„

„

Z czego sk

Z czego sk

ł

ł

ada si

ada si

ę

ę

ziele

ziele

ń

ń

p

p

ó

ó

l i las

l i las

ó

ó

w

w

”

”

Chromatografia cieczowa jako technika

Chromatografia cieczowa jako technika

analityczna i technika otrzymywania substancji

analityczna i technika otrzymywania substancji

--

--

podstawy i g

podstawy i g

ł

ł

ó

ó

wne zasady stosowania

wne zasady stosowania

–

–

Najwa

Najwa

ż

ż

niejsze informacje wprowadzaj

niejsze informacje wprowadzaj

ą

ą

ce

ce

‹

‹

-

-

Chromatografia

Chromatografia

-

-

technika rozdzielania substancji / cz

technika rozdzielania substancji / cz

ą

ą

stek

stek

w

w

uk

uk

ł

ł

adach ciecz

adach ciecz

–

–

cia

cia

ł

ł

o sta

o sta

ł

ł

e, albo ciecz

e, albo ciecz

-

-

ciecz

ciecz

‹

‹

-

-

Znaczenie rozdzielania

Znaczenie rozdzielania

-

-

rozdzieli

rozdzieli

ć

ć

= zidentyfikowa

= zidentyfikowa

ć

ć

, oznaczy

, oznaczy

ć

ć

‹

‹

-

-

Techniki chromatograficzne

Techniki chromatograficzne

-

-

LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)

LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)

‹

‹

-

-

Mechanizmy fizykochemiczne

Mechanizmy fizykochemiczne

-

-

NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...

NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...

Warunek konieczny rozdzielenia

Warunek konieczny rozdzielenia

Konkurencja oddzia

Konkurencja oddzia

ł

ł

ywa

ywa

ń

ń

sorpcyjnych o por

sorpcyjnych o por

ó

ó

wnywalnych energiach, w

wnywalnych energiach, w

uk

uk

ł

ł

adzie: faza stacjonarna

adzie: faza stacjonarna

–

–

faza ruchoma

faza ruchoma

–

–

substancje rozdzielane

substancje rozdzielane

‹

‹

-

-

Zastosowania

Zastosowania

-

-

sk

sk

ł

ł

adniki ro

adniki ro

ś

ś

lin, p

lin, p

ł

ł

yn

yn

ó

ó

w fizjologicznych,

w fizjologicznych,

monitoring

monitoring

ś

ś

rodowiska, kontrola jako

rodowiska, kontrola jako

ś

ś

ci,

ci,

kontrola proces

kontrola proces

ó

ó

w technologicznych,

w technologicznych,

polidyspersyjno

polidyspersyjno

ść

ść

polimer

polimer

ó

ó

w, ... ,

w, ... ,

ale tak

ale tak

ż

ż

e:

e:

rozdzielanie grupowe, przygotowanie pr

rozdzielanie grupowe, przygotowanie pr

ó

ó

bek do analizy,

bek do analizy,

wyznaczanie parametr

wyznaczanie parametr

ó

ó

w fizykochemicznych substancji, ...

w fizykochemicznych substancji, ...

Prof. dr hab. inż. Marian Kamiński

Mi

Mi

chai

chai

ł

ł

Cwiet

Cwiet

(1872

(1872

-

-

1919)

1919)

“

“

Like light rays in the

Like light rays in the

spectrum, the different

spectrum, the different

components of a pigment

components of a pigment

mixture, obeying a law, are

mixture, obeying a law, are

resolved on the calcium

resolved on the calcium

carbonate column and then

carbonate column and then

can be qualitatively and

can be qualitatively and

quantitatively determined. I

quantitatively determined. I

call such a preparation a

call such a preparation a

chromatogram and the

chromatogram and the

corresponding method the

corresponding method the

chromatographic method.

chromatographic method.

