

➢

pH środowiska reakcji

➢

siła jonowa (zmniejszona)

➢

temperatura

➢

dodatek substancji ułatwiających reakcję:

•

Albumina – obecność w środowisku reakcji ułatwia aglutynację krwinek w zawiesinie
(wprowadza ładunek ujemny do chmury kationowej otaczającej erytrocyt)

•

Podłoża zawierające żele

•

Protamina – przyspiesza aglutynację neutralizując ujemny ładunek powierzchni erytrocytów

•

Trawienie enzymami erytrocytów (papaina, ficyną czy bromeliną) – usuwa reszty kwasu
sjalowego – zmniejsza liczbę ładunków ujemnych (wykrywanie przeciwciał anty-Rh)

Przeciwciała niekompletne (IgG) opłaszczają krwinki, ale nie są w stanie związać sąsiednich
krwinek – metoda Coombsa (

zwłaszcza przeciw antygenowi D układu Rh)

BOC (Bezpośredni Odczyn Coombsa) – wykrywa przeciwciała niekompletne obecne in vivo na

krwinkach osoby badanej. Badanie polega na dodaniu do zawiesiny krwinek badanych w
fizjologicznym roztworze NaCl surowicy odpornościowej antygammaglobulinowej
(poliwalentnej). Jeśli krwinki były opłaszczone przeciwciałami zostaną zlepione w wyniku
reakcji z surowicą antygammaglobulinową.

POC (Pośredni Odczyn Coombsa) – pozwala na wykrycie przeciwciał niekompletnych obecnych

w surowicy osoby badanej, ale nie opłaszczających krwinek. Badanie polega na wstępnej
inkubacji surowicy badanej z krwinkami wzorcowymi o określonym fenotypie, np. grupy 0
Rh(+), podczas której zachodzi opłaszczenie krwinek przeciwciałami i następczej reakcji z
surowicą antygammaglobulinową – zawierającą przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG i
składnikowi C3 dopełniacza.

Oznacza się również miano poszukiwanych przeciwciał przez wykonanie serii rozcieńczeń
surowicy badanej.

Maksymalne rozcieńczenie badanej surowicy, przy którym występuje jeszcze

aglutynacja krwinek wzorcowych, nazywa się mianem przeciwciał.

Próba krzyżowa – próba zgodności

➔

przetaczanie krwi – zgodność krwi dawcy z krwią biorcy w zakresie układu AB0 i antygenu
D układu Rh.

➔

powinna obejmować następujące badania:

•

badanie surowicy biorcy na zdolność aglutynacji lub hemolizy krwinek dawcy (w 0,85%
NaCl, w środ. koloidowym, w środ. papainy – 37

0

C)

•

badanie surowicy dawcy na zdolność aglutynacji lub hemolizy krwinek biorcy (w tych
samych warunkach)

•

oznaczanie antygenu D układu Rh w krwinkach biorcy (metoda papainowa)

•

badanie surowicy biorcy z krwinkami dawcy – metoda pośredniego odczynu Coombsa.

Wynik badania

•

brak hemolizy i aglutynacji – próba krzyżowa zgodna, krew kwalifikuje się do przetoczenia

•

obecność aglutynacji lub hemolizy w którymkolwiek z odczynów – niezgodność krwi
dawcy i biorcy

•

przetoczenie krwi niezgodnej w układzie AB0 – przeciwciała przeciw antygenom układu

AB0
IgM aglutynacja, aktywacja dopełniacza i hemoliza wewnątrznaczyniowa, ciężki
odczyn poprzetoczeniowy (gorączka, spadek ciśnienia tętniczego krwi, nudności, wymioty,
bóle pleców, klatki piersiowej, bezpośrednie zagrożenie życia chorego).

Konflikt serologiczny matczyno-płodowy (choroba hemolityczna noworodków – CHN)

Może obejmować:

1. antygeny układu Rh
2. antygeny układu AB0
3. inne antygeny – rzadko

Ad 1

•

ryzyko CHN – matka Rh

-

uczulona przeciw Rh

+

, ponownie nosi płód Rh

+

•

uczulenie matki – w czasie ciąży w wyniku przecieku krwi dziecka do krwi matki, w czasie
porodu, poronienia (antygeny erytrocytów noworodka są rozpoznawane przez układ
immunologiczny matki, który wytwarza przeciw nim przeciwciała klasy IgG, przeciwciała
reagują z erytrocytami płodu – zniszczenie erytrocytów płodu – pojawia się niedokrwistość i
żółtaczka hemolityczna)

•

pierwsze niezgodne grupowo dziecko – zdrowe

•

kolejne dzieci – rosnące ryzyko choroby, w miarę jak matka ulega ponownemu uczuleniu
przy każdej kolejnej ciąży.

