Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 3
Temat: PEROKSYDACJA LIPIDÓW.
Część I
Odczynniki:
1.
kwas linolowy:
kwas linolowy- 0,774 g + 0,5 ml Tween 20, uzupełnić w kolbce miarowej do objętości 25 ml buforem
fosforanowym 0,05 mol/ dm
3
o pH 6,8
2. bufor fosforanowy 0,05 mol/ dm
3
, pH 6,8 i 7,0
3. kwas askorbinowy 0,0276 mol/ dm
3
4. siarczan miedzi (II) 0,0276 mol/ dm
3
5. BHA 2,76% w etanolu
6. EDTA 0,0276 mol/ dm
3
7. EDTA 5%
8. HCl 1%
9. etanol 95%
10. kwas tiobarbiturowy (TBA) 0,3% w 95% etanolu
11. etanol 62%
Wykonanie:
Przygotować następujące roztwory:
roztwór L: rozcieńczony kwas linolowy
2,5 ml kwasu linolowego (1)
+ 25,1 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm
3
pH 7,0
roztwór LAC: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy+ siarczan miedzi
2,5 ml kwasu linolowego (1)
+ 0,1 ml kwasu askorbinowego
+ 0,1 ml siarczanu miedzi
+ 24,9 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm
3
pH 7,0
roztwór LACE: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy + siarczan miedzi + EDTA
2,5 ml kwasu linolowego (1)
+ 0,1 ml kwasu askorbinowego
+ 0,1 ml siarczanu miedzi
+ 0,1 ml EDTA
+ 24,8 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm
3
pH 7,0
roztwór LACB: rozcieńczony kwas linolowy + kwas askorbinowy + siarczan miedzi + BHA
2,5 ml kwasu linolowego (1)
+ 0,1 ml kwasu askorbinowego
+ 0,1 ml siarczanu miedzi
+ 0,1 ml BHA
+ 24,8 buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm
3
pH 7,0
roztwór LC: rozcieńczony kwas linolowy + siarczan miedzi
2,5 ml kwasu linolowego (1)
+ 0,1 ml siarczanu miedzi
+ 25 ml buforu fosforanowego 0,05 mol/ dm
3
pH 7,0
Wszystkie roztwory inkubować w ciemności, w temperaturze 25
o
C przez 20 h. Po tym czasie
przenieść po 1 ml każdego roztworu do probówek. Dodać 0,3 ml 5% EDTA + 0,2 ml 1% HCl + 0,5
ml 95% etanolu + 2 ml 0,3% TBA, wymieszać. Zamknięte probówki umieścić w łaźni wodnej –
60
o
C i inkubować przez 1 h. Zawartość probówek dopełnić do objętości 10 ml 62% etanolem,
przesączyć i czytać absorbancję przy długości fali 532 nm względem wody. Porównać wartości
absorbancji dla poszczególnych roztworów, wyciągnąć wnioski.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
Część II
Odczynniki:
1. mieszanina TBA- TCA: 0,375% TBA i 15% TCA rozpuszczone w 0,25 N HCl.
2. 2 % roztwór BHT
3. 30 μmol/ dm
3
roztwór TEP (1,1,3,3- tetraetoksypropan)
Materiał:
surowe, mielone mięso z indyka
Wykonanie:
Zważyć do dwóch krótkich probówek po 1 g mięsa surowego. Do jednej naważki dodać od
razu 20 μl 2% BHT i odstawić do lodówki. Drugą probówkę wstawić do wrzącej wody, zamknąć
korkiem i gotować przez 30 minut. Po ostudzeniu dodać 20 μl 2% BHT. Do obu próbek- mięso
surowe i gotowane-wprowadzić 5 ml mieszaniny TBA-TCA. Probówki wstawić do wrzącej łaźni
wodnej i gotować przez 20 minut. Po ostudzeniu, zawartość probówek odwirować (4 tys. obrotów/
minutę przez 20 minut). Przeczytać absorbancję supernatantów przy długości fali 532 nm,
względem ślepej próby odczynnikowej.
Obliczyć stężenie TBARS (substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym) w oparciu o
odczyt absorbancji wzorca MDA (dialdehyd malonowy) o stężeniu 2,5 μmol/ dm
3
i wyrazić w
μmolach MDA/ g mięsa. W obliczeniach uwzględnić zawartość wody w mięsie.
PRZYGOTOWANIE PRÓBY ŚLEPEJ I WZORCA
a) ślepa próba odczynnikowa: do probówki wprowadzić 1 ml wody destylowanej i 5 ml
mieszaniny TBA i TCA
b) wzorzec MDA o stężeniu 2,5 μmol/ dm
3
: do probówki wprowadzić 0,5 ml wody
destylowanej, 0,5 ml 30 μmol/ dm
3
roztworu TEP i 5 ml mieszaniny TBA i TCA.
Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez 20 minut. Ostudzić. Bardzo
dokładnie wymieszać próbkę wzorcową przed czytaniem absorbancji (532 nm względem próby
ślepej).
Załączniki:
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
O
OH
O
OH
.
O
OH
.
O
OH
O
O
O
OH
O
OH
O
OH
O
OH
O
peroksydacja nienasyconych kwasów tłuszczowych
.
OH
H
2
O
O
2
1
O
2
+
.
OH
O
OH
O
OH
O
OH
O
O
Fe
3+
Fe
2+
+ H
+
LH
L
.
O
2
LOO
.
L
.
O
2
LOO
.
LOOH
LH
itd.
cykliczny nadtlenek
cykliczny endonadtlenek
MDA i inne produkty
C
CH
2
C
O
H
O
H
C
H
3
CH
3
CH
CH C
O
H
CH
CH
2
C
H
3
OH
4
CH
CH
C
O
H
CH
CH
CH
2
C
H
3
2
CH
CH
2
C
H
3
OH
CH
2
C
O
H
3
C
H
3
CH
2
CH
3
3
inicjacja
propagacja
LH
L
.
LOO
.
reinicjacja
dialdehyd malonowy (MDA)
4- hydroksy-2,3-trans-nonenal
hepta-2,4-dienal
hydroksyoktanal
etan
pentan
terminacja
L
.
+ L
.
L-L
LOO
.
+ LOO
.
L=O + LOH + O
2
LOO
.
+ L
.
L=O + LOH
LH- nienasycony kwas tłuszczowy
L
.
- rodnik alkilowy
LOO
.
- rodnik nadtlenkowy
LO
.
- rodnik alkoksylowy
LOOH- wodoronadlenek kwasu tłuszczowego
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 3
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
4
N
N
S
H
OH
OH
N
N
N
N
S
SH
OH
O
H
OH
O
H
C
CH
2
C
O
H
O
H
2
+
reakcja dialdehydu malonowego z kwasem tiobarbiturowym
TBA MDA czerwono-różowy produkt
CH CH
2
C
H
O
O
O
O
CH
2
CH
3
CH
2
CH
3
CH
2
C
H
3
CH
2
C
H
3
C
CH
2
C
O
H
O
H
+
O
H
2
2
C
H
3
CH
2
OH
4
+
przekształcenie 1,1,3,3-tetraetoksypropanu do dialdehydu malonowego
OH
O CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
OH
CH
3
CH
3
CH
3
C
H
3
CH
3
CH
3
CH
3
BHA BHT
syntetyczne antyoksydanty fenolowe
reakcja zmiatania wolnych rodników przez związek fenolowy
OH
O
O
O
O
L
.
LH
.
.
.
reakcja reinicjacji
LOOH + Cu
2+
→ Cu
+
+ H
+
+ LOO
•
Ask-H
2
+ Fe
3+
→ Ask-H
•
+ Fe
2+
+ H
+
LOO
•
+ LH → LOOH + L
•
Fe
2+
+ O
2
↔ Fe(V)-O
2
↔ Fe
3+
+ O
2
•-
LOOH + Fe
3+
→ Fe
2+
+ H
+
+ LOO
•
Cu
2+
→ Cu
+
(pod wpływem reduktora)
LOOH + Fe
2+
→ Fe
3+
+ OH
-
+ LO
•
LOOH + Cu
+
→ Cu
2+
+ OH
-
+ LO
•
LO
•
+ LH → LOH + L
•