Technologie Przemysłów Fermentacyjnych

Ć

W. 1

Drożdże – część praktyczna

Kierunek

Technologia Żywności

Rok III

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt

1

Cel:
Poznanie budowy komórek drożdży i ich
fizjologii.

Wykonanie:

1. Badania makroskopowe

Rozróżnianie wybranych szczepów drożdży
piwowarskich, gorzelniczych i piekarskich

Na podłożu stałym po określonym czasie
hodowli w temp. 20°C należy zwrócić uwagę
na:
• rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub
pojedyncze kolonie),
• powierzchnię wzrostu (matowa, błyszcząca) i
strukturę kolonii (zwarta, mazista),
• zabarwienie i kształt kolonii.

2. Badania mikroskopowe

Obserwacje mikroskopowe: kształtu, wielkości,
sposobu ułożenia oraz rozmnażania komórek.
Preparaty wykonuje się z jednodobowych
kultur hodowanych na podłożu płynnym w
temp. 30°C. Preparaty mikroskopowe różnych
ras

drożdży:

winiarskich,

piwowarskich,

gorzelniczych, piekarskich.

2.1. Badanie żywotności drożdży
Polega na zabarwieniu ich wodnym roztworem
błękitu

metylenowego.

Na

szkiełku

przedmiotowym do kropli badanej zawiesiny
drożdży

dodaje

się

roztworu

barwnika,

przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda
pod mikroskopem. Komórki martwe barwią się
na niebiesko, natomiast żywe pozostają
niezabarwione.

2.2. Badanie obecności glikogenu
Przeprowadza się podobnie, jak badanie na
ż

ywotność z tym, że do barwienia używa się

płynu Lugola. Komórki zawierające glikogen
będą zabarwione na kolor ciemnobrunatny,
natomiast pozostałe na jasnożółty.

2.3 Oznaczanie ilości komórek w 1 cm

3

gęstwy drożdżowej

Sporządza się szereg rozcieńczeń gęstwy
drożdżowej (1:10, 1:50, 1:100) z udziałem
wody destylowanej i H

2

SO

4

(7cm

3

H2O + 2cm

3

H

2

SO

4

(1:10) + 1cm

3

gęstwy drożdżowej).

Materiał po dokładnym wymieszaniu nanosi się
pipetą na komorę Thoma i liczy pod
mikroskopem

komórki

drożdży

przy

powiększeniu 100-400 razy.

A. Drożdże piekarnicze

Cel ćwiczenia
Poznanie metod badań drożdży piekarskich
prasowanych, ocena technologiczna drożdży.

Wykonanie

3. Sprawdzanie masy drożdży piekarskich
suszonych

Zawartość opakowania zważyć z dokładnością
do 0,1 g – porównać z deklarowaną masą
netto.

4. Określenie barwy

Barwę

badanej

próbki

należy

określać

wzrokowo

przy

ś

wietle

dziennym

rozproszonym.

5. Określenie zapachu

Należy

przeprowadzić

w

pomieszczeniu

pozbawionym

obcych

zapachów,

zapach

drożdży

piekarskich

prasowanych

należy

określić bezpośrednio po skrojeniu wierzchniej
warstwy cegiełki, a zapach drożdży piekarskich
suszonych, paszowych i piwowarskich —
natychmiast po otwarciu opakowania.

6. Określenie konsystencji
Cegiełkę drożdży należy nagnieść lekko
palcem

w

ś

rodku

bocznej

powierzchni;

konsystencja powinna być ścisła, dopuszcza
się zewnętrzną mazistość, jeśli nie jest
połączona

z

przykrym

zapachem

rozkładającego się białka.

7. Obserwacja zawiesiny wodnej
Do probówki szklanej wrzucić grudkę drożdży
(około 1g na 20 cm

3

) pobraną z wnętrza

cegiełki, dodawać porcjami wodę do około
połowy pojemności probówki z korkiem.
Obserwować

zawiesinę

po

całkowitym

wymieszaniu — zawiesina powinna być
jednorodna, w ciągu 5 min nie powinna
wykazywać grudek ani kłaczków na dnie
probówki.