”

”

Odkrywca techniki kolumnowej

Odkrywca techniki kolumnowej

„Klasyczna” technika kolumnowa

ELUENT

ELUAT,

substancje rozdzielane

S

t

R

– czas retencji

M

M

R

t

t

t

k

−

=

M

R

M

R

t

t

t

t

k

k

−

−

=

=

1

2

1

2

α

2

54

,

5

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

=

h

R

w

t

N

k –współczynnik retencji

- współczynnik rozdzielenia

α

N-liczba półek teoretycznych

2

2

2

1

1

4

1

N

k

k

R

S

⋅

+

⋅

−

⋅

=

α

α

Rs -rozdzielczość pików
-zależność „teoretyczna”

t

M

– czas martwy kolumny - retencja

substancji niesorbowanej, wnikającej

do porów wypełnienia kolumny

Informacje „niesione” z chromatogramem i podstawowe

zależności

Rs=(t

Rn+1

– t

Rn

) / ½(S

n+1

+ S

n

)

- zależność „obliczeniowa”

Kilka podstawowych poj

Kilka podstawowych poj

ęć

ęć

‹

‹

Uk

Uk

ł

ł

ad chromatograficzny

ad chromatograficzny

(faza stacjonarna

(faza stacjonarna

–

–

faza ruchoma

faza ruchoma

–

–

okre

okre

ś

ś

lone oddzia

lone oddzia

ł

ł

ywania sorpcyjne / mechanizmy separacji)

ywania sorpcyjne / mechanizmy separacji)

‹

‹

Retencja substancji

Retencja substancji

(spowolnienie elucji

(spowolnienie elucji

-

-

wzgl

wzgl

ę

ę

dem

dem

„

„

u

u

”

”

);

);

‹

‹

Selektywno

Selektywno

ść

ść

rozdzielania

rozdzielania

(stopie

(stopie

ń

ń

zr

zr

ó

ó

ż

ż

nicowania retencji);

nicowania retencji);

‹

‹

Sprawno

Sprawno

ść

ść

rozdzielania

rozdzielania

(miara dyspersji stref substancji);

(miara dyspersji stref substancji);

‹

‹

Pr

Pr

ę

ę

dko

dko

ść

ść

„

„

u

u

”

”

[mm/s],

[mm/s],

nat

nat

ęż

ęż

enie przep

enie przep

ł

ł

ywu eluentu

ywu eluentu

„

„

w

w

”

”

[mL/min]

[mL/min]

‹

‹

Op

Op

ó

ó

r przep

r przep

ł

ł

ywu w kolumnie

ywu w kolumnie

Δ

Δ

P [

P [

MPa

MPa

] = 32

] = 32

u

u

*

*

Lc

Lc

*

*

η

η

/ dp

/ dp

2

2

‹

‹

Kolumna o d

Kolumna o d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci

ci

(

(

Lc

Lc

)

)

,

,

ś

ś

rednicy

rednicy

(dc)

(dc)

, wype

, wype

ł

ł

nienie ziarniste

nienie ziarniste

(

(

dp

dp

, d, A)

, d, A)

/

/

„

„

monolityczne

monolityczne

”

”

(

(

dm

dm

, d, A)

, d, A)

‹

‹

Sorbent

Sorbent

-

-

ziarnisto

ziarnisto

ść

ść

, pory wewn

, pory wewn

ą

ą

trz

trz

-

-

ziarnowe i mi

ziarnowe i mi

ę

ę

dzy

dzy

-

-

ziarnowe, porowato

ziarnowe, porowato

ść

ść

(

(

ε

ε

wz

wz

,

,

ε

ε

mz

mz

,

,

ε

ε

T

T

)

)

, powierzchnia sorpcyjna

, powierzchnia sorpcyjna

(A

(A

-

-

nawet do 750 m

nawet do 750 m

2

2

/g)

/g)

‹

‹

Detekcja i detektory

Detekcja i detektory

(st

(st

ęż

ęż

eniowe , masowe);

eniowe , masowe);

‹

‹

Czu

Czu

ł

ł

o

o

ść

ść

i liniowo

i liniowo

ść

ść

detekcji;

detekcji;

‹

‹

Zasady post

Zasady post

ę

ę

powania analitycznego

powania analitycznego

(metoda krzywej kalibracyjnej

(metoda krzywej kalibracyjnej

–

–

w tym

w tym

-

-

punkt

punkt

ó

ó

w ograniczaj

w ograniczaj

ą

ą

cych, wzorca wewn

cych, wzorca wewn

ę

ę

trznego, dodatku wzorca,

trznego, dodatku wzorca,

normalizacji)

normalizacji)

Mechanizmy separacji

Mechanizmy separacji

‹

‹

Warunki RP

Warunki RP

–

–

hydrofobowo

hydrofobowo

ść

ść

‹

‹

Warunki NP

Warunki NP

–

–

polarno

polarno

ść

ść

, polaryzacja,

, polaryzacja,

dyspersja, wi

dyspersja, wi

ą

ą

zania wodorowe

zania wodorowe

;

;

‹

‹

Warunki IC

Warunki IC

–

–

wymiana jon

wymiana jon

ó

ó

w

w

‹

‹

Warunki wykluczania (chromatografii

Warunki wykluczania (chromatografii

ż

ż

elowej)

elowej)

–

–

zr

zr

ó

ó

ż

ż

nicowanie dr

nicowanie dr

ó

ó

g i

g i

czasu dyfuzji sk

czasu dyfuzji sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w pr

w pr

ó

ó

bki

bki

‹

‹

Inne:

Inne:

HIC,LILHIC,NP

HIC,LILHIC,NP

-

-

w,LEC,AC,EC

w,LEC,AC,EC

,...

