Wiesław Babik
Sekwencjonowanie nowej generacji w genetyce ewolucyjnej



Zmiennosc genow zgodnosci tkankowej i ich znaczenie adaptacyjne



Ogolnogenomowa analiza przeplywu genow miedzy gatunkami: to w jaki sposob powstaja gatunki



Poszukiwanie podstaw genetycznych adaptacji: molekularne podstawy adaptacji

Sekwencjonowanie + analiza bioinformatyczna


Glowny kompleks zgodnosci tkankowej (MHC)
Bogaty w region w genomach wszystkich zuchwowcow
Geny zwiazane z odpowiedzia immunologiczna i inne
Najwazniejszym genem w tym regionie to klasyczne geny MHC klasy I i II (MHC w badaniach ekologiczno-
ewolucyjnych)
Kluczowe skladniki odpornosci swoistej

MHC klasy I i II
Prezentuja antygeny patogenow limfocytom T -> uruchamiaja odpowiedz swoista
Aminokwasy w miejscach wiazacych antygen (ABS) determinuja antygeny, jakie dane bialko MHC moze
prezentowac
Kazde bialko MHC prezentuje ograniczony zestaw antygenow
Od sekwencji aminokwasow w tej pozycji zalezy jakie bialka dany region bedzie prezentowal
MHC II = dimery

Klasy roznia sie tym ze bialka I klasy prezentuja antygeny ktore pochodza z wirusow, MHC prezentuja
antygeny wywodzace sie z genow bakterii czy grzybow

Genotyp MHC a choroby
Niektore genotypy/allele MHC koreluja z odpornoscia/zapadalnoscia na choroby (HIM,malaria, pasozyty).
Konsekwencje takich zwiazkow dla dostosowania sa slabo badane. Zasugerowano zwiazek miedzy niska
zmiennoscia MHC a zapadalnoscia na choroby: gepard, tamaryna bialoczuba.

Sygnatury doboru w genach MHC
Wykrywane w ABS wiekszosci gatunkow.
Dobor: czesty, pozytywny, rownowazacy
Sygnatury: nadmiar zmian niesynonimowych w ABS,dN/dS (K

A

/K

S

)>1; ogromna zmiennosc – setki alleli w

populacjach; polimorfizm transgatunkowy (transspecyficzny) = pokrewienstwa linii allelicznych sa odmienne
niz pokrewienstwa gatunkow (dzieje sie tak, gdy alleliczne a starsze niz gatunki, np.utrzymywane przez
dobor rownowazacy).

Drzewa genow i drzewa gatunkow
Nie koniecznie musza byc takie same.

Dobor rownowazacy w genach MHC
Patogeny wydaja sie najwazniejsze.
Dobor plciowy, rozpoznawanie krewnych/unikanie kojarzen w pokrewienstwie, interakcje matka-plod maja
znaczenie u niektorych gatunkow.
Niejasne ktora forma doboru rownowazacego dominuje:



Przewaga heterozygot (naddominacja)



Przewaga selekcyjna rzadkich alleli (dobor negtywnie zalezny od czestosci)



Dobor zmienny w czasie i przestrzeni

Mechanizmy te generuja zblizone przewidywania.

Zlozona struktura genow MHC



Klasyczne geny MHC tworza rodziny wielogenowe (trudno je badac)



Czeste duplikacje

o Wiele genow o zblizonej funkcji
o Rekombinacja i konwersja miedzy roznymi genami
o Konieczna analiza wielu genow na raz – utrudnia analize



Zmiennosc liczby kopii genow w genomie (CNV) powoduje duza zmiennosci liczby alleli miedzy
osobnikami

Genotypowanie wielu genow MHC jednocczesnie
Sekwencjonowanie amplikonow technikami owej generacji – odpowiednik klonowania heterogennej
mieszaniny sekwencji uzyskanej w reakcji PCR, przeprowadzanego in vitro, sekwencjonowanie duzej liczby
klonow

 Techniki do klonowania genotypow

Schemat genotypowania MHC

1. Identyfikacja odpowiednich starterow
2. Amplifikacja MHC z wielu osobnikow, przy uzyciu znakowanych starterow
3. Zmieszanie amplikonow z wielu osobnikow ; stworzenie pul
4. Oczyszczenie pul
5. Sekwencjonowanie amplikonow
6. Kontrola jakosci sekwencji
7. Odfiltrowanie artefaktow
8. Genotypowanie
9. Oszacowanie bledu genotypowania

jMHC
software w Javie; pozwala na wstepna obrobke wynikow sekwencjonowania, filtrowanie i przypisywanie
odczytow sekwencyjnych do osobnikow; pomaga rozroznik artefakty od prawdziwych alleli

optymalna liczba alleli MHC?