8. Zawartości suchej masy – metoda
suszarkowa

W naczyńku wagowym, wysuszonym w temp.
105°C do stałej masy i uprzednio zważonym,
odważyć około 1g drożdży z dokładnością do
0,001 g.
Naczyńko otwarte wraz z przykrywką umieścić
w suszarce na 1,5–2h, w temp. 55–60°C.

Technologie Przemysłów Fermentacyjnych

Ć

W. 1

Drożdże – część praktyczna

Kierunek

Technologia Żywności

Rok III

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt

2

Następnie

otwarte

naczyńko

ponownie

umieścić w suszarce, w temp. 105°C na 1h.
Oznaczenie uważa się za zakończone, jeśli
różnica masy po kolejnym dosuszeniu nie
przekracza 0,001g.

9. Kwasowość drożdży
Rozpuścić 10g drożdży w 50cm

3

wody

destylowanej

i

otrzymaną

zawiesinę

miareczkować

0,1

M

NaOH

wobec

fenoloftaleiny. Wynik podać w cm

3

1 M NaOH

na 100g drożdży.

10. Oznaczanie aktywności sacharolitycznej
drożdży

0,5g drożdży prasowanych, rozprowadzić w
10cm

3

wody wodociągowej o temp. 35°C. Do

otrzymanej zawiesiny dodać 10cm

3

, 10%

roztworu sacharozy ogrzanego do temp. 35°C.
Następnie postępować według metody A lub B,
w zależności od dostępnego wyposażenia.
A)

Kolbę zamknąć szczelnie korkiem

zaopatrzonym

w

rurkę

fermentacyjną

napełnioną

gliceryną,

zważyć

całość

z

dokładnością 0,01g, a następnie wstawić do
cieplarki (35°C) na okres 1 godziny. Znając
różnicę mas przed i po fermentacji obliczyć
ilość wydzielonego CO2 [cm

3

].

B)

Kolbę zamknąć szczelnie korkiem

zaopatrzonym w rurkę odprowadzającą CO2
do wyskalowanej biurety wypełnionej wodą i
wstawić do termostatu (35°C). Mierzyć czas
wydzielenia 10cm

3

CO2 Miarą aktywności

sacharolitycznej jest ilość cm

3

CO2 wydzielona

przez 0,1 g s.s. drożdży w ciągu 1 godz.
Aktywność sacharolityczną wyrazić jako ilość
cm

3

CO2 wydzielonych przez 0,1g s.s (suchej

substancji) drożdży w ciągu 1 godz., wiedząc,
ż

e 1 mol CO2 = 44,0g odpowiada objętości

22,4 dm

3

.

11.

Czas podnoszenia ciasta

5g drożdży odważyć w zlewce, na wadze
technicznej z dokładnością do 0,01 g.
Sporządzić 160 cm

3

roztworu soli kuchennej o

stężeniu 2,5%. Przenieść odważone drożdże
za

pomocą

przygotowanego

roztworu

(ogrzanego do temp. 35°C) do 280 g mąki
ogrzanej w cieplarce do temp. 35°C, uprzednio
wsypanej do miesiarki. Zanotować czas
dodania drożdży do ciasta. Następnie miesić
ciasto przez 5min., po czym przenieść do
foremki

ogrzanej

do

temp.

35°C,

wysmarowanej wewnątrz olejem jadalnym.
Ciasto rozłożyć równomiernie w foremce,
zawiesić poprzeczkę i natychmiast wstawić

foremkę do cieplarki. Ciasto pozostawić w
cieplarce do chwili, gdy dotknie ono poprzeczki
(1 pęd). Następnie wyjąć foremkę z cieplarki i
w ciągu 1min. ugniatać ciasto w miesiarce lub
ręcznie, i ponownie umieścić w foremce.
Zawiesić poprzeczkę i wstawić całość do
cieplarki. Gdy ciasto dotknie poprzeczki,
zanotować czas (2 pęd) i powtórzyć wykonane
czynności dla trzeciego pędu.

Ad. 2.3 Bezpośrednie liczenie komórek
drożdży w zawiesinie.

