KOMÓRKI KOMPETENTNE

1. projektowanie starterów, na co zwrócić uwagę, czego unikać
2. potrzebna będzie mapa wektora pGEX-2T z pierwszych zajęć!!!
3. wiedzieć co to jest ORF + przyda się mała powtórka translacji, tj, START/STOP
4. sposoby ukompetentniania komóre i wprowadzania DNA do komórek (można znaleźć z Stryerze, lub w
Gene cloning...)
5. co to OD, dlaczego 600 i po co czekamy na określoną wartość OD
6. dlaczego będziemy stosować tetracyklinę
7. Porównać składy roztworów A, B i C i zastanowić się dlaczego akurat takie są
8. Analiza genotypu szczepu, z którym pracujemy znaczenie poszczególnych markerów
9. na e-portalu każda z grup ma możliwość pobrania dokumentu z analizą densytometryczną wektora (gr.
4 ze środy znajdzie swoje pasmo pod numerem 7 na żelu z grupy piątkowej), spróbujcie wykoncypować
jak na podstawie posiadanych danych można oszacować stężenie Waszych próbek, oprócz wspomnianego
pliku przydadzą się Wam dokładne dane na temat markera z jakim pracowaliśmy (w tym użytej jego
objętości) a także znajomość objętości próbki DNA niesionej na żel) - bez paniki jeśli ktoś sobie nie
poradzi, zrobimy to wspólnie podczas najbliższych zajęć (dlatego miejcie ze sobą wydruk oraz dane o
markerze)

Transkrypcja:
Promotor prokariotyczny:
Start: kaseta TATAAT (Pribnowa) rejon -10, rejon -35
Stop: spinka bogata w G-C i ciąg poliU
Translacja:
Prokarioty: sekwencja Shine-Dalgarno w mRNA na końcu 5’ rozpoznawana przez podjednostkę 16S
rybosomu (16S rRNA-sekwencja anty Shine-Dalgarno) - mRNA policistronowe
Eukarioty: - kap na końcu 5’, sekwencja Kozak - mRNA monocistronowe
Start:AUG
Stop:UAA, UAG, UGA

Kompetencja może być indukowana przez:
- warunki wpływające hamująco na wzrost, np. wysokie stężenie cAMP
- gęstość populacji bakteryjnej CZY KTOŚ MOŻE TO ROZWINĄĆ????
- transbłonowy transport wapnia
- warunki żywieniowe

Inkubujemy do odpowiedniego OD (ok. 0,4), bo w inoculum było dużo martwych i starych komórek, a
my chcemy mieć hodowlę w fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę nadal prowadzimy w podłożu z
tetracykliną, bo chcemy, żeby komórki potomne też dostawały plazmid z genem oporności. Mierzymy przy
długości 600nm-rozproszenie światła przez komórki w zawiesinie.

Ukompetentnianie:
Kationy dwuwartościowe opłaszczają komórkę zmieniając ładunek na błonie na dodatni (oddziałują
z ujemnym ładunkiem fosfolipidów). Przechowywanie w -80 C sprawia, że błona staje się bardziej
przepuszczalna. Po dodaniu DNA adsorbuje się na powierzchni komórki (oddziaływania elektrostatyczne).
Po zwiększeniu temperatury do 37 C DNA zostaje wchłonięte do komórki.
ELEKTROPORACJA-metoda fizyczna

Ile dodać tetracykliny?

Przy Rx20 możemy zaniedbać x w V2.