•

profilaktyka – podanie gotowych przeciwciał anty-RhD matkom Rh

-

w czasie ciąży lub

natychmiast po urodzeniu dziecka RhD

+

- zniszczenie płodowych erytrocytów Rh

+

zanim

spowodują uczulenie matki.

Ad 2

•

matka o grupie krwi 0 ma przeciwciała klasy IgG o swoistości anty-A i/lub anty-B

•

dziecko dziedziczy po ojcu antygeny A lub B – przeciwciała matki przechodząc przez
łożysko mogą wywołać hemolizę erytrocytów dziecka.

•

znacznie łagodniejszy przebieg.

Inne techniki immunologiczne

Immunoelektroforeza

➔

Metoda dwuetapowa

1. elektroforeza wysokoprądowa – w czystym 1% żelu agarozowym na płytce wycina się jedną

lub dwie studzienki i nakrapla się mieszaninę antygenów. Następnie przeprowadza się
rozdział białek w polu elektrycznym. Dzięki wysokiemu pH roztworu (pH 8,6-8,8) białka
naładowane dodatnio wędrują do elektrody ujemnej, a naładowane ujemnie do elektrody
dodatniej.

2. Podwójnej immunodyfuzji – wycina się w żelu podłużny rowek równoległy do kierunku

migracji, wypełnia się go surowicą odpornościową, zawierającą przeciwciała przeciwko
poszukiwanym antygenom, a płytkę umieszcza się w komorze wilgotnej na 24 godz.
Zachodzi podwójna immunodyfuzja i w miejscu reakcji powstają łuki precypitacyjne,
odpowiadające poszczególnym antygenom wykrytym w mieszaninie.

➔

metoda czuła i swoista

➔

pozwala ocenić antygeny i przeciwciała jakościowo

➔

pozwala na porównanie złożonych mieszanin antygenów np. obecnych w surowicy krwi;

➔

stosuje się ją zwłaszcza dla wykrycia zmian w poszczególnych klasach immunoglobulin, u
chorych agammaglobulinemią lub hipergammaglobulinemią, w rozpoznawaniu niedoborów
odpornościowych i innych zaburzeń składu białek w płynach ustrojowych.

Immunoelektroforeza przeciwprądowa

➔

metoda oznaczeń elektroforetycznych w żelu

➔

pH 8.0, przeciwciało ma ładunek dodatni, a testowany antygen ładunek ujemny

➔

po umieszczeniu w polu elektrycznym antygen i przeciwciało zbliżają się do siebie, tworząc
w miejscu zetknięcia linię precypitacyjną

➔

jest bardzo szybka (ok. 30 min.) i czulsza od podwójnej immunodyfuzji około 10-20 razy

➔

zastosowanie w diagnostyce chorób zakaźnych, do wykrywania antygenów grzybiczych,
bakteryjnych, a także do wykrywania antygenu wirusowego zapalenia wątroby (Hbs).

Immunoelektroforeza rakietkowa wg Laurella

➔

metoda ilościowa oceny antygenów

➔

oznaczanie stężenia antygenu – elektroforeza w żelu zawierającym przeciwciałami

➔

odpowiednie pH (ok. 8,6) – przeciwciała nie posiadają ładunku (pH zbliżone do ich punktu
izoelektrycznego), a antygen ma ładunek ujemny

➔

antygen wędruje ku katodzie, tworząc w miejscu zetknięcia z przeciwciałem precypitat o
kształcie rakietki (stąd nazwa)

➔

pole powierzchni ograniczonej rakietką jest wprost proporcjonalne do ilości badanego
antygenu. Wartość badanych próbek oblicza się z krzywej wzorcowej (czułość ok. 0,3
mg/ml).

Immunoelektroforeza krzyżowa

➔

pozwala na identyfikację antygenu występującego w małych ilościach w mieszaninie białek

➔

metoda dwuetapowa:

1. elektroforeza wysokoprądowa antygenu nałożonego na studzienkę,
2. pasek żelu zawierający rozdzielone białka (ścieżkę rozdziału) przenosi się na drugą płytkę.

Powierzchnię płytki nad paskiem pokrywa się agarozą z przeciwciałem, zaś powierzchnie
pod paskiem czystą agarozą i prowadzi elektroforezę niskoprądową w kierunku
prostopadłym do pierwszego. Antygeny wędrując przez żel spotykają na swej drodze
unieruchomione przeciwciała tworząc najpierw migrujące kompleksy, a następnie w strefie
ekwiwalencji, łuki precypitacyjne o wysokości proporcjonalnej do stężenia antygenu.

➔

Metoda bardzo czuła

➔

pozwala na wykrycie i ocenę białek występujących w bardzo małych ilościach

➔

porównywanie antygenów, wyodrębnianie badanego antygenu z mieszaniny,

➔

identyfikacja alergenów zdolnych do swoistego wiązania

➔

IgE z surowicy chorych

Metody immunofluorescencyjne

➔

zastosowanie barwników fluorescencyjnych, np. izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC –
świecenie zielonkawe, 520 nm) lub izotiocyjanianu tetrametylorodaminy (TRIT – świecenie
czerwonawe, 580 nm);

➔

za pomocą wyznakowanych przeciwciał można wykrywać poszukiwane antygeny i
odwrotnie;

➔

pozwalają na uwidocznienie substancji występujących na komórkach, tkankach, na
skrawkach utrwalonych lub nieutrwalonych, także w zawiesinie komórek (tj. do
wykrywania antygenów na komórkach żywych)

➔

oceny preparatów barwionych fluorochromami dokonuje się w mikroskopie
fluorescencyjnym;

➔

pole jest ciemne, a miejsca gzie przyłączyły się przeciwciała świecą;

➔

wzór fluorescencji jest zmienny dla danego antygenu tkankowego.

Techniki badania immunofluorescencyjnego

➔

Immunofluorescencja bezpośrednia – jeden ze składników reakcji (przeciwciało lub
antygen) swoisty dla drugiego, poszukiwanego, znakowany jest fluorochromem. Po
nałożeniu znakowanego czynnika inkubuje się badany skrawek, a po przemyciu bada
obecność świecenia (rys. 31, str. 153 skrypt do mikrobiologii).

➔

Immunofluorescencja pośrednia – w pierwszym etapie zachodzi reakcja nie znakowanego
czynnika z poszukiwanym (np. badane przeciwciało nakrapia się na skrawek), a dopiero po
inkubacji i przemyciu przeprowadza się drugi etap, tzn. Reakcję znakowanej surowicy z
czynnikiem związanym w pierwszym etapie (rys. 32, str.155, skrypt do mikrobiologii).

➔

Immunofluorescencja pośrednia z udziałem dopełniacza – służy do wykrywania przeciwciał
wiążących składową C (C3). W pierwszym etapie jak wyżej, w drugim etapie dodaje się
dopełniacz (C), który wiąże się w miejscach związanych przeciwciał, a po wypłukaniu
dodaje się znakowanej surowicy przeciwko składowej C.

Badania immunofluorescencyjne stosuje się do wykrywania różnych przeciwciał
spotykanych w chorobach autoimmunologicznych. Zależnie od ich rodzaju, na skrawku
zawierającym substraty antygenowe obserwuje się różny typ świecenia.

Metody radioimmunologiczne (RIA)

➔

wykrywanie promieniowania izotopów radioaktywnych, związanych z jednym ze
składników reakcji antygen – przeciwciało;

➔

ilościowe oznaczanie śladowych składników surowicy lub innych płynów ustrojowych, np.
hormonów, antygenów płodowo-nowotworowych, ponieważ czułość metody wynosi około
10

-12

g

➔

przeciwciała lub antygeny znakowane izotopem I

125

lub I

131

, a także H

3

(tryt)

1. Metoda kompetycyjna (współzawodnictwa)

•

przeciwciała reagują z oznaczanym antygenem w obecności znanej ilości antygenu
znakowanego izotopem. Oba rodzaje antygenów: znakowany i nieznakowany
współzawodniczą o przeciwciało;

•

odczyt poziomu radioaktywności – stosunek promieniowania związanego z kompleksem do
całkowitej ilości podanego izotopu (B/T)

•

stężenie – z krzywej kalibracyjnej.