,...

Kolumna do chromatografii

Kolumna do chromatografii

cieczowej

cieczowej

-

-

Rurka o bardzo g

Rurka o bardzo g

ł

ł

adkiej

adkiej

ś

ś

ciance, o

ciance, o

ś

ś

rednicy (

rednicy (

dc)

dc)

, wype

, wype

ł

ł

niona

niona

sorbentem o przeci

sorbentem o przeci

ę

ę

tnej (

tnej (

ś

ś

redniej) wielko

redniej) wielko

ś

ś

ci ziaren

ci ziaren

(

(

dp

dp

)

)

i d

i d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci

ci

warstwy wype

warstwy wype

ł

ł

nienia

nienia

(

(

Lc

Lc

)

)

–

–

kolumny

kolumny

„

„

klasyczne

klasyczne

”

”

,

,

mikropakowane

mikropakowane

, kapilarne

, kapilarne

„

„

otwarte

otwarte

”

”

, preparatywne, procesowe

, preparatywne, procesowe

;

;

-

-

Wype

Wype

ł

ł

nienie powinno by

nienie powinno by

ć

ć

u

u

ł

ł

o

o

ż

ż

one r

one r

ó

ó

wnomiernie w przekroju

wnomiernie w przekroju

poprzecznym, zapewniaj

poprzecznym, zapewniaj

ą

ą

c

c

„

„

t

t

ł

ł

okowy

okowy

”

”

profil przep

profil przep

ł

ł

ywu;

ywu;

(u

(u

≠

≠

f (dc))

f (dc))

-

-

Wype

Wype

ł

ł

nienie u

nienie u

ł

ł

o

o

ż

ż

one w spos

one w spos

ó

ó

b stabilny, zapewniaj

b stabilny, zapewniaj

ą

ą

cy brak

cy brak

„

„

osiadania

osiadania

”

”

z

z

ł

ł

o

o

ż

ż

a; W celu stabilizacji wype

a; W celu stabilizacji wype

ł

ł

nienia kolumny

nienia kolumny

preparatywnej stosowane s

preparatywnej stosowane s

ą

ą

takie

takie

„

„

zabiegi

zabiegi

”

”

, jak dynamiczna

, jak dynamiczna

kompresja osiowa z

kompresja osiowa z

ł

ł

o

o

ż

ż

a (DAC), albo/i kompresja radialna

a (DAC), albo/i kompresja radialna

(promieniowa) wype

(promieniowa) wype

ł

ł

nienia.

nienia.

Wype

Wype

ł

ł

nienie ziarniste kolumny HPLC

nienie ziarniste kolumny HPLC

Wype

Wype

ł

ł

nienie monolityczne

nienie monolityczne

DYSPERSJA MASY w KOLUMNIE

Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji

Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny – wzrasta H i spada N

Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H),

tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych – tym wyższa sprawność

rozdzielania - także - kolumny

Dyspersja stref

Dyspersja stref

zjawisko niekorzystne,

zjawisko niekorzystne,

jednak, nieuniknione

jednak, nieuniknione

‹

‹

Zjawiska powoduj

Zjawiska powoduj

ą

ą

ce dyspersj

ce dyspersj

ę

ę

-

-

Dyfuzja

Dyfuzja

„

„

wirowa

wirowa

”

”

(A);

(A);

-

-

Dyfuzja molekularna (B);

Dyfuzja molekularna (B);

-

-

Opory przenoszenia masy (C)

Opory przenoszenia masy (C)

1.

1.

w fazie ruchomej (Cm),

w fazie ruchomej (Cm),

2.

2.

w fazie stacjonarnej (Cs)

w fazie stacjonarnej (Cs)

R

R

ó

ó

wnanie

wnanie

Van

Van

Deemter

Deemter

’

’

a

a

,

,

H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u

H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u

albo bardziej adekwatne dla

albo bardziej adekwatne dla

LC

LC

–

–

r

r

ó

ó

wnania

wnania

:

:

Knox

Knox

’

’

a

a

, lub

, lub

Giddings

Giddings

’

’

a

a

C

B

A

H

+

=

min

BC

A

H

+

=

min

C

B

u

opt

=

Zale

Zale

ż

ż

no

no

ś

ś

ci najprostsze, aktualne dla CGC

ci najprostsze, aktualne dla CGC

–

–

w przypadku

w przypadku

HPLC, tylko w przybli

HPLC, tylko w przybli

ż

ż

eniu i co do zasady

eniu i co do zasady

Instrumentalizacja chromatografii

Instrumentalizacja chromatografii

–

–

aparatura chromatograficzna

aparatura chromatograficzna

-

-

‹

‹

Nale

Nale

ż

ż

y zapewni

y zapewni

ć

ć

:

:

-

-

Sta

Sta

ł

ł

e

e

(w, u =

(w, u =

const

const

)

)

,

,

albo zmienne w funkcji czasu,

albo zmienne w funkcji czasu,

zaprogramowane nat

zaprogramowane nat

ęż

ęż

enie przep

enie przep

ł

ł

ywu eluentu

ywu eluentu

(u, w =

(u, w =

f(t

f(t

))

))

, o zaprogramowanej

, o zaprogramowanej

–

–

sta

sta

ł

ł

ej

ej

(elucja

(elucja

izokratyczna)

izokratyczna)

,

,

albo zmiennej w funkcji czasu

albo zmiennej w funkcji czasu

-

-

zawarto

zawarto

ś

ś

ci poszczeg

ci poszczeg

ó

ó

lnych sk

lnych sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w

w

eluentu

eluentu

(elucja gradientowa)

(elucja gradientowa)

oraz

oraz

-

-

sta

sta

łą

łą

(

(

T=const

T=const

, warunki izotermiczne)

, warunki izotermiczne)

,

,

albo zmienn

albo zmienn

ą

ą

,

,

zaprogramowan

zaprogramowan

ą

ą

w funkcji czasu

w funkcji czasu

(

(

T=f(t

T=f(t

), warunki

), warunki

„

„

gradientu temperatury

gradientu temperatury

”

”

)

)

–

–

temperatur

temperatur

ę

ę

separacji.

separacji.

Instrumentalizacja chromatografii

Instrumentalizacja chromatografii

–

–

aparatura chromatograficzna

aparatura chromatograficzna

-

-

‹

‹

Nale

Nale

ż

ż

y tak

y tak

ż

ż

e:

e:

-

-

Zapewni

Zapewni

ć

ć

czu

czu

łą

łą

, wystarczaj

, wystarczaj

ą

ą

co

co

uniwersaln

uniwersaln

ą

ą

, albo wysoce specyficzn

, albo wysoce specyficzn

ą

ą

( oraz,

( oraz,

o ile to mo

o ile to mo

ż

ż

liwe)

liwe)

liniow

liniow

ą

ą

w szerokim zakresie

w szerokim zakresie

st

st

ęż

ęż

e

e

ń

ń

detekcj

detekcj

ę

ę

obecno

obecno

ś

ś

ci i zawarto

ci i zawarto

ś

ś

ci

ci

rozdzielanych substancji w eluacie

rozdzielanych substancji w eluacie

wyp

wyp

ł

ł

ywaj

ywaj

ą

ą

cym z kolumny,

cym z kolumny,

-

-

Celowe jest,

Celowe jest,

dodatkowo

dodatkowo

, stosowanie systemu

, stosowanie systemu

prze

prze

łą

łą

czania kolumn i zapewnienie

czania kolumn i zapewnienie

mo

mo

ż

ż

liwo

liwo

ś

ś

ci stosowania przep

ci stosowania przep

ł

ł

ywu

ywu

zwrotnego w kolumnie chromatograficznej

zwrotnego w kolumnie chromatograficznej

SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO – etap kondycjonowania kolumny

SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO - etap rozdzielania substancji

Schemat aparatu pompowego PG

Schemat aparatu pompowego PG

D

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu

HPLC do zastosowa

HPLC do zastosowa

ń

ń

w dydaktyce

w dydaktyce

–

–

elucja izokratyczna

elucja izokratyczna

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu

Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu

HPLC do zastosowa

HPLC do zastosowa

ń

ń

w dydaktyce

w dydaktyce

–

–

elucja gradientowa

elucja gradientowa

SYSTEM PRZE

SYSTEM PRZE

ŁĄ

ŁĄ

CZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEP

CZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEP

Ł

Ł

YWU ZWROTNEGO

YWU ZWROTNEGO

Thin Layer: 1889

Thin Layer: 1889

Chromatografia planarna

Chromatografia planarna

–

–

cienkowarstwowa (TLC), bibu

cienkowarstwowa (TLC), bibu

ł

ł

owa (PC)

owa (PC)

FAZA RUCHOMA

FAZA RUCHOMA

a

b

c

d

d

a

Rf

=

1

d

b

Rf

=

2

d

c

Rf

=

3

k= ( 1/Rf ) - 1

Detekcja

Detekcja

–

–

Detektory w HPLC /

Detektory w HPLC /

TLC

TLC

‹

‹

Detektor chromatograficzny

Detektor chromatograficzny

–

–

przep

przep

ł

ł

ywowy instrument

ywowy instrument

analityczny o znikomej obj

analityczny o znikomej obj

ę

ę

to

to

ś

ś

ci naczy

ci naczy

ń

ń

ka pomiarowego;

ka pomiarowego;

‹

‹

Nie istnieje dotychczas w pe

Nie istnieje dotychczas w pe

ł

ł

ni uniwersalny detektor w LC,

ni uniwersalny detektor w LC,

st

st

ą

ą

d stosuje si

d stosuje si

ę

ę

wiele r

wiele r

ó

ó

ż

ż

nych;

nych;

‹

‹

Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowo

Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowo

ś

ś

ci

ci

odpowiedzi detektora we wsp

odpowiedzi detektora we wsp

ó

ó

ł

ł

czesnej HPLC;

czesnej HPLC;

‹

‹

UV (200

UV (200

-

-

400nm)/ UV

400nm)/ UV

-

-

VIS (200

VIS (200

-

-

800 nm) i szczeg

800 nm) i szczeg

ó

ó

lne

lne

znaczenie detektora typu DAD (

znaczenie detektora typu DAD (

diode

diode

array

array

detector

detector

)

)

‹

‹

RID (

RID (

refractive

refractive

index

index

detector

detector

)

)

‹

‹

LLSD (laser

LLSD (laser

light

light

scattering

scattering

detector

detector

)

)

‹

‹

FLD (

FLD (

fluorescence

fluorescence

detector

detector

)

)

‹

‹

El

El

-

-

D (

D (

electrochemical

electrochemical

detector

detector

, typ

, typ

amperometryczny

amperometryczny

)

)

‹

‹

CD (

CD (

coductometric

coductometric

detector

detector

-

-

supresja

supresja

jon

jon

ó

ó

w eluentu)

w eluentu)

‹

‹

LC

LC

-

-

MS,

MS,

LC

LC

-

-

MS

MS

-

-

MS

MS

(mas

(mas

-

-

spectrometry

spectrometry

)

)

‹

‹

inne (FTIR, NMR, LC

inne (FTIR, NMR, LC

-

-

FID, Radiometryczny, Polarymetryczny,

FID, Radiometryczny, Polarymetryczny,

Pomiaru momentu dipolowego, ....)

Pomiaru momentu dipolowego, ....)

‹

‹

Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika

Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika

derywatyzacji post

derywatyzacji post

-

-

kolumnowej w przypadku HPLC

kolumnowej w przypadku HPLC

Nowoczesna detekcja i detektory

Nowoczesna detekcja i detektory

-

-

UV

UV

-

-

DAD

DAD

, LC

, LC

-

-

MS, GC

MS, GC

-

-

MS

MS

-

-

‹

‹

Poj

Poj

ę

ę

cie absorpcji

cie absorpcji

ś

ś

wiat

wiat

ł

ł

a, prawo absorpcji

a, prawo absorpcji

ś

ś

wiat

wiat

ł

ł

a:

a:

[

[

-

-

lg(I

lg(I

/

/

I

I

o

o

)]=

)]=

lg(I

lg(I

o

o

/

/

I)=

I)=

ABS=k

ABS=k

*

*

c

c

*

*

l

l

‹

‹

Widmo, jakie informacje niesie widmo ?

Widmo, jakie informacje niesie widmo ?

