Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 3

Temat: PEROKSYDACJA LIPIDÓW.

Część I

Odczynniki:

1.

kwas linolowy:

kwas linolowy- 0,774 g + 0,5 ml Tween 20, uzupełnić w kolbce miarowej do objętości 25 ml buforem
fosforanowym 0,05 mol/ dm

3

o pH 6,8

2. bufor fosforanowy 0,05 mol/ dm

3

, pH 6,8 i 7,0

3. kwas askorbinowy 0,0276 mol/ dm

3

4. siarczan miedzi (II) 0,0276 mol/ dm

3

5. BHA 2,76% w etanolu
6. EDTA 0,0276 mol/ dm

3

7. EDTA 5%
8. HCl 1%
9. etanol 95%
10. kwas tiobarbiturowy (TBA) 0,3% w 95% etanolu
11. etanol 62%

Wykonanie:
Przygotować następujące roztwory:

roztwór L: rozcieńczony kwas linolowy

2,5 ml kwasu linolowego (1)

+ 25,1 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm

3

pH 7,0

roztwór LAC: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy+ siarczan miedzi

2,5 ml kwasu linolowego (1)

+ 0,1 ml kwasu askorbinowego

+ 0,1 ml siarczanu miedzi

+ 24,9 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm

3

pH 7,0

roztwór LACE: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy + siarczan miedzi + EDTA

2,5 ml kwasu linolowego (1)

+ 0,1 ml kwasu askorbinowego

+ 0,1 ml siarczanu miedzi

+ 0,1 ml EDTA

+ 24,8 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm

3

pH 7,0

roztwór LACB: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy + siarczan miedzi + BHA

2,5 ml kwasu linolowego (1)

+ 0,1 ml kwasu askorbinowego

+ 0,1 ml siarczanu miedzi

+ 0,1 ml BHA

+ 24,8 buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm

3

pH 7,0

roztwór LC: rozcieńczony kwas linolowy + siarczan miedzi

2,5 ml kwasu linolowego (1)

+ 0,1 ml siarczanu miedzi

+ 25 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm

3

pH 7,0

Wszystkie roztwory inkubować w ciemności, w temperaturze 25

o

C przez 20 h. Po tym czasie

przenieść po 1 ml każdego roztworu do probówek. Dodać 0,3 ml 5% EDTA + 0,2 ml 1% HCl + 0,5
ml 95% etanolu + 2 ml 0,3% TBA, wymieszać. Zamknięte probówki umieścić w łaźni wodnej –
60

o

C i inkubować przez 1 h. Zawartość probówek dopełnić do objętości 10 ml 62% etanolem,

przesączyć i czytać absorbancję przy długości fali 532 nm względem wody. Porównać wartości
absorbancji dla poszczególnych roztworów, wyciągnąć wnioski.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

Część II

Odczynniki:

1. mieszanina TBA- TCA: 0,375% TBA i 15% TCA rozpuszczone w 0,25 N HCl.
2. 2 % roztwór BHT
3. 30 μmol/ dm

3

roztwór TEP (1,1,3,3- tetraetoksypropan)

Materiał:
surowe, mielone mięso z indyka

Wykonanie:

Zważyć do dwóch krótkich probówek po 1 g mięsa surowego. Do jednej naważki dodać od

razu 20 μl 2% BHT i odstawić do lodówki. Drugą probówkę wstawić do wrzącej wody, zamknąć
korkiem i gotować przez 30 minut. Po ostudzeniu dodać 20 μl 2% BHT. Do obu próbek- mięso
surowe i gotowane-wprowadzić 5 ml mieszaniny TBA-TCA. Probówki wstawić do wrzącej łaźni
wodnej i gotować przez 20 minut. Po ostudzeniu, zawartość probówek odwirować (4 tys. obrotów/
minutę przez 20 minut). Przeczytać absorbancję supernatantów przy długości fali 532 nm,
względem ślepej próby odczynnikowej.

Obliczyć stężenie TBARS (substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym) w oparciu o

odczyt absorbancji wzorca MDA (dialdehyd malonowy) o stężeniu 2,5 μmol/ dm

3

i wyrazić w

μmolach MDA/ g mięsa. W obliczeniach uwzględnić zawartość wody w mięsie.

PRZYGOTOWANIE PRÓBY ŚLEPEJ I WZORCA

a) ślepa próba odczynnikowa: do probówki wprowadzić 1 ml wody destylowanej i 5 ml

mieszaniny TBA i TCA

b) wzorzec MDA o stężeniu 2,5 μmol/ dm

3

: do probówki wprowadzić 0,5 ml wody

destylowanej, 0,5 ml 30 μmol/ dm

3

roztworu TEP i 5 ml mieszaniny TBA i TCA.

Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez 20 minut. Ostudzić. Bardzo

dokładnie wymieszać próbkę wzorcową przed czytaniem absorbancji (532 nm względem próby
ślepej).




















Załączniki:

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

O

OH

O

OH

.

O

OH

.

O

OH

O

O

O

OH

O

OH

O

OH

O

OH

O

peroksydacja nienasyconych kwasów tłuszczowych

.

OH

H

2

O

O

2

1

O

2

+

.

OH

O

OH

O

OH

O

OH

O

O

Fe

3+

Fe

2+

+ H

+

LH

L

.

O

2

LOO

.

L

.

O

2

LOO

.

LOOH

LH

itd.

cykliczny nadtlenek

cykliczny endonadtlenek

MDA i inne produkty

C

CH

2

C

O

H

O

H

C

H

3

CH

3

CH

CH C

O

H

CH

CH

2

C

H

3

OH

4

CH

CH

C

O

H

CH

CH

CH

2

C

H

3

2

CH

CH

2

C

H

3

OH

CH

2

C

O

H

3

C

H

3

CH

2

CH

3

3

inicjacja

propagacja

LH

L

.

LOO

.

reinicjacja

dialdehyd malonowy (MDA)

4- hydroksy-2,3-trans-nonenal

hepta-2,4-dienal

hydroksyoktanal

etan

pentan

terminacja

L

.

+ L

.

L-L

LOO

.

+ LOO

.

L=O + LOH + O

2

LOO

.

+ L

.

L=O + LOH

LH- nienasycony kwas tłuszczowy
L

.

- rodnik alkilowy

LOO

.

- rodnik nadtlenkowy

LO

.

- rodnik alkoksylowy

LOOH- wodoronadlenek kwasu tłuszczowego

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 3

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

4

N

N

S

H

OH

OH

N

N

N

N

S

SH

OH

O

H

OH

O

H

C

CH

2

C

O

H

O

H

2

+

reakcja dialdehydu malonowego z kwasem tiobarbiturowym

TBA MDA czerwono-różowy produkt

CH CH

2

C

H

O

O

O

O

CH

2

CH

3

CH

2

CH

3

CH

2

C

H

3

CH

2

C

H

3

C

CH

2

C

O

H

O

H

+

O

H

2

2

C

H

3

CH

2

OH

4

+

przekształcenie 1,1,3,3-tetraetoksypropanu do dialdehydu malonowego

OH

O CH

3

CH

3

CH

3

CH

3

OH

CH

3

CH

3

CH

3

C

H

3

CH

3

CH

3

CH

3

BHA BHT

syntetyczne antyoksydanty fenolowe

reakcja zmiatania wolnych rodników przez związek fenolowy

OH

O

O

O

O

L

.

LH

.

.

.

reakcja reinicjacji

LOOH + Cu

2+

→ Cu

+

+ H

+

+ LOO

•

Ask-H

2

+ Fe

3+

→ Ask-H

•

+ Fe

2+

+ H

+

LOO

•

+ LH → LOOH + L

•

Fe

2+

+ O

2

↔ Fe(V)-O

2

↔ Fe

3+

+ O

2

•-

LOOH + Fe

3+

→ Fe

2+

+ H

+

+ LOO

•

Cu

2+

→ Cu

+

(pod wpływem reduktora)

LOOH + Fe

2+

→ Fe

3+

+ OH

-

+ LO

•

LOOH + Cu

+

→ Cu

2+

+ OH

-

+ LO

•

LO

•

+ LH → LOH + L

•