Komory do liczenia drobnoustrojów pod
mikroskopem mają postać szklanych płytek z
wyciętym

wgłębieniem

podzielonym

na

kwadraty

lub

prostokąty

o

znanej

powierzchni.

Używane są komory Thoma (hemocytometr),
Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala i inne.
Różnią się one wymiarami powierzchni, na
których

liczy

się

drobnoustroje.

Dane

dotyczące powierzchni i głębokości podane
są na komorach.

W komorach można zasadniczo liczyć tylko
większe komórki drobnoustrojów, takie jak
drożdże,

zarodniki

i

strzępki

grzybów.

Ograniczenia te wynikają po pierwsze stąd, że
grubość i głębokość komory nie pozwalają na
użycie obiektywów o dużej sile powiększenia,
a więc tym samym o małej odległości roboczej
i po drugie przy dużej głębokości komory (100
mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje
np. bakterie o średnicy 5 mikrometrów (µm),
mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy
użyciu silniejszych obiektywów o małej głębi
ostrości część komórek położona nad i pod
płaszczyzną

pola

widzenia

będzie

niewidoczna.

Komorę Thoma przedstawia rysunek 3. Jest to
grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi
wgłębieniami o głębokości 0,1 mm (100 µm).
Wgłębienia te widoczne są gołym okiem po
obydwu stronach środkowego kanalika jako
równoramienne krzyże, powstałe z przecięcia
linii wyznaczających regularne, kwadratowe i
prostokątne

powierzchnie.

Bok

kwadratu

wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia
kwadracika wynosi więc 1/400 mm

2

(2500

µm

2

). W każdej siatce znajduje się 400

kwadracików. Po przykryciu komory szkiełkiem
przykrywkowym nad każdym kwadracikiem
powstaje prostopadłościan o objętości 1/400
mm

2

x 0,1mm = 1/4000 mm

3

(2500 µm x 100

Technologie Przemysłów Fermentacyjnych

Ć

W. 1

Drożdże – część praktyczna

Kierunek

Technologia Żywności

Rok III

Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt

3

µm

3

= 25 000 µm

3

). Co piąty kwadrat w obu

kierunkach podzielony jest na pół dodatkową
linią, w wyniku czego część kwadratów ma
powierzchnię o połowę mniejszą, a cała
komora podzielona jest w ten sposób na 16
dużych kwadratów, z których każdy składa się
z 16 małych kwadracików. Na przecięciu
dodatkowych

linii

powstają

maleńkie

kwadraciki

o

czterokrotnie

mniejszej

powierzchni równej 1/1600 mm

2

.

Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są
trzy

kanaliki

tworzące

literę

H,

dwa

poprzeczne i jeden środkowy, łączący je. Mają
one za zadanie zatrzymywać nadmiar płynu
naniesionego na komorę.

Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu
komory Thoma wykonuje się następująco.
Zawiesinę

komórek

drożdży

mających

tendencję do zlepiania się rozcieńcza się,
biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość
kwasu siarkowego rozcieńczonego wodą w
stosunku 1:10, wytrząsa się kilka minut,
przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa
szkiełkiem przykrywkowym i przystępuje do

liczenia. Po ustawieniu oświetlenia, należy
znaleźć

siatkę

komory

najpierw

przy

obiektywie 10x, a następnie przy obiektywie
40x.

Jeśli

stwierdzi

się

zbyt

duże

zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę
rozcieńczyć

ilościowo,

np.

10-krotnie

i

powtórzyć oznaczenie. Oblicza się średnią
liczbę drobnoustrojów z ok. 40 małych
kwadracików (o pow. 1/400 mm

2

). W sumie

należy policzyć ok. 700 komórek, by błąd nie
przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są
nierównomiernie, w jednych kwadracikach
może być ich kilka, a w innych - kilkanaście.

Przy średniej liczbie komórek w jednym
kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość
komórek (L) w 1 cm

3

wynosi:

L = 4 • 106 • a • n

Komora Thoma:
a – widok z góry,
b – widok z boku,
c– wgłębienie z naciętymi kwadratami,
c' –siatka kwadratów w powiększeniu