Technologie Przemysłów Fermentacyjnych
Ć
W. 1
Drożdże – część praktyczna
Kierunek
Technologia Żywności
Rok III
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt
1
Cel:
Poznanie budowy komórek drożdży i ich
fizjologii.
Wykonanie:
1. Badania makroskopowe
Rozróżnianie wybranych szczepów drożdży
piwowarskich, gorzelniczych i piekarskich
Na podłożu stałym po określonym czasie
hodowli w temp. 20°C należy zwrócić uwagę
na:
• rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub
pojedyncze kolonie),
• powierzchnię wzrostu (matowa, błyszcząca) i
strukturę kolonii (zwarta, mazista),
• zabarwienie i kształt kolonii.
2. Badania mikroskopowe
Obserwacje mikroskopowe: kształtu, wielkości,
sposobu ułożenia oraz rozmnażania komórek.
Preparaty wykonuje się z jednodobowych
kultur hodowanych na podłożu płynnym w
temp. 30°C. Preparaty mikroskopowe różnych
ras
drożdży:
winiarskich,
piwowarskich,
gorzelniczych, piekarskich.
2.1. Badanie żywotności drożdży
Polega na zabarwieniu ich wodnym roztworem
błękitu
metylenowego.
Na
szkiełku
przedmiotowym do kropli badanej zawiesiny
drożdży
dodaje
się
roztworu
barwnika,
przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i ogląda
pod mikroskopem. Komórki martwe barwią się
na niebiesko, natomiast żywe pozostają
niezabarwione.
2.2. Badanie obecności glikogenu
Przeprowadza się podobnie, jak badanie na
ż
ywotność z tym, że do barwienia używa się
płynu Lugola. Komórki zawierające glikogen
będą zabarwione na kolor ciemnobrunatny,
natomiast pozostałe na jasnożółty.
2.3 Oznaczanie ilości komórek w 1 cm
3
gęstwy drożdżowej
Sporządza się szereg rozcieńczeń gęstwy
drożdżowej (1:10, 1:50, 1:100) z udziałem
wody destylowanej i H
2
SO
4
(7cm
3
H2O + 2cm
3
H
2
SO
4
(1:10) + 1cm
3
gęstwy drożdżowej).
Materiał po dokładnym wymieszaniu nanosi się
pipetą na komorę Thoma i liczy pod
mikroskopem
komórki
drożdży
przy
powiększeniu 100-400 razy.
A. Drożdże piekarnicze
Cel ćwiczenia
Poznanie metod badań drożdży piekarskich
prasowanych, ocena technologiczna drożdży.
Wykonanie
3. Sprawdzanie masy drożdży piekarskich
suszonych
Zawartość opakowania zważyć z dokładnością
do 0,1 g – porównać z deklarowaną masą
netto.
4. Określenie barwy
Barwę
badanej
próbki
należy
określać
wzrokowo
przy
ś
wietle
dziennym
rozproszonym.
5. Określenie zapachu
Należy
przeprowadzić
w
pomieszczeniu
pozbawionym
obcych
zapachów,
zapach
drożdży
piekarskich
prasowanych
należy
określić bezpośrednio po skrojeniu wierzchniej
warstwy cegiełki, a zapach drożdży piekarskich
suszonych, paszowych i piwowarskich —
natychmiast po otwarciu opakowania.
6. Określenie konsystencji
Cegiełkę drożdży należy nagnieść lekko
palcem
w
ś
rodku
bocznej
powierzchni;
konsystencja powinna być ścisła, dopuszcza
się zewnętrzną mazistość, jeśli nie jest
połączona
z
przykrym
zapachem
rozkładającego się białka.
7. Obserwacja zawiesiny wodnej
Do probówki szklanej wrzucić grudkę drożdży
(około 1g na 20 cm
3
) pobraną z wnętrza
cegiełki, dodawać porcjami wodę do około
połowy pojemności probówki z korkiem.
Obserwować
zawiesinę
po
całkowitym
wymieszaniu — zawiesina powinna być
jednorodna, w ciągu 5 min nie powinna
wykazywać grudek ani kłaczków na dnie
probówki.
8. Zawartości suchej masy – metoda
suszarkowa
W naczyńku wagowym, wysuszonym w temp.
105°C do stałej masy i uprzednio zważonym,
odważyć około 1g drożdży z dokładnością do
0,001 g.
Naczyńko otwarte wraz z przykrywką umieścić
w suszarce na 1,5–2h, w temp. 55–60°C.
Technologie Przemysłów Fermentacyjnych
Ć
W. 1
Drożdże – część praktyczna
Kierunek
Technologia Żywności
Rok III
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt
2
Następnie
otwarte
naczyńko
ponownie
umieścić w suszarce, w temp. 105°C na 1h.
Oznaczenie uważa się za zakończone, jeśli
różnica masy po kolejnym dosuszeniu nie
przekracza 0,001g.
9. Kwasowość drożdży
Rozpuścić 10g drożdży w 50cm
3
wody
destylowanej
i
otrzymaną
zawiesinę
miareczkować
0,1
M
NaOH
wobec
fenoloftaleiny. Wynik podać w cm
3
1 M NaOH
na 100g drożdży.
10. Oznaczanie aktywności sacharolitycznej
drożdży
0,5g drożdży prasowanych, rozprowadzić w
10cm
3
wody wodociągowej o temp. 35°C. Do
otrzymanej zawiesiny dodać 10cm
3
, 10%
roztworu sacharozy ogrzanego do temp. 35°C.
Następnie postępować według metody A lub B,
w zależności od dostępnego wyposażenia.
A)
Kolbę zamknąć szczelnie korkiem
zaopatrzonym
w
rurkę
fermentacyjną
napełnioną
gliceryną,
zważyć
całość
z
dokładnością 0,01g, a następnie wstawić do
cieplarki (35°C) na okres 1 godziny. Znając
różnicę mas przed i po fermentacji obliczyć
ilość wydzielonego CO2 [cm
3
].
B)
Kolbę zamknąć szczelnie korkiem
zaopatrzonym w rurkę odprowadzającą CO2
do wyskalowanej biurety wypełnionej wodą i
wstawić do termostatu (35°C). Mierzyć czas
wydzielenia 10cm
3
CO2 Miarą aktywności
sacharolitycznej jest ilość cm
3
CO2 wydzielona
przez 0,1 g s.s. drożdży w ciągu 1 godz.
Aktywność sacharolityczną wyrazić jako ilość
cm
3
CO2 wydzielonych przez 0,1g s.s (suchej
substancji) drożdży w ciągu 1 godz., wiedząc,
ż
e 1 mol CO2 = 44,0g odpowiada objętości
22,4 dm
3
.
11.
Czas podnoszenia ciasta
5g drożdży odważyć w zlewce, na wadze
technicznej z dokładnością do 0,01 g.
Sporządzić 160 cm
3
roztworu soli kuchennej o
stężeniu 2,5%. Przenieść odważone drożdże
za
pomocą
przygotowanego
roztworu
(ogrzanego do temp. 35°C) do 280 g mąki
ogrzanej w cieplarce do temp. 35°C, uprzednio
wsypanej do miesiarki. Zanotować czas
dodania drożdży do ciasta. Następnie miesić
ciasto przez 5min., po czym przenieść do
foremki
ogrzanej
do
temp.
35°C,
wysmarowanej wewnątrz olejem jadalnym.
Ciasto rozłożyć równomiernie w foremce,
zawiesić poprzeczkę i natychmiast wstawić
foremkę do cieplarki. Ciasto pozostawić w
cieplarce do chwili, gdy dotknie ono poprzeczki
(1 pęd). Następnie wyjąć foremkę z cieplarki i
w ciągu 1min. ugniatać ciasto w miesiarce lub
ręcznie, i ponownie umieścić w foremce.
Zawiesić poprzeczkę i wstawić całość do
cieplarki. Gdy ciasto dotknie poprzeczki,
zanotować czas (2 pęd) i powtórzyć wykonane
czynności dla trzeciego pędu.
Ad. 2.3 Bezpośrednie liczenie komórek
drożdży w zawiesinie.
Komory do liczenia drobnoustrojów pod
mikroskopem mają postać szklanych płytek z
wyciętym
wgłębieniem
podzielonym
na
kwadraty
lub
prostokąty
o
znanej
powierzchni.
Używane są komory Thoma (hemocytometr),
Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala i inne.
Różnią się one wymiarami powierzchni, na
których
liczy
się
drobnoustroje.
Dane
dotyczące powierzchni i głębokości podane
są na komorach.
W komorach można zasadniczo liczyć tylko
większe komórki drobnoustrojów, takie jak
drożdże,
zarodniki
i
strzępki
grzybów.
Ograniczenia te wynikają po pierwsze stąd, że
grubość i głębokość komory nie pozwalają na
użycie obiektywów o dużej sile powiększenia,
a więc tym samym o małej odległości roboczej
i po drugie przy dużej głębokości komory (100
mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje
np. bakterie o średnicy 5 mikrometrów (µm),
mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy
użyciu silniejszych obiektywów o małej głębi
ostrości część komórek położona nad i pod
płaszczyzną
pola
widzenia
będzie
niewidoczna.
Komorę Thoma przedstawia rysunek 3. Jest to
grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi
wgłębieniami o głębokości 0,1 mm (100 µm).
Wgłębienia te widoczne są gołym okiem po
obydwu stronach środkowego kanalika jako
równoramienne krzyże, powstałe z przecięcia
linii wyznaczających regularne, kwadratowe i
prostokątne
powierzchnie.
Bok
kwadratu
wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia
kwadracika wynosi więc 1/400 mm
2
(2500
µm
2
). W każdej siatce znajduje się 400
kwadracików. Po przykryciu komory szkiełkiem
przykrywkowym nad każdym kwadracikiem
powstaje prostopadłościan o objętości 1/400
mm
2
x 0,1mm = 1/4000 mm
3
(2500 µm x 100
Technologie Przemysłów Fermentacyjnych
Ć
W. 1
Drożdże – część praktyczna
Kierunek
Technologia Żywności
Rok III
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt
3
µm
3
= 25 000 µm
3
). Co piąty kwadrat w obu
kierunkach podzielony jest na pół dodatkową
linią, w wyniku czego część kwadratów ma
powierzchnię o połowę mniejszą, a cała
komora podzielona jest w ten sposób na 16
dużych kwadratów, z których każdy składa się
z 16 małych kwadracików. Na przecięciu
dodatkowych
linii
powstają
maleńkie
kwadraciki
o
czterokrotnie
mniejszej
powierzchni równej 1/1600 mm
2
.
Na powierzchni komory Thoma wyżłobione są
trzy
kanaliki
tworzące
literę
H,
dwa
poprzeczne i jeden środkowy, łączący je. Mają
one za zadanie zatrzymywać nadmiar płynu
naniesionego na komorę.
Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu
komory Thoma wykonuje się następująco.
Zawiesinę
komórek
drożdży
mających
tendencję do zlepiania się rozcieńcza się,
biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość
kwasu siarkowego rozcieńczonego wodą w
stosunku 1:10, wytrząsa się kilka minut,
przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa
szkiełkiem przykrywkowym i przystępuje do
liczenia. Po ustawieniu oświetlenia, należy
znaleźć
siatkę
komory
najpierw
przy
obiektywie 10x, a następnie przy obiektywie
40x.
Jeśli
stwierdzi
się
zbyt
duże
zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę
rozcieńczyć
ilościowo,
np.
10-krotnie
i
powtórzyć oznaczenie. Oblicza się średnią
liczbę drobnoustrojów z ok. 40 małych
kwadracików (o pow. 1/400 mm
2
). W sumie
należy policzyć ok. 700 komórek, by błąd nie
przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są
nierównomiernie, w jednych kwadracikach
może być ich kilka, a w innych - kilkanaście.
Przy średniej liczbie komórek w jednym
kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość
komórek (L) w 1 cm
3
wynosi:
L = 4 • 106 • a • n
Komora Thoma:
a – widok z góry,
b – widok z boku,
c– wgłębienie z naciętymi kwadratami,
c' –siatka kwadratów w powiększeniu