‹

‹

Chromatogram detektora

Chromatogram detektora

UV

UV

-

-

DAD

DAD

-

-

kilkadziesi

kilkadziesi

ą

ą

t

t

chromatogram

chromatogram

ó

ó

w jednocze

w jednocze

ś

ś

nie

nie

‹

‹

Najwygodniejsze

Najwygodniejsze

-

-

odwzorowanie poziomicowe

odwzorowanie poziomicowe

‹

‹

Wnikliwa analiza przebiegu widma umo

Wnikliwa analiza przebiegu widma umo

ż

ż

liwia

liwia

identyfikacj

identyfikacj

ę

ę

substancji o charakterystycznym

substancji o charakterystycznym

przebiegu widma

przebiegu widma

-

-

jednocze

jednocze

ś

ś

nie

nie

-

-

na podstawie

na podstawie

retencji i cech widma

retencji i cech widma

‹

‹

Problem

Problem

–

–

widmo

widmo

„

„

w

w

ł

ł

asne

asne

”

”

sk

sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w eluentu

w eluentu

Chromatogram

Chromatogram

Wykres zale

Wykres zale

ż

ż

no

no

ś

ś

ci st

ci st

ęż

ęż

enia substancji w eluacie wyp

enia substancji w eluacie wyp

ł

ł

ywaj

ywaj

ą

ą

cym z kolumny

cym z kolumny

w funkcji

w funkcji

obj

obj

ę

ę

to

to

ś

ś

ci elucji, a gdy nat

ci elucji, a gdy nat

ęż

ęż

enie przep

enie przep

ł

ł

ywu eluentu

ywu eluentu

jest sta

jest sta

ł

ł

e

e

(w, u =

(w, u =

const

const

)

)

–

–

w funkcji czasu

w funkcji czasu

Opis ka

Opis ka

ż

ż

dego chromatogramu powinien zawiera

dego chromatogramu powinien zawiera

ć

ć

:

:

-

-

cel badania, dane o pr

cel badania, dane o pr

ó

ó

bce, kolumnie, warunkach elucji

bce, kolumnie, warunkach elucji

(sk

(sk

ł

ł

adniki i sk

adniki i sk

ł

ł

ad eluentu , albo sk

ad eluentu , albo sk

ł

ł

adniki eluentu i program elucji),

adniki eluentu i program elucji),

-

-

zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program d

zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program d

ł

ł

ugo

ugo

ś

ś

ci fali,

ci fali,

-

-

nazwy substancji odpowiadaj

nazwy substancji odpowiadaj

ą

ą

cych pikom chromatograficznym

cych pikom chromatograficznym

Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLC

Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLC

-

Co to jest i co szczeg

Co to jest i co szczeg

ó

ó

lnego przedstawia ?

lnego przedstawia ?

(np.

(np.

„

„

Chromatogram rozdzielania sk

Chromatogram rozdzielania sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w

w

metanolowego ekstraktu ro

metanolowego ekstraktu ro

ś

ś

liny z gatunku

liny z gatunku

Dionea,

Dionea,

otrzymany w warunkach uk

otrzymany w warunkach uk

ł

ł

adu faz

adu faz

odwr

odwr

ó

ó

conych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego prog

conych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego prog

ramu elucji

ramu elucji

”

”

,

,

chromatograf MERCK

chromatograf MERCK

-

-

HITACHI,

HITACHI,

LaChrom

LaChrom

);

);

-

Pr

Pr

ó

ó

bka, warunki rozdzielania, warunki detekcji

bka, warunki rozdzielania, warunki detekcji

-

-

Pr

Pr

ó

ó

bka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu li

bka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu li

ś

ś

ci ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztw

ci ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztw

ó

ó

r

r

mieszaniny wzorc

mieszaniny wzorc

ó

ó

w w MeOH o st

w w MeOH o st

ęż

ęż

eniu ka

eniu ka

ż

ż

dego sk

dego sk

ł

ł

adnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.;

adnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.;

-

-

Kolumna i wype

Kolumna i wype

ł

ł

nienie kolumny (np.

nienie kolumny (np.

„

„

Lichrocart 125 x 4 mm

Lichrocart 125 x 4 mm

i.d., Lichrospher RP 18e 5 um

i.d., Lichrospher RP 18e 5 um

)

)

;

;

-

-

Eluent / program elucji (np. eluent: MeOH

Eluent / program elucji (np. eluent: MeOH

-

-

H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A:

H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A:

woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B:

woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B:

MeOH

MeOH

-

-

AcCN

AcCN

-

-

THF

THF

45/

45/

45

45

/10 v/v+0.75% TFA,

/10 v/v+0.75% TFA,

program elucji: 0 do 5 min

program elucji: 0 do 5 min

-

-

5% B, 5 do 25 min

5% B, 5 do 25 min

–

–

5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min

5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min

–

–

95% B;

95% B;

-

-

Przep

Przep

ł

ł

yw i ewentualnie ci

yw i ewentualnie ci

ś

ś

nienie (np. 1.5 ml/min, (9.5

nienie (np. 1.5 ml/min, (9.5

-

-

17

17

MPa

MPa

));

));

-

-

Detektor i warunki detekcji (np. detektor UV

Detektor i warunki detekcji (np. detektor UV

-

-

VIS typ DAD, L

VIS typ DAD, L

-

-

7450A MERCK, albo detektor

7450A MERCK, albo detektor

UV

UV

-

-

254 nm z kuwet

254 nm z kuwet

ą

ą

o czu

o czu

ł

ł

o

o

ś

ś

ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10

ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10

mV

mV

) itp., itd.

) itp., itd.

Piki chromatograficzne

Piki chromatograficzne:

(powinna by

(powinna by

ć

ć

informacja o ka

informacja o ka

ż

ż

dym piku, np. 1

dym piku, np. 1

–

–

beta karoten, 2 1OH

beta karoten, 2 1OH

-

-

naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5,

naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5,

7

7

-

-

9. substancje nieznane, 6. 1

9. substancje nieznane, 6. 1

-

-

CH3

CH3

Naftalen, itp., itd. ...)

Naftalen, itp., itd. ...)

Warunki szczeg

Warunki szczeg

ó

ó

lne i informacje dodatkowe

lne i informacje dodatkowe

(je

(je

ś

ś

li dotyczy ...).

li dotyczy ...).

W ten spos

W ten spos

ó

ó

b powinien by

b powinien by

ć

ć

opisany ka

opisany ka

ż

ż

dy

dy

chromatogram

chromatogram

za

za

łą

łą

czony do sprawozdania

czony do sprawozdania

laborato

laborato

-

-

ryjnego

ryjnego

, w pracy naukowej, albo raporcie z bada

, w pracy naukowej, albo raporcie z bada

ń

ń

. Ka

. Ka

ż

ż

dy wydruk raportu powinien mie

dy wydruk raportu powinien mie

ć

ć

opis

opis

danych, kt

danych, kt

ó

ó

re zawiera, mo

re zawiera, mo

ż

ż

e to by

e to by

ć

ć

w cz

w cz

ęś

ęś

ci zrealizowane w formie zastosowania symboli i

ci zrealizowane w formie zastosowania symboli i

wyja

wyja

ś

ś

nienia znaczenia symboli. Ka

nienia znaczenia symboli. Ka

ż

ż

dy raport powinien zawiera

dy raport powinien zawiera

ć

ć

te

te

ż

ż

informacj

informacj

ę

ę

o wykonawcy

o wykonawcy

badania oraz dat

badania oraz dat

ę

ę

i czas wykonania badania.

i czas wykonania badania.

Widmo

-piren –

Funkcja

analizy

jakościowej

Chromatogram – program dł. Fali

Funkcja analizy ilościowej

Chromatogram detektora UV-DAD

– odwzorowanie poziomicowe

ABS=f(t,

λ)

ABS-f(t)

ABS=f(λ)

Przyk

Przyk

ł

ł

ady zastosowa

ady zastosowa

ń

ń

LC

LC

-

-

HPLC TLC

HPLC TLC

-

-

rozdzielanie grupowe i przygotowanie pr

rozdzielanie grupowe i przygotowanie pr

ó

ó

bek do analizy

bek do analizy

-

-

rozdzielanie

rozdzielanie

„

„

szczeg

szczeg

ó

ó

ł

ł

owe

owe

”

”

i oznaczanie sk

i oznaczanie sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w

w

-

-

otrzymywanie substancji

otrzymywanie substancji

-

-

preparatywne / procesowe

preparatywne / procesowe

‹

‹

Biologia, fizjologia, farmakognozja,

Biologia, fizjologia, farmakognozja,

farmakologia; farmacja, produkcja lek

farmakologia; farmacja, produkcja lek

ó

ó

w;

w;

‹

‹

Biochemia, biologia molekularna, genetyka;

Biochemia, biologia molekularna, genetyka;

‹

‹

Kontrola i zanieczyszczenia

Kontrola i zanieczyszczenia

ż

ż

ywno

ywno

ś

ś

ci

ci

‹

‹

Ekologia, monitoring

Ekologia, monitoring

ś

ś

rodowiska naturalnego

rodowiska naturalnego

‹

‹

Kontrola jako

Kontrola jako

ś

ś

ci surowc

ci surowc

ó

ó

w i produkt

w i produkt

ó

ó

w

w

‹

‹

Kontrola procesowa,

Kontrola procesowa,

w tym

w tym

, laboratoryjna

, laboratoryjna

‹

‹

Medycyna, weterynaria, analityka kliniczna

Medycyna, weterynaria, analityka kliniczna

‹

‹

Biotechnolgia

Biotechnolgia

, przemys

, przemys

ł

ł

farmaceutyczny

farmaceutyczny

Przyk

Przyk

ł

ł

ad chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji

ad chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji

produktu naftowego z zastosowaniem detektora

produktu naftowego z zastosowaniem detektora

UV

UV

-

-

VIS/DAD

VIS/DAD

Setki, a nawet
tysiące substancji
w każdej grupie

Widok pasm kilku sk

Widok pasm kilku sk

ł

ł

adnik

adnik

ó

ó

w ekstraktu

w ekstraktu

acetonowego trawy przez szklan

acetonowego trawy przez szklan

ą

ą

ś

ś

cian

cian

ę

ę

kolumny HPLC typu CN, eluent

kolumny HPLC typu CN, eluent

–

–

heksan

heksan

–

–

MTBE

MTBE

-

-

THF; kolejno

THF; kolejno

ść

ść

pasm

pasm

-

-

od do

od do

ł

ł

u:

u:

produkt rozk

produkt rozk

ł

ł

adu chlorofilu, chlorofil A,

adu chlorofilu, chlorofil A,

carotenoidy

carotenoidy

-

-

I

I

, chlorofil B,

, chlorofil B,

carotenoidy

carotenoidy

-

-

II

II

І

І

kierunek

kierunek

Ι

Ι

przep

przep

ł

ł

ywu

ywu

Ι

Ι

eluentu

eluentu

ν

ν

od g

od g

ó

ó

ry

ry

ν

ν

do do

do do

ł

ł

u

u

Warunki rozdzielania

Warunki rozdzielania

–

–

Kolumna 150x3mm,

Kolumna 150x3mm,

Separon

Separon

CN 5 um ,eluent:

CN 5 um ,eluent:

heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), pr

heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), pr

ó

ó

bka 30 uL

bka 30 uL

ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa

ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa

Nat

Nat

ęż

ęż

enie przep

enie przep

ł

ł

ywu eluentu w=0.8 mL/min

ywu eluentu w=0.8 mL/min

Chromatogram

Chromatogram

UV

UV

-

-

DAD

DAD

powsta

powsta

ł

ł

y podczas rozdzielania ekstraktu

y podczas rozdzielania ekstraktu

izolowanego z trawy za pomoc

izolowanego z trawy za pomoc

ą

ą

acetonu. Warunki rozdzielania:

acetonu. Warunki rozdzielania:

Kolumna

Kolumna

Eurospher

Eurospher

CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4

CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4

(v/v/v)

(v/v/v)

Monitoring

Monitoring

ś

ś

rodowiska

rodowiska

–

–

oznaczanie zawarto

oznaczanie zawarto

ś

ś

ci WWA

ci WWA

1

2

3

4

5

6

7

Kolumna Lichrospher RP 18 125mmx4mm 5μm, CH3CN-H2O 75-25

v/v, 1.5 mL/min, UV-DAD 220-400 nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3-

naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.

Metody kalibracji

Metody kalibracji

-

-

Metoda krzywej kalibracyjnej

Metoda krzywej kalibracyjnej

(

(

external

external

standard)

standard)

-

-

Metoda wzorca wewn

Metoda wzorca wewn

ę

ę

trznego

trznego

(

(

internal

internal

standard)

standard)

-

-

Metoda normalizacji

Metoda normalizacji

(

(

Normalization

Normalization

)

)

-

-

-

-

uproszczona

uproszczona

(

(

simplified

simplified

)

)

,

,

-

-

-

-

ze wsp

ze wsp

ó

ó

ł

ł

czynnikami

czynnikami

kalibarcyjnymi

kalibarcyjnymi

(

(

correction

correction

factors

factors

)

)

-

-

Metoda dodatku wzorca

Metoda dodatku wzorca

(standard

(standard

addition

addition

)

)

-

-

co najmniej dwa rozdzielania

co najmniej dwa rozdzielania