Wiesław Babik 
Sekwencjonowanie nowej generacji w genetyce ewolucyjnej 



 

Zmiennosc genow zgodnosci tkankowej i ich znaczenie adaptacyjne 



 

Ogolnogenomowa analiza przeplywu genow miedzy gatunkami: to w jaki sposob powstaja gatunki 



 

Poszukiwanie podstaw genetycznych adaptacji: molekularne podstawy adaptacji 

 
Sekwencjonowanie + analiza bioinformatyczna 
 
 
Glowny kompleks zgodnosci tkankowej (MHC) 
Bogaty w region w genomach wszystkich zuchwowcow 
Geny zwiazane z odpowiedzia immunologiczna i inne 
Najwazniejszym genem w tym regionie to klasyczne geny MHC klasy I i II (MHC w badaniach ekologiczno-
ewolucyjnych) 
Kluczowe skladniki odpornosci swoistej 
 
MHC klasy I i II 
Prezentuja antygeny patogenow limfocytom T -> uruchamiaja odpowiedz swoista 
Aminokwasy w miejscach wiazacych antygen (ABS) determinuja antygeny, jakie dane bialko MHC moze 
prezentowac 
Kazde bialko MHC prezentuje ograniczony zestaw antygenow 
Od sekwencji aminokwasow w tej pozycji zalezy jakie bialka dany region bedzie prezentowal 
MHC II = dimery 
 
Klasy roznia sie tym ze bialka I klasy prezentuja antygeny ktore pochodza z wirusow, MHC prezentuja 
antygeny wywodzace sie z genow bakterii czy grzybow 
 
Genotyp MHC a choroby 
Niektore genotypy/allele MHC koreluja z odpornoscia/zapadalnoscia na choroby (HIM,malaria, pasozyty). 
Konsekwencje takich zwiazkow dla dostosowania sa slabo badane. Zasugerowano zwiazek miedzy niska 
zmiennoscia MHC a zapadalnoscia na choroby: gepard, tamaryna bialoczuba. 
 
Sygnatury doboru w genach MHC 
Wykrywane w ABS wiekszosci gatunkow. 
Dobor: czesty, pozytywny, rownowazacy 
Sygnatury: nadmiar zmian niesynonimowych w ABS,dN/dS (K

A

/K

S

)>1; ogromna zmiennosc – setki alleli w 

populacjach; polimorfizm transgatunkowy (transspecyficzny) = pokrewienstwa linii allelicznych sa odmienne 
niz pokrewienstwa gatunkow (dzieje sie tak, gdy alleliczne a starsze niz gatunki, np.utrzymywane przez 
dobor rownowazacy). 
 
Drzewa genow i drzewa gatunkow 
Nie koniecznie musza byc takie same.  
 
Dobor rownowazacy w genach MHC 
Patogeny wydaja sie najwazniejsze. 
Dobor plciowy, rozpoznawanie krewnych/unikanie kojarzen w pokrewienstwie, interakcje matka-plod maja 
znaczenie u niektorych gatunkow. 
Niejasne ktora forma doboru rownowazacego dominuje: 



 

Przewaga heterozygot (naddominacja) 



 

Przewaga selekcyjna rzadkich alleli (dobor negtywnie zalezny od czestosci) 



 

Dobor zmienny w czasie i przestrzeni 

Mechanizmy te generuja zblizone przewidywania. 

Zlozona struktura genow MHC 



 

Klasyczne geny MHC tworza rodziny wielogenowe (trudno je badac) 



 

Czeste duplikacje 

o  Wiele genow o zblizonej funkcji 
o  Rekombinacja i konwersja miedzy roznymi genami 
o  Konieczna analiza wielu genow na raz – utrudnia analize 



 

Zmiennosc liczby kopii genow w genomie (CNV) powoduje duza zmiennosci liczby alleli miedzy 
osobnikami 

