Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ
Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby.
Wprowadzenie.
Gleba to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej
skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Posiada ona wiele
funkcji umożliwiających funkcjonowanie ekosystemów glebowych, umożliwia
zakotwiczenie roślin, dostarcza im składników odżywczych, spełnia funkcje buforujące i
filtrujące chroniąc ekosystemy przed wpływem niepożądanych substancji. Ze względu na
swój skład chemiczny oraz właściwości fizyczne gleba jest siedliskiem olbrzymiej ilości
drobnoustrojów i innych żywych organizmów. Drobnoustroje obecne w glebie rozmnażają
się i przetwarzają materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz
nagromadzają substraty niezbędne do uzupełniania zasobów próchnicy a także rozkładają i
mineralizują związki organiczne, przez co włączają w ponowny obieg pierwiastki
nieodzowne w produkcji roślinnej, opartej na asymilacji CO
2
z atmosfery. Najważniejszymi
pierwiastkami, za obieg których w naturze odpowiedzialne są mikroorganizmy glebowe, są
węgiel i azot.
Blisko 50 % masy materii organicznej dostającej się do gleby w postaci resztek
roślin i zwierząt stanowi węgiel. Mikroorganizmy znajdujące się w glebie odzyskują go na
drodze rozkładu i mineralizacji związków organicznych, z których składa się świeża materia
organiczna, w której skład wchodzą cukry proste (heksozy, pentozy), wielocukry takie jak
skrobia, chityna czy celuloza, kwasy organiczne, związki aromatyczne czy związki
hydrofobowe – np. tłuszcze i woski. W zależności od struktury chemicznej poszczególne
składniki masy roślinnej są rozkładane i mineralizowane z różną prędkością. Najszybciej
metabolizowane są przez mikroorganizmy glebowe substancje łatwo rozpuszczalne, takie
jak cukry, aminokwasy, czy kwasy organiczne. Dużo trudniej ze względu na hydrofobowość
mineralizowane są woski, tłuszcze, gumy i garbniki. Jednym z najbardziej odpornych na
rozkład materiałem roślinnym są ligniny (liczna grupa związków aromatycznych). Część
enzymów biorących udział w rozkładzie materii organicznej, wydzielana jest na zewnątrz
komórek produkujących je mikroorganizmów. Przykładem takich enzymów produkowanych
przez mikroorganizmy zewnątrzkomórkowo są np. rozkładające skrobię amylazy, czy też
hydrolizujące wiązania peptydowe obecne w białkach - proteazy. W przypadku amylaz,
głównymi ich producentami są szczepy grzybowe z rodziny Aspergillus oraz bakteryjne
1
Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ
Bacillus, Micrococcus, czy Pseudomonas. Proteazy dzieli się na alkaliczne, obojętne i
kwaśne, ze względu na optimum pH, w którym działają. Głównymi ich producentami są
szczepy Bacillus, Streptomyces, a także Aspergillus.
Kolejnym niezwykle ważnym pierwiastkiem, za którego obieg w środowisku
odpowiedzialne są organizmy zawarte w glebie, jest azot. Dzięki procesom
mikrobiologicznym azot z atmosfery zostaje włączony do związków organicznych komórek
organizmów żywych. Substancje organiczne obecne w szczątkach roślin i zwierząt są
mineralizowane przy współudziale drobnoustrojów, co umożliwia ponowne włączanie do
obiegu azotu i utrzymywanie jego stałego poziomu w atmosferze. Cykl krążenia azotu w
przyrodzie obejmuje kilka procesów. Pierwszym z nich jest wiązanie przez drobnoustroje
azotu cząsteczkowego z atmosfery, przez mikroorganizmy symbiotyczne i wolnożyjące (np.
Azotobacter czy Mycobacterium). Kolejnym jest rozkład przez drobnoustroje organicznych
połączeń azotu, czyli amonifikacja. Jest to proces powstawania jonu amonowego lub
wolnego amoniaku poprzez proteolityczny rozkład białek i dezaminację aminokwasów.
Następnym procesem jest nitryfikacja – czyli proces biologicznego utlenienia amoniaku do
azotanów przy udziale bakterii nitryfikacyjnych. Proces ten może przebiegać kilkuetapowo,
bądź też jednoetapowo. Odpowiedzialne za proces nitryfikacji są bakterie takie jak
Nitrosomonas, Nitrosospina, Nitrobacter, Nitrococcus, bądź też grzyby takie jak Aspergillus
flavus czy Penicillum. Ostatnim procesem przemian azotu przez mikroorganizmy glebowe,
uważanym za niekorzystny ze względu na zubożenie gleby z cennych dla roślin związków
azotowych, jest proces denitryfikacji, polegający na redukcji azotanów do azotu
cząsteczkowego. Za ten proces odpowiedzialne są bakterie heterotroficzne takie jak:
Pseudomonas, Bacillus, czy Micrococcus.
Cel ćwiczenia.
Celem ćwiczenia jest wykazanie zdolności mikroorganizmów obecnych w próbce
gleby do przeprowadzania reakcji rozkładu różnego rodzaju substancji organicznych i
włączania w ponowny cykl przemiany materii zakumulowanego w nich węgla i azotu.
2
Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ
Wykonanie ćwiczenia.
1. Próbkę ziemi (pół łyżeczki) umieścić w jałowej kolbce 50 ml, rozcieńczyć solą
fizjologiczną (15 ml), szyjkę kolbki zabezpieczyć parafilmem i wytrząsać
przez 5 min.. Poczekać na sklarowanie cieczy nadosadowej.
2. Pobrać po 200µl sklarowanej cieczy nadosadowej i nanieść na trzy płytki
Petriego i do dwóch jałowych probówek.
3. W mikrofalówce bądź łaźni rozgrzać do upłynnienia przygotowane podłoża
agarowe, ostudzić do 40-50 °C.
UWAGA!
Do podłoża agarowego służącego
do oznaczania aktywności lipolitycznej dodać tuż po upłynnieniu 3 g tłuszczu
roślinnego na 100 ml podłoża. Do podłoża agarowego z dodatkiem skrobi
dodać zawiesinę 1 g skrobi rozpuszczalnej w 10 ml jałowej wody.
4. Ostudzone podłoża wylewać na płytki Petriego. Pierwszą płytkę z roztworem z
gleby zalać podłożem agarowym z dodatkiem skrobi, drugą podłożem
agarowym z dodatkiem tłuszczu, trzecią podłożem Fraziera z żelatyną.
5. Do jednej przygotowanych próbówek zawierających roztwór z gleby dodać 5
ml pożywki z mannitolem, do drugiej tyle samo 1% wody peptonowej.
6. Wylane płytki oraz probówki z podłożami inkubować przez 7 dni w
temperaturze 26-30°C.
7. Po upływie czasu inkubacji dokonać odczytu płytek:
• Podłoże agarowe z dodatkiem skrobi – oznaczenie bakterii
amylolitycznych – po okresie inkubacji zalać powierzchnię płytki
płynem Lugola – szukać kolonii wokół których wystąpi strefa
przejaśnienia świadcząca o hydrolizie skrobi.
• Podłoże agarowe z tłuszczem – oznaczenie mikroorganizmów
lipolitycznych – po okresie inkubacji zalać powierzchnię podłoża 20%
roztworem siarczanu miedzi (II). Pojawienie się zielonego zabarwienia
kolonii świadczy o zdolności do hydrolizy tłuszczu.
3
Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ
• Podłoże Fraziera z żelatyną – oznaczenie bakterii proteolitycznych –
po inkubacji powierzchnie płytki zalać nasyconym roztworem
siarczanu amonowgo, zamknąć płytkę i pozostawić na 5 min. Nadmiar
płynu ostrożnie odpipetować – obecność kolonii wokół których
powstały strefy przejaśnienia świadczy o hydrolizie białka.
• 1% woda peptonowa – wzrost bakterii w postaci zmętnienia, obecność
kożucha czy osadu oraz zmiana odczynu pH podłoża (ok. 8-9), a także
stwierdzenie obecności amoniaku odczynnikiem Nesslera – pojawia się
pomarańczowe zabarwienie – wskazuje na aktywność bakterii
amonifikacyjnych.
• Podłoże z mannitolem – oznaczenie bakterii asymilujących azot
(Azotobacter) – po okresie inkubacji o obecności tych bakterii
świadczy pojawienie się na powierzchni pożywki grubej śