„
„
Z czego sk
Z czego sk
ł
ł
ada si
ada si
ę
ę
ziele
ziele
ń
ń
p
p
ó
ó
l i las
l i las
ó
ó
w
w
”
”
Chromatografia cieczowa jako technika
Chromatografia cieczowa jako technika
analityczna i technika otrzymywania substancji
analityczna i technika otrzymywania substancji
--
--
podstawy i g
podstawy i g
ł
ł
ó
ó
wne zasady stosowania
wne zasady stosowania
–
–
Najwa
Najwa
ż
ż
niejsze informacje wprowadzaj
niejsze informacje wprowadzaj
ą
ą
ce
ce
-
-
Chromatografia
Chromatografia
-
-
technika rozdzielania substancji / cz
technika rozdzielania substancji / cz
ą
ą
stek
stek
w
w
uk
uk
ł
ł
adach ciecz
adach ciecz
–
–
cia
cia
ł
ł
o sta
o sta
ł
ł
e, albo ciecz
e, albo ciecz
-
-
ciecz
ciecz
-
-
Znaczenie rozdzielania
Znaczenie rozdzielania
-
-
rozdzieli
rozdzieli
ć
ć
= zidentyfikowa
= zidentyfikowa
ć
ć
, oznaczy
, oznaczy
ć
ć
-
-
Techniki chromatograficzne
Techniki chromatograficzne
-
-
LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)
LC, GC, SFC // kolumnowe, planarne (TLC)
-
-
Mechanizmy fizykochemiczne
Mechanizmy fizykochemiczne
-
-
NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...
NP, RP, IC, AC, HIC, LIHIC, LEC, IEC, ...
Warunek konieczny rozdzielenia
Warunek konieczny rozdzielenia
Konkurencja oddzia
Konkurencja oddzia
ł
ł
ywa
ywa
ń
ń
sorpcyjnych o por
sorpcyjnych o por
ó
ó
wnywalnych energiach, w
wnywalnych energiach, w
uk
uk
ł
ł
adzie: faza stacjonarna
adzie: faza stacjonarna
–
–
faza ruchoma
faza ruchoma
–
–
substancje rozdzielane
substancje rozdzielane
-
-
Zastosowania
Zastosowania
-
-
sk
sk
ł
ł
adniki ro
adniki ro
ś
ś
lin, p
lin, p
ł
ł
yn
yn
ó
ó
w fizjologicznych,
w fizjologicznych,
monitoring
monitoring
ś
ś
rodowiska, kontrola jako
rodowiska, kontrola jako
ś
ś
ci,
ci,
kontrola proces
kontrola proces
ó
ó
w technologicznych,
w technologicznych,
polidyspersyjno
polidyspersyjno
ść
ść
polimer
polimer
ó
ó
w, ... ,
w, ... ,
ale tak
ale tak
ż
ż
e:
e:
rozdzielanie grupowe, przygotowanie pr
rozdzielanie grupowe, przygotowanie pr
ó
ó
bek do analizy,
bek do analizy,
wyznaczanie parametr
wyznaczanie parametr
ó
ó
w fizykochemicznych substancji, ...
w fizykochemicznych substancji, ...
Prof. dr hab. inż. Marian Kamiński
Mi
Mi
chai
chai
ł
ł
Cwiet
Cwiet
(1872
(1872
-
-
1919)
1919)
“
“
Like light rays in the
Like light rays in the
spectrum, the different
spectrum, the different
components of a pigment
components of a pigment
mixture, obeying a law, are
mixture, obeying a law, are
resolved on the calcium
resolved on the calcium
carbonate column and then
carbonate column and then
can be qualitatively and
can be qualitatively and
quantitatively determined. I
quantitatively determined. I
call such a preparation a
call such a preparation a
chromatogram and the
chromatogram and the
corresponding method the
corresponding method the
chromatographic method.
chromatographic method.
”
”
Odkrywca techniki kolumnowej
Odkrywca techniki kolumnowej
„Klasyczna” technika kolumnowa
ELUENT
ELUAT,
substancje rozdzielane
S
t
R
– czas retencji
M
M
R
t
t
t
k
−
=
M
R
M
R
t
t
t
t
k
k
−
−
=
=
1
2
1
2
α
2
54
,
5
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛
=
h
R
w
t
N
k –współczynnik retencji
- współczynnik rozdzielenia
α
N-liczba półek teoretycznych
2
2
2
1
1
4
1
N
k
k
R
S
⋅
+
⋅
−
⋅
=
α
α
Rs -rozdzielczość pików
-zależność „teoretyczna”
t
M
– czas martwy kolumny - retencja
substancji niesorbowanej, wnikającej
do porów wypełnienia kolumny
Informacje „niesione” z chromatogramem i podstawowe
zależności
Rs=(t
Rn+1
– t
Rn
) / ½(S
n+1
+ S
n
)
- zależność „obliczeniowa”
Kilka podstawowych poj
Kilka podstawowych poj
ęć
ęć
Uk
Uk
ł
ł
ad chromatograficzny
ad chromatograficzny
(faza stacjonarna
(faza stacjonarna
–
–
faza ruchoma
faza ruchoma
–
–
okre
okre
ś
ś
lone oddzia
lone oddzia
ł
ł
ywania sorpcyjne / mechanizmy separacji)
ywania sorpcyjne / mechanizmy separacji)
Retencja substancji
Retencja substancji
(spowolnienie elucji
(spowolnienie elucji
-
-
wzgl
wzgl
ę
ę
dem
dem
„
„
u
u
”
”
);
);
Selektywno
Selektywno
ść
ść
rozdzielania
rozdzielania
(stopie
(stopie
ń
ń
zr
zr
ó
ó
ż
ż
nicowania retencji);
nicowania retencji);
Sprawno
Sprawno
ść
ść
rozdzielania
rozdzielania
(miara dyspersji stref substancji);
(miara dyspersji stref substancji);
Pr
Pr
ę
ę
dko
dko
ść
ść
„
„
u
u
”
”
[mm/s],
[mm/s],
nat
nat
ęż
ęż
enie przep
enie przep
ł
ł
ywu eluentu
ywu eluentu
„
„
w
w
”
”
[mL/min]
[mL/min]
Op
Op
ó
ó
r przep
r przep
ł
ł
ywu w kolumnie
ywu w kolumnie
Δ
Δ
P [
P [
MPa
MPa
] = 32
] = 32
u
u
*
*
Lc
Lc
*
*
η
η
/ dp
/ dp
2
2
Kolumna o d
Kolumna o d
ł
ł
ugo
ugo
ś
ś
ci
ci
(
(
Lc
Lc
)
)
,
,
ś
ś
rednicy
rednicy
(dc)
(dc)
, wype
, wype
ł
ł
nienie ziarniste
nienie ziarniste
(
(
dp
dp
, d, A)
, d, A)
/
/
„
„
monolityczne
monolityczne
”
”
(
(
dm
dm
, d, A)
, d, A)
Sorbent
Sorbent
-
-
ziarnisto
ziarnisto
ść
ść
, pory wewn
, pory wewn
ą
ą
trz
trz
-
-
ziarnowe i mi
ziarnowe i mi
ę
ę
dzy
dzy
-
-
ziarnowe, porowato
ziarnowe, porowato
ść
ść
(
(
ε
ε
wz
wz
,
,
ε
ε
mz
mz
,
,
ε
ε
T
T
)
)
, powierzchnia sorpcyjna
, powierzchnia sorpcyjna
(A
(A
-
-
nawet do 750 m
nawet do 750 m
2
2
/g)
/g)
Detekcja i detektory
Detekcja i detektory
(st
(st
ęż
ęż
eniowe , masowe);
eniowe , masowe);
Czu
Czu
ł
ł
o
o
ść
ść
i liniowo
i liniowo
ść
ść
detekcji;
detekcji;
Zasady post
Zasady post
ę
ę
powania analitycznego
powania analitycznego
(metoda krzywej kalibracyjnej
(metoda krzywej kalibracyjnej
–
–
w tym
w tym
-
-
punkt
punkt
ó
ó
w ograniczaj
w ograniczaj
ą
ą
cych, wzorca wewn
cych, wzorca wewn
ę
ę
trznego, dodatku wzorca,
trznego, dodatku wzorca,
normalizacji)
normalizacji)
Mechanizmy separacji
Mechanizmy separacji
Warunki RP
Warunki RP
–
–
hydrofobowo
hydrofobowo
ść
ść
Warunki NP
Warunki NP
–
–
polarno
polarno
ść
ść
, polaryzacja,
, polaryzacja,
dyspersja, wi
dyspersja, wi
ą
ą
zania wodorowe
zania wodorowe
;
;
Warunki IC
Warunki IC
–
–
wymiana jon
wymiana jon
ó
ó
w
w
Warunki wykluczania (chromatografii
Warunki wykluczania (chromatografii
ż
ż
elowej)
elowej)
–
–
zr
zr
ó
ó
ż
ż
nicowanie dr
nicowanie dr
ó
ó
g i
g i
czasu dyfuzji sk
czasu dyfuzji sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w pr
w pr
ó
ó
bki
bki
Inne:
Inne:
HIC,LILHIC,NP
HIC,LILHIC,NP
-
-
w,LEC,AC,EC
w,LEC,AC,EC
,...
,...
Kolumna do chromatografii
Kolumna do chromatografii
cieczowej
cieczowej
-
-
Rurka o bardzo g
Rurka o bardzo g
ł
ł
adkiej
adkiej
ś
ś
ciance, o
ciance, o
ś
ś
rednicy (
rednicy (
dc)
dc)
, wype
, wype
ł
ł
niona
niona
sorbentem o przeci
sorbentem o przeci
ę
ę
tnej (
tnej (
ś
ś
redniej) wielko
redniej) wielko
ś
ś
ci ziaren
ci ziaren
(
(
dp
dp
)
)
i d
i d
ł
ł
ugo
ugo
ś
ś
ci
ci
warstwy wype
warstwy wype
ł
ł
nienia
nienia
(
(
Lc
Lc
)
)
–
–
kolumny
kolumny
„
„
klasyczne
klasyczne
”
”
,
,
mikropakowane
mikropakowane
, kapilarne
, kapilarne
„
„
otwarte
otwarte
”
”
, preparatywne, procesowe
, preparatywne, procesowe
;
;
-
-
Wype
Wype
ł
ł
nienie powinno by
nienie powinno by
ć
ć
u
u
ł
ł
o
o
ż
ż
one r
one r
ó
ó
wnomiernie w przekroju
wnomiernie w przekroju
poprzecznym, zapewniaj
poprzecznym, zapewniaj
ą
ą
c
c
„
„
t
t
ł
ł
okowy
okowy
”
”
profil przep
profil przep
ł
ł
ywu;
ywu;
(u
(u
≠
≠
f (dc))
f (dc))
-
-
Wype
Wype
ł
ł
nienie u
nienie u
ł
ł
o
o
ż
ż
one w spos
one w spos
ó
ó
b stabilny, zapewniaj
b stabilny, zapewniaj
ą
ą
cy brak
cy brak
„
„
osiadania
osiadania
”
”
z
z
ł
ł
o
o
ż
ż
a; W celu stabilizacji wype
a; W celu stabilizacji wype
ł
ł
nienia kolumny
nienia kolumny
preparatywnej stosowane s
preparatywnej stosowane s
ą
ą
takie
takie
„
„
zabiegi
zabiegi
”
”
, jak dynamiczna
, jak dynamiczna
kompresja osiowa z
kompresja osiowa z
ł
ł
o
o
ż
ż
a (DAC), albo/i kompresja radialna
a (DAC), albo/i kompresja radialna
(promieniowa) wype
(promieniowa) wype
ł
ł
nienia.
nienia.
Wype
Wype
ł
ł
nienie ziarniste kolumny HPLC
nienie ziarniste kolumny HPLC
Wype
Wype
ł
ł
nienie monolityczne
nienie monolityczne
DYSPERSJA MASY w KOLUMNIE
Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji
Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny – wzrasta H i spada N
Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H),
tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych – tym wyższa sprawność
rozdzielania - także - kolumny
Dyspersja stref
Dyspersja stref
zjawisko niekorzystne,
zjawisko niekorzystne,
jednak, nieuniknione
jednak, nieuniknione
Zjawiska powoduj
Zjawiska powoduj
ą
ą
ce dyspersj
ce dyspersj
ę
ę
-
-
Dyfuzja
Dyfuzja
„
„
wirowa
wirowa
”
”
(A);
(A);
-
-
Dyfuzja molekularna (B);
Dyfuzja molekularna (B);
-
-
Opory przenoszenia masy (C)
Opory przenoszenia masy (C)
1.
1.
w fazie ruchomej (Cm),
w fazie ruchomej (Cm),
2.
2.
w fazie stacjonarnej (Cs)
w fazie stacjonarnej (Cs)
R
R
ó
ó
wnanie
wnanie
Van
Van
Deemter
Deemter
’
’
a
a
,
,
H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u
H = B/u + A + Cu = B/u + A + (Cm + Cs) u
albo bardziej adekwatne dla
albo bardziej adekwatne dla
LC
LC
–
–
r
r
ó
ó
wnania
wnania
:
:
Knox
Knox
’
’
a
a
, lub
, lub
Giddings
Giddings
’
’
a
a
C
B
A
H
+
=
min
BC
A
H
+
=
min
C
B
u
opt
=
Zale
Zale
ż
ż
no
no
ś
ś
ci najprostsze, aktualne dla CGC
ci najprostsze, aktualne dla CGC
–
–
w przypadku
w przypadku
HPLC, tylko w przybli
HPLC, tylko w przybli
ż
ż
eniu i co do zasady
eniu i co do zasady
Instrumentalizacja chromatografii
Instrumentalizacja chromatografii
–
–
aparatura chromatograficzna
aparatura chromatograficzna
-
-
Nale
Nale
ż
ż
y zapewni
y zapewni
ć
ć
:
:
-
-
Sta
Sta
ł
ł
e
e
(w, u =
(w, u =
const
const
)
)
,
,
albo zmienne w funkcji czasu,
albo zmienne w funkcji czasu,
zaprogramowane nat
zaprogramowane nat
ęż
ęż
enie przep
enie przep
ł
ł
ywu eluentu
ywu eluentu
(u, w =
(u, w =
f(t
f(t
))
))
, o zaprogramowanej
, o zaprogramowanej
–
–
sta
sta
ł
ł
ej
ej
(elucja
(elucja
izokratyczna)
izokratyczna)
,
,
albo zmiennej w funkcji czasu
albo zmiennej w funkcji czasu
-
-
zawarto
zawarto
ś
ś
ci poszczeg
ci poszczeg
ó
ó
lnych sk
lnych sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w
w
eluentu
eluentu
(elucja gradientowa)
(elucja gradientowa)
oraz
oraz
-
-
sta
sta
łą
łą
(
(
T=const
T=const
, warunki izotermiczne)
, warunki izotermiczne)
,
,
albo zmienn
albo zmienn
ą
ą
,
,
zaprogramowan
zaprogramowan
ą
ą
w funkcji czasu
w funkcji czasu
(
(
T=f(t
T=f(t
), warunki
), warunki
„
„
gradientu temperatury
gradientu temperatury
”
”
)
)
–
–
temperatur
temperatur
ę
ę
separacji.
separacji.
Instrumentalizacja chromatografii
Instrumentalizacja chromatografii
–
–
aparatura chromatograficzna
aparatura chromatograficzna
-
-
Nale
Nale
ż
ż
y tak
y tak
ż
ż
e:
e:
-
-
Zapewni
Zapewni
ć
ć
czu
czu
łą
łą
, wystarczaj
, wystarczaj
ą
ą
co
co
uniwersaln
uniwersaln
ą
ą
, albo wysoce specyficzn
, albo wysoce specyficzn
ą
ą
( oraz,
( oraz,
o ile to mo
o ile to mo
ż
ż
liwe)
liwe)
liniow
liniow
ą
ą
w szerokim zakresie
w szerokim zakresie
st
st
ęż
ęż
e
e
ń
ń
detekcj
detekcj
ę
ę
obecno
obecno
ś
ś
ci i zawarto
ci i zawarto
ś
ś
ci
ci
rozdzielanych substancji w eluacie
rozdzielanych substancji w eluacie
wyp
wyp
ł
ł
ywaj
ywaj
ą
ą
cym z kolumny,
cym z kolumny,
-
-
Celowe jest,
Celowe jest,
dodatkowo
dodatkowo
, stosowanie systemu
, stosowanie systemu
prze
prze
łą
łą
czania kolumn i zapewnienie
czania kolumn i zapewnienie
mo
mo
ż
ż
liwo
liwo
ś
ś
ci stosowania przep
ci stosowania przep
ł
ł
ywu
ywu
zwrotnego w kolumnie chromatograficznej
zwrotnego w kolumnie chromatograficznej
SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO – etap kondycjonowania kolumny
SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO - etap rozdzielania substancji
Schemat aparatu pompowego PG
Schemat aparatu pompowego PG
D
Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu
Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu
HPLC do zastosowa
HPLC do zastosowa
ń
ń
w dydaktyce
w dydaktyce
–
–
elucja izokratyczna
elucja izokratyczna
Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu
Schemat ideowy opracowanego w PG taniego aparatu
HPLC do zastosowa
HPLC do zastosowa
ń
ń
w dydaktyce
w dydaktyce
–
–
elucja gradientowa
elucja gradientowa
SYSTEM PRZE
SYSTEM PRZE
ŁĄ
ŁĄ
CZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEP
CZANIA KOLUMN I STOSOWANIA PRZEP
Ł
Ł
YWU ZWROTNEGO
YWU ZWROTNEGO
Thin Layer: 1889
Thin Layer: 1889
Chromatografia planarna
Chromatografia planarna
–
–
cienkowarstwowa (TLC), bibu
cienkowarstwowa (TLC), bibu
ł
ł
owa (PC)
owa (PC)
FAZA RUCHOMA
FAZA RUCHOMA
a
b
c
d
d
a
Rf
=
1
d
b
Rf
=
2
d
c
Rf
=
3
k= ( 1/Rf ) - 1
Detekcja
Detekcja
–
–
Detektory w HPLC /
Detektory w HPLC /
TLC
TLC
Detektor chromatograficzny
Detektor chromatograficzny
–
–
przep
przep
ł
ł
ywowy instrument
ywowy instrument
analityczny o znikomej obj
analityczny o znikomej obj
ę
ę
to
to
ś
ś
ci naczy
ci naczy
ń
ń
ka pomiarowego;
ka pomiarowego;
Nie istnieje dotychczas w pe
Nie istnieje dotychczas w pe
ł
ł
ni uniwersalny detektor w LC,
ni uniwersalny detektor w LC,
st
st
ą
ą
d stosuje si
d stosuje si
ę
ę
wiele r
wiele r
ó
ó
ż
ż
nych;
nych;
Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowo
Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowo
ś
ś
ci
ci
odpowiedzi detektora we wsp
odpowiedzi detektora we wsp
ó
ó
ł
ł
czesnej HPLC;
czesnej HPLC;
UV (200
UV (200
-
-
400nm)/ UV
400nm)/ UV
-
-
VIS (200
VIS (200
-
-
800 nm) i szczeg
800 nm) i szczeg
ó
ó
lne
lne
znaczenie detektora typu DAD (
znaczenie detektora typu DAD (
diode
diode
array
array
detector
detector
)
)
RID (
RID (
refractive
refractive
index
index
detector
detector
)
)
LLSD (laser
LLSD (laser
light
light
scattering
scattering
detector
detector
)
)
FLD (
FLD (
fluorescence
fluorescence
detector
detector
)
)
El
El
-
-
D (
D (
electrochemical
electrochemical
detector
detector
, typ
, typ
amperometryczny
amperometryczny
)
)
CD (
CD (
coductometric
coductometric
detector
detector
-
-
supresja
supresja
jon
jon
ó
ó
w eluentu)
w eluentu)
LC
LC
-
-
MS,
MS,
LC
LC
-
-
MS
MS
-
-
MS
MS
(mas
(mas
-
-
spectrometry
spectrometry
)
)
inne (FTIR, NMR, LC
inne (FTIR, NMR, LC
-
-
FID, Radiometryczny, Polarymetryczny,
FID, Radiometryczny, Polarymetryczny,
Pomiaru momentu dipolowego, ....)
Pomiaru momentu dipolowego, ....)
Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika
Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika
derywatyzacji post
derywatyzacji post
-
-
kolumnowej w przypadku HPLC
kolumnowej w przypadku HPLC
Nowoczesna detekcja i detektory
Nowoczesna detekcja i detektory
-
-
UV
UV
-
-
DAD
DAD
, LC
, LC
-
-
MS, GC
MS, GC
-
-
MS
MS
-
-
Poj
Poj
ę
ę
cie absorpcji
cie absorpcji
ś
ś
wiat
wiat
ł
ł
a, prawo absorpcji
a, prawo absorpcji
ś
ś
wiat
wiat
ł
ł
a:
a:
[
[
-
-
lg(I
lg(I
/
/
I
I
o
o
)]=
)]=
lg(I
lg(I
o
o
/
/
I)=
I)=
ABS=k
ABS=k
*
*
c
c
*
*
l
l
Widmo, jakie informacje niesie widmo ?
Widmo, jakie informacje niesie widmo ?
Chromatogram detektora
Chromatogram detektora
UV
UV
-
-
DAD
DAD
-
-
kilkadziesi
kilkadziesi
ą
ą
t
t
chromatogram
chromatogram
ó
ó
w jednocze
w jednocze
ś
ś
nie
nie
Najwygodniejsze
Najwygodniejsze
-
-
odwzorowanie poziomicowe
odwzorowanie poziomicowe
Wnikliwa analiza przebiegu widma umo
Wnikliwa analiza przebiegu widma umo
ż
ż
liwia
liwia
identyfikacj
identyfikacj
ę
ę
substancji o charakterystycznym
substancji o charakterystycznym
przebiegu widma
przebiegu widma
-
-
jednocze
jednocze
ś
ś
nie
nie
-
-
na podstawie
na podstawie
retencji i cech widma
retencji i cech widma
Problem
Problem
–
–
widmo
widmo
„
„
w
w
ł
ł
asne
asne
”
”
sk
sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w eluentu
w eluentu
Chromatogram
Chromatogram
Wykres zale
Wykres zale
ż
ż
no
no
ś
ś
ci st
ci st
ęż
ęż
enia substancji w eluacie wyp
enia substancji w eluacie wyp
ł
ł
ywaj
ywaj
ą
ą
cym z kolumny
cym z kolumny
w funkcji
w funkcji
obj
obj
ę
ę
to
to
ś
ś
ci elucji, a gdy nat
ci elucji, a gdy nat
ęż
ęż
enie przep
enie przep
ł
ł
ywu eluentu
ywu eluentu
jest sta
jest sta
ł
ł
e
e
(w, u =
(w, u =
const
const
)
)
–
–
w funkcji czasu
w funkcji czasu
Opis ka
Opis ka
ż
ż
dego chromatogramu powinien zawiera
dego chromatogramu powinien zawiera
ć
ć
:
:
-
-
cel badania, dane o pr
cel badania, dane o pr
ó
ó
bce, kolumnie, warunkach elucji
bce, kolumnie, warunkach elucji
(sk
(sk
ł
ł
adniki i sk
adniki i sk
ł
ł
ad eluentu , albo sk
ad eluentu , albo sk
ł
ł
adniki eluentu i program elucji),
adniki eluentu i program elucji),
-
-
zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program d
zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program d
ł
ł
ugo
ugo
ś
ś
ci fali,
ci fali,
-
-
nazwy substancji odpowiadaj
nazwy substancji odpowiadaj
ą
ą
cych pikom chromatograficznym
cych pikom chromatograficznym
Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLC
Zasady opisu chromatogramu HPLC / TLC
-
Co to jest i co szczeg
Co to jest i co szczeg
ó
ó
lnego przedstawia ?
lnego przedstawia ?
(np.
(np.
„
„
Chromatogram rozdzielania sk
Chromatogram rozdzielania sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w
w
metanolowego ekstraktu ro
metanolowego ekstraktu ro
ś
ś
liny z gatunku
liny z gatunku
Dionea,
Dionea,
otrzymany w warunkach uk
otrzymany w warunkach uk
ł
ł
adu faz
adu faz
odwr
odwr
ó
ó
conych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego prog
conych oraz elucji gradientowej z zastosowaniem optymalnego prog
ramu elucji
ramu elucji
”
”
,
,
chromatograf MERCK
chromatograf MERCK
-
-
HITACHI,
HITACHI,
LaChrom
LaChrom
);
);
-
Pr
Pr
ó
ó
bka, warunki rozdzielania, warunki detekcji
bka, warunki rozdzielania, warunki detekcji
-
-
Pr
Pr
ó
ó
bka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu li
bka: .... (np.: ekstrakt metanolowy z suszu li
ś
ś
ci ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztw
ci ..., 1g suszu/10 ml MeOH, albo roztw
ó
ó
r
r
mieszaniny wzorc
mieszaniny wzorc
ó
ó
w w MeOH o st
w w MeOH o st
ęż
ęż
eniu ka
eniu ka
ż
ż
dego sk
dego sk
ł
ł
adnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.;
adnika ok. 0.5 mg/ml) itd., itp.;
-
-
Kolumna i wype
Kolumna i wype
ł
ł
nienie kolumny (np.
nienie kolumny (np.
„
„
Lichrocart 125 x 4 mm
Lichrocart 125 x 4 mm
i.d., Lichrospher RP 18e 5 um
i.d., Lichrospher RP 18e 5 um
)
)
;
;
-
-
Eluent / program elucji (np. eluent: MeOH
Eluent / program elucji (np. eluent: MeOH
-
-
H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A:
H2O 80:20 v/v, albo: elucja gradientowa, eluent A:
woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B:
woda dejonizowana + 0.75% v/v TFA, eluent B:
MeOH
MeOH
-
-
AcCN
AcCN
-
-
THF
THF
45/
45/
45
45
/10 v/v+0.75% TFA,
/10 v/v+0.75% TFA,
program elucji: 0 do 5 min
program elucji: 0 do 5 min
-
-
5% B, 5 do 25 min
5% B, 5 do 25 min
–
–
5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min
5 do 95% B, liniowo, 25 do 33 min
–
–
95% B;
95% B;
-
-
Przep
Przep
ł
ł
yw i ewentualnie ci
yw i ewentualnie ci
ś
ś
nienie (np. 1.5 ml/min, (9.5
nienie (np. 1.5 ml/min, (9.5
-
-
17
17
MPa
MPa
));
));
-
-
Detektor i warunki detekcji (np. detektor UV
Detektor i warunki detekcji (np. detektor UV
-
-
VIS typ DAD, L
VIS typ DAD, L
-
-
7450A MERCK, albo detektor
7450A MERCK, albo detektor
UV
UV
-
-
254 nm z kuwet
254 nm z kuwet
ą
ą
o czu
o czu
ł
ł
o
o
ś
ś
ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10
ci 0.01 Jedn. Absorb. dla skali 10
mV
mV
) itp., itd.
) itp., itd.
Piki chromatograficzne
Piki chromatograficzne:
(powinna by
(powinna by
ć
ć
informacja o ka
informacja o ka
ż
ż
dym piku, np. 1
dym piku, np. 1
–
–
beta karoten, 2 1OH
beta karoten, 2 1OH
-
-
naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5,
naftalen 3 chlorofil A, 4 karotenoid o nieznanej strukturze, 5,
7
7
-
-
9. substancje nieznane, 6. 1
9. substancje nieznane, 6. 1
-
-
CH3
CH3
Naftalen, itp., itd. ...)
Naftalen, itp., itd. ...)
Warunki szczeg
Warunki szczeg
ó
ó
lne i informacje dodatkowe
lne i informacje dodatkowe
(je
(je
ś
ś
li dotyczy ...).
li dotyczy ...).
W ten spos
W ten spos
ó
ó
b powinien by
b powinien by
ć
ć
opisany ka
opisany ka
ż
ż
dy
dy
chromatogram
chromatogram
za
za
łą
łą
czony do sprawozdania
czony do sprawozdania
laborato
laborato
-
-
ryjnego
ryjnego
, w pracy naukowej, albo raporcie z bada
, w pracy naukowej, albo raporcie z bada
ń
ń
. Ka
. Ka
ż
ż
dy wydruk raportu powinien mie
dy wydruk raportu powinien mie
ć
ć
opis
opis
danych, kt
danych, kt
ó
ó
re zawiera, mo
re zawiera, mo
ż
ż
e to by
e to by
ć
ć
w cz
w cz
ęś
ęś
ci zrealizowane w formie zastosowania symboli i
ci zrealizowane w formie zastosowania symboli i
wyja
wyja
ś
ś
nienia znaczenia symboli. Ka
nienia znaczenia symboli. Ka
ż
ż
dy raport powinien zawiera
dy raport powinien zawiera
ć
ć
te
te
ż
ż
informacj
informacj
ę
ę
o wykonawcy
o wykonawcy
badania oraz dat
badania oraz dat
ę
ę
i czas wykonania badania.
i czas wykonania badania.
Widmo
-piren –
Funkcja
analizy
jakościowej
Chromatogram – program dł. Fali
Funkcja analizy ilościowej
Chromatogram detektora UV-DAD
– odwzorowanie poziomicowe
ABS=f(t,
λ)
ABS-f(t)
ABS=f(λ)
Przyk
Przyk
ł
ł
ady zastosowa
ady zastosowa
ń
ń
LC
LC
-
-
HPLC TLC
HPLC TLC
-
-
rozdzielanie grupowe i przygotowanie pr
rozdzielanie grupowe i przygotowanie pr
ó
ó
bek do analizy
bek do analizy
-
-
rozdzielanie
rozdzielanie
„
„
szczeg
szczeg
ó
ó
ł
ł
owe
owe
”
”
i oznaczanie sk
i oznaczanie sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w
w
-
-
otrzymywanie substancji
otrzymywanie substancji
-
-
preparatywne / procesowe
preparatywne / procesowe
Biologia, fizjologia, farmakognozja,
Biologia, fizjologia, farmakognozja,
farmakologia; farmacja, produkcja lek
farmakologia; farmacja, produkcja lek
ó
ó
w;
w;
Biochemia, biologia molekularna, genetyka;
Biochemia, biologia molekularna, genetyka;
Kontrola i zanieczyszczenia
Kontrola i zanieczyszczenia
ż
ż
ywno
ywno
ś
ś
ci
ci
Ekologia, monitoring
Ekologia, monitoring
ś
ś
rodowiska naturalnego
rodowiska naturalnego
Kontrola jako
Kontrola jako
ś
ś
ci surowc
ci surowc
ó
ó
w i produkt
w i produkt
ó
ó
w
w
Kontrola procesowa,
Kontrola procesowa,
w tym
w tym
, laboratoryjna
, laboratoryjna
Medycyna, weterynaria, analityka kliniczna
Medycyna, weterynaria, analityka kliniczna
Biotechnolgia
Biotechnolgia
, przemys
, przemys
ł
ł
farmaceutyczny
farmaceutyczny
Przyk
Przyk
ł
ł
ad chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji
ad chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji
produktu naftowego z zastosowaniem detektora
produktu naftowego z zastosowaniem detektora
UV
UV
-
-
VIS/DAD
VIS/DAD
Setki, a nawet
tysiące substancji
w każdej grupie
Widok pasm kilku sk
Widok pasm kilku sk
ł
ł
adnik
adnik
ó
ó
w ekstraktu
w ekstraktu
acetonowego trawy przez szklan
acetonowego trawy przez szklan
ą
ą
ś
ś
cian
cian
ę
ę
kolumny HPLC typu CN, eluent
kolumny HPLC typu CN, eluent
–
–
heksan
heksan
–
–
MTBE
MTBE
-
-
THF; kolejno
THF; kolejno
ść
ść
pasm
pasm
-
-
od do
od do
ł
ł
u:
u:
produkt rozk
produkt rozk
ł
ł
adu chlorofilu, chlorofil A,
adu chlorofilu, chlorofil A,
carotenoidy
carotenoidy
-
-
I
I
, chlorofil B,
, chlorofil B,
carotenoidy
carotenoidy
-
-
II
II
І
І
kierunek
kierunek
Ι
Ι
przep
przep
ł
ł
ywu
ywu
Ι
Ι
eluentu
eluentu
ν
ν
od g
od g
ó
ó
ry
ry
ν
ν
do do
do do
ł
ł
u
u
Warunki rozdzielania
Warunki rozdzielania
–
–
Kolumna 150x3mm,
Kolumna 150x3mm,
Separon
Separon
CN 5 um ,eluent:
CN 5 um ,eluent:
heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), pr
heksan:MTBE:THF=55:8:6,4 (v/v/v), pr
ó
ó
bka 30 uL
bka 30 uL
ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa
ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa
Nat
Nat
ęż
ęż
enie przep
enie przep
ł
ł
ywu eluentu w=0.8 mL/min
ywu eluentu w=0.8 mL/min
Chromatogram
Chromatogram
UV
UV
-
-
DAD
DAD
powsta
powsta
ł
ł
y podczas rozdzielania ekstraktu
y podczas rozdzielania ekstraktu
izolowanego z trawy za pomoc
izolowanego z trawy za pomoc
ą
ą
acetonu. Warunki rozdzielania:
acetonu. Warunki rozdzielania:
Kolumna
Kolumna
Eurospher
Eurospher
CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4
CN, 7um; eluent heksan:MTBE:THF=55:8:6,4
(v/v/v)
(v/v/v)
Monitoring
Monitoring
ś
ś
rodowiska
rodowiska
–
–
oznaczanie zawarto
oznaczanie zawarto
ś
ś
ci WWA
ci WWA
1
2
3
4
5
6
7
Kolumna Lichrospher RP 18 125mmx4mm 5μm, CH3CN-H2O 75-25
v/v, 1.5 mL/min, UV-DAD 220-400 nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3-
naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.
Metody kalibracji
Metody kalibracji
-
-
Metoda krzywej kalibracyjnej
Metoda krzywej kalibracyjnej
(
(
external
external
standard)
standard)
-
-
Metoda wzorca wewn
Metoda wzorca wewn
ę
ę
trznego
trznego
(
(
internal
internal
standard)
standard)
-
-
Metoda normalizacji
Metoda normalizacji
(
(
Normalization
Normalization
)
)
-
-
-
-
uproszczona
uproszczona
(
(
simplified
simplified
)
)
,
,
-
-
-
-
ze wsp
ze wsp
ó
ó
ł
ł
czynnikami
czynnikami
kalibarcyjnymi
kalibarcyjnymi
(
(
correction
correction
factors
factors
)
)
-
-
Metoda dodatku wzorca
Metoda dodatku wzorca
(standard
(standard
addition
addition
)
)
-
-
co najmniej dwa rozdzielania
co najmniej dwa rozdzielania
Document Outline