 
Genotypowanie wielu genow MHC jednocczesnie 
Sekwencjonowanie amplikonow technikami owej generacji – odpowiednik klonowania heterogennej 
mieszaniny sekwencji uzyskanej w reakcji PCR, przeprowadzanego in vitro, sekwencjonowanie duzej liczby 
klonow 
 

  Techniki do klonowania genotypow 

 
Schemat genotypowania MHC 

1.  Identyfikacja odpowiednich starterow 
2.  Amplifikacja MHC z wielu osobnikow, przy uzyciu znakowanych starterow 
3.  Zmieszanie amplikonow z wielu osobnikow ; stworzenie pul 
4.  Oczyszczenie pul 
5.  Sekwencjonowanie amplikonow 
6.  Kontrola jakosci sekwencji 
7.  Odfiltrowanie artefaktow  
8.  Genotypowanie 
9.  Oszacowanie bledu genotypowania 

 
jMHC 
software w Javie; pozwala na wstepna obrobke wynikow sekwencjonowania, filtrowanie i przypisywanie 
odczytow sekwencyjnych do osobnikow; pomaga rozroznik artefakty od prawdziwych alleli 
 
optymalna liczba alleli MHC? 



 

Wiele wariantow MHC u osobnika 

o  Wiecej prezentowanych antygenow 
o  Slabsza odpowiedz, bo wiecej limfocytow ginie w czasie selekcji negatywnej w grasicy 



 

Kompromis (hipoteza): u gatunkow z CNV powinna byc i optymalna liczba wariantow (alleli) na 
osobnika 

o  Cierniki 
o  Wroble 



 

Testowanie trudne: genotypowanie, zakres CNV 

 
Muchołówki i optymalna liczba alleli 
Muchołówka białoszyja ma skomplikowane MHC II:  



 

Dziesiątki pseudogenów 



 

Do 12 funkcjonalnych genów 



 

Dobrze zbadana populacja na Gotlandii 



 

Staly sklad, malo imigrantow 



 

Dane o calozyciowym sukcecie rozrodczym samic (LRS) 



 

Informacje o zainfektowaniu malarią i o szczepie malarii 



 

N>200 samic : genotyp MHC, LRS i malaria 

o  Liniowy, NIE kwadratowy zwiazek miedzy infekcja zarodźcem malarii a funkcjonalną 

różnorodnością alleli 

o  Brak związku miedzy MHC a LRS 
o  W danych brak poparcia hipotezy optymalnej liczby alleli 
o  Byc moze duzy zakres CNV swiadczy o slabym doborze na liczbe genow MHC II u 

muchołówek 

 
SPECJACJA  



 

Proces powstawania nowych gatunkow 



 

Kluczowy dla zrozumienia bioroznorodnosci 



 

Zlozony problem, wiele podejsc badawczych 



 

Pytanie: w jaki sposob powstanie izolacja rozrodcza 



 

Specjacja zachodzi w czasie i w przestrzeni, roznice miedzy gatunkami i izolacja rozrodcza maja 
podloze genetyczne 

 
Przeplyw genow w czasie specjacji 



 

Wpływ przeplywu genow na przebieg i wynik specjacji niejasny 



 

Malo informacji na temat historii i wzorow przeplywu genow miedzy powstajacymi gatunkami: 
„genomowe wyspy specjacji”, krotkie epizody hybrydyzacji czy dlugie okresy przeplywu genow? 



 

Wiekszosc gatunkow modelowanych nie nadaje sie do tego typu badan 



 

Dane genetyczne pozwalaja na testowanie roznych modeli przeplywu genow i szacowanie ich 
parametrow 

 
Traszki 



 

Traszki karpacka i zwyczajna oddzielily sie od siebie 3-6 mln lat temu 



 

Podobne genetycznie lecz zroznicowane morfologicznie (inny ksztalt ciala, widoczny szczegolnie u 
samców-rozpoznawanie partnera do rozrodu) 



 

skomplikowane gody, samice wybierają, behawioralna izolacja rozrodcza 



 

odmienne zasięgi 



 

naturalna hybrydyzacja w niższych położeniach Karpat (strefa kontaktu) 