2. Metoda bezpośrednia (Farra)

•

znakowany antygen poddaje się reakcji z badanym płynem ustrojowym, zawierającym
oznaczane przeciwciała. Powstający kompleks wytrąca się np. siarczanem amonu i mierzy
radioaktywność powstającego osadu. Na podstawie wyznaczonej poprzednio krzywej
standardowej określa się np. przeciwciała przeciw DNA w surowicy.

Metody Immunoenzymatyczne

➔

antygen lub przeciwciało sprzęga się z aktywnym enzymem: peroksydazą chrzanową,
fosfatazą chrzanową lub oksydazą glukozową;

➔

pomiar ilości produktu powstałego w reakcji enzymatycznej rozkładającej określony
substrat (produkt jest barwny, a natężenie zabarwienia zależy pośrednio od zawartości
oznaczanego antygenu czy przeciwciała);

➔

natężenie zabarwienia (ocena ilościowa) mierzy spektrofotometrycznie przy określonej
długości fali;

➔

czułość metod immunoenzymatycznych podobna do radioimmunologicznych (rzędu pg –
ng/ml) (rys. 33, str.156, skrypt do mikrobiologii).

Test ELISA (Enzyme Linker Immunosorbent Assay)

•

fazę stałą, np. powierzchnię mikropłytki lub probówki opłaszcza się antygenem;

•

dodaje się badane przeciwciała, które w czasie inkubacji wiążą się z opłaszczonym
antygenem;

•

po płukaniu dodaje się przeciwciała skierowane przeciw badanym białkom, znakowane
enzymem;

•

po następnym płukaniu dodaje się roztworu zawierającego substrat enzymu i przeprowadza
się pomiar intensywności zabarwienia roztworu (proporcjonalne do ilości przeciwciała w
próbie badanej);

•

oznaczanie przeciwciał, np. przeciw DNA, przeciw różnym wirusom, przeciwciał anty-HIV,
przeciwbakteryjnych i innych;

•

ocena antygenów, mikroplytki lub mikroprobówki opłaszczone przeciwciałem (służą do
oznaczania np. antygenu powierzchniowego Hepatitis B, wirusa Epstein-Barra).

Immunoblotting

➔

umożliwia identyfikację antygenów i epitopów antygenowych;

➔

potwierdzenie dodatnich i nieokreślonych wyników uzyskanych metodami EIA lub
metodami immunofluorescencyjnymi;

➔

metoda Western blot obejmuje:



rozdział elektroforetyczny antygenu (np. białka bakterii) w żelu poliakryloamidowym w
obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) – rozdział cząsteczek ze względu na ich wielkość
(masę cząsteczkową);

B/T

C (stężenie)

Krzywa kalibracyjna oznaczania
stężenia badanego antygenu



przeniesienie rozdzielonych białek na błonę nitrocelulozową w celu uzyskania na tejże
błonie wzoru identycznego ze wzorem na żelu;



inkubacja z badaną surowicą (zawierającą przeciwciała przeciwko badanej cząsteczce) –
specyficzne immunoglobuliny z próbki wiążą sie z unieruchomionymi na błonie białkami



kolejna inkubacja z przeciwciałem specyficznym w stosunku do odpowiedniego
przeciwciała pacjenta, sprzężonym z odpowiednim enzymem np. fosfatazą alkaliczną



dodanie substratu i wizualizacja kompleksów immunologicznych w postaci wybarwionych
pasków



interpretacja na podstawie określonego wzorca w postaci rozdzielonych
charakterystycznych prążków.

➔

Zastosowanie: diagnostyka chorób bakteryjnych (np. Borrelia burgdorferii (choroba z
Lyme – borelioza) czy Helicobacter pylori) i wirusowych (np. HIV) oraz chorób
alergicznych.

Rys.

Western blot dla Helicobacter pylori. Po lewej widoczny wzorzec –

prążki oznaczono zgodnie z międzynarodową nomenklaturą i ciężarem
cząsteczkowym specyficznych antygenów