Wiele wariantow MHC u osobnika

o Wiecej prezentowanych antygenow
o Slabsza odpowiedz, bo wiecej limfocytow ginie w czasie selekcji negatywnej w grasicy



Kompromis (hipoteza): u gatunkow z CNV powinna byc i optymalna liczba wariantow (alleli) na
osobnika

o Cierniki
o Wroble



Testowanie trudne: genotypowanie, zakres CNV

Muchołówki i optymalna liczba alleli
Muchołówka białoszyja ma skomplikowane MHC II:



Dziesiątki pseudogenów



Do 12 funkcjonalnych genów



Dobrze zbadana populacja na Gotlandii



Staly sklad, malo imigrantow



Dane o calozyciowym sukcecie rozrodczym samic (LRS)



Informacje o zainfektowaniu malarią i o szczepie malarii



N>200 samic : genotyp MHC, LRS i malaria

o Liniowy, NIE kwadratowy zwiazek miedzy infekcja zarodźcem malarii a funkcjonalną

różnorodnością alleli

o Brak związku miedzy MHC a LRS
o W danych brak poparcia hipotezy optymalnej liczby alleli
o Byc moze duzy zakres CNV swiadczy o slabym doborze na liczbe genow MHC II u

muchołówek

SPECJACJA



Proces powstawania nowych gatunkow



Kluczowy dla zrozumienia bioroznorodnosci



Zlozony problem, wiele podejsc badawczych



Pytanie: w jaki sposob powstanie izolacja rozrodcza



Specjacja zachodzi w czasie i w przestrzeni, roznice miedzy gatunkami i izolacja rozrodcza maja
podloze genetyczne

Przeplyw genow w czasie specjacji



Wpływ przeplywu genow na przebieg i wynik specjacji niejasny



Malo informacji na temat historii i wzorow przeplywu genow miedzy powstajacymi gatunkami:
„genomowe wyspy specjacji”, krotkie epizody hybrydyzacji czy dlugie okresy przeplywu genow?



Wiekszosc gatunkow modelowanych nie nadaje sie do tego typu badan



Dane genetyczne pozwalaja na testowanie roznych modeli przeplywu genow i szacowanie ich
parametrow

Traszki



Traszki karpacka i zwyczajna oddzielily sie od siebie 3-6 mln lat temu



Podobne genetycznie lecz zroznicowane morfologicznie (inny ksztalt ciala, widoczny szczegolnie u
samców-rozpoznawanie partnera do rozrodu)



skomplikowane gody, samice wybierają, behawioralna izolacja rozrodcza



odmienne zasięgi



naturalna hybrydyzacja w niższych położeniach Karpat (strefa kontaktu)



mitochondrialne DNA t. Karpackiej zostalo zastapione przez mtDNA t. Zwyczajnej



introgresja (=przejscie z jednego gatunku do drugiego) w roznym czasie i w roznych miejscach



przeplyw genow musial byc intensywny i zachodzic przez dluzszy czas



silna introgresja genow MHC

o duze podobienstwo MHC II miedzy gatunkami w Europie Srodkowej i wiele identycznych

alleli w obu gatunkach wskazuja na nniedawna lub wspolczesna introgresje



silna izolacja rozrodcza w naturze

o bimodalny rozklad genotypow
o asortatywne kojarzenie w obrebie kazdego gatunku
o mieszance F

1

powstają rzadko

o silna izolacja rozrodcza w naturze



brak przeplywu genow w mikrosatelitach

o znikomy ogolnogenomowy
o mikrosatelity nadaja sie do niedawnego przeplywu genow

Potrzeba danych ogólnogenomowych



sprzeczne informacje z roznych rodzajow markerów molekularnych i dla roznych okresow



heterogennosc przeplywu genow w roznych czesciach genomu – interesuje nas zarowno srednia
ogolnogenomowa, jak i zroznicowanie wokol tej sredniej



historyczne zroznicowanie przeplywu genow



sekwencjonowanie i skladanie de novo genomu ciagle niemozliwe

Sekwencjonowanie transkryptomu
Izolacja RNA (wątroba)  synteza cDNA z polyA+RNAsekwencjonowanie wieloskalowe metodą Illumina

Skladanie transkryptomu de novo
Trinity = asembler transkryptomu
Takie asembleru staraja sie rekonstruowac starannie transkryptomy

SNP and genotype calling
Mapowanie odczytow do referencji  wyszukiwannie SNP oraz ustalanie genotypow osobnikow 
kontrola jakosci

Spektrum czestosci alleli (AFS)



podsumowanie zliczen alleli w probach



dla dwu populacji macierz prostokatna (n1 + 1) x (n2 + 1), n1, n2 – wielkosci prob dla kazdego locus
w populacji 1 i 2



stan ancestralny (pierwotny) znany dla kazdego SNP (ustalony na podstawie spokrewnionego
gatunku)

Z ksztaltu spektru mozemy wnioskowac o duzej ilosci informacji danej populacji:



dla okreslonego modelu i zestawu jego parametrow stosujemy rownania dyfuzyjne celem
znalezienia oczekiwanego AFS M



przy braku sprzezenia kazdy element obserwowanego AFS jest niezalezna zmienna Poissona

Modele



hipotezy odzwierciedlajace nasza wiedze i/lub intuicje o badanym procesie



z definicji uproszczone, lecz niektore moga niezle oddawac procesy, jakie zachodzily w badanym
systemie



np:

o izolacja
o izolacja z migracją (IM)
o izolacja z migracją + zmiany demograficzne (IM+s) – najlepszy

Genetyczne podstawy adaptacji



eksperyment selekcyjny na nornicy rudej



cel: wykrycie roznic genetycznych miedzy liniami selekcyjnymi i nieselekcjonowanymi liniami
kontrolnymi; oczekujemy ze roznice czestosci alleli w regionach kodujacych oraz roznic w poziomie
eksprecji genow, za ktore moga odpowiadac rozniche w sekwencjach regulatorowych



Geny kandydackie – rozniace sie miedzy kontrola a liniami selekcyjnymi w sekwencjach kodujacych
i/lub poziomie ekspresji



Kontrola dryfu genetycznego - powtorzenia

SALA 111 GODZ 11,15
SZTUCZNE ZYCIE
14/01/2013