 

mitochondrialne DNA t. Karpackiej zostalo zastapione przez mtDNA t. Zwyczajnej 



 

introgresja (=przejscie z jednego gatunku do drugiego) w roznym czasie i w roznych miejscach 



 

przeplyw genow musial byc intensywny i zachodzic przez dluzszy czas 



 

silna introgresja genow MHC 

o  duze podobienstwo MHC II miedzy gatunkami w Europie Srodkowej i wiele identycznych 

alleli w obu gatunkach wskazuja na nniedawna lub wspolczesna introgresje 



 

silna izolacja rozrodcza w naturze 

o  bimodalny rozklad genotypow 
o  asortatywne kojarzenie w obrebie kazdego gatunku 
o  mieszance F

1

 powstają rzadko 

o  silna izolacja rozrodcza w naturze 



 

brak przeplywu genow w mikrosatelitach 

o  znikomy ogolnogenomowy 
o  mikrosatelity nadaja sie do niedawnego przeplywu genow 

 
Potrzeba danych ogólnogenomowych 



 

sprzeczne informacje z roznych rodzajow markerów molekularnych i dla roznych okresow 



 

heterogennosc przeplywu genow w roznych czesciach genomu – interesuje nas zarowno srednia 
ogolnogenomowa, jak i zroznicowanie wokol tej sredniej 



 

historyczne zroznicowanie przeplywu genow 



 

sekwencjonowanie i skladanie de novo genomu ciagle niemozliwe 

 
Sekwencjonowanie transkryptomu 
Izolacja RNA (wątroba)  synteza cDNA z polyA+RNAsekwencjonowanie wieloskalowe metodą Illumina 

Skladanie transkryptomu de novo 
Trinity = asembler transkryptomu 
Takie asembleru staraja sie rekonstruowac starannie transkryptomy 
 
SNP and genotype calling 
Mapowanie odczytow do referencji  wyszukiwannie SNP oraz ustalanie genotypow osobnikow  
kontrola jakosci 
 
Spektrum czestosci alleli (AFS) 



 

podsumowanie zliczen alleli w probach 



 

dla dwu populacji macierz prostokatna (n1 + 1) x (n2 + 1), n1, n2 – wielkosci prob dla kazdego locus 
w populacji  1 i 2  



 

stan ancestralny (pierwotny) znany dla kazdego SNP (ustalony na podstawie spokrewnionego 
gatunku) 

Z ksztaltu spektru mozemy wnioskowac o duzej ilosci informacji danej populacji: 



 

dla okreslonego modelu i zestawu jego parametrow stosujemy rownania dyfuzyjne celem 
znalezienia oczekiwanego AFS M 



 

przy braku sprzezenia kazdy element obserwowanego AFS jest niezalezna zmienna Poissona  

 
Modele 



 

hipotezy odzwierciedlajace nasza wiedze i/lub intuicje o badanym procesie 



 

z definicji uproszczone, lecz niektore moga niezle oddawac procesy, jakie zachodzily w badanym 
systemie 



 

np: 

o  izolacja 
o  izolacja z migracją (IM) 
o  izolacja z migracją + zmiany demograficzne (IM+s) – najlepszy 

 
Genetyczne podstawy adaptacji 



 

eksperyment selekcyjny na nornicy rudej 



 

cel: wykrycie roznic genetycznych miedzy liniami selekcyjnymi i nieselekcjonowanymi liniami 
kontrolnymi; oczekujemy ze roznice czestosci alleli w regionach kodujacych oraz roznic w poziomie 
eksprecji genow, za ktore moga odpowiadac rozniche w sekwencjach regulatorowych 

 



 

Geny kandydackie – rozniace sie miedzy kontrola a liniami selekcyjnymi w sekwencjach kodujacych 
i/lub poziomie ekspresji 
 



 

Kontrola dryfu genetycznego - powtorzenia 

 
SALA 111 GODZ  11,15 
SZTUCZNE ZYCIE 
14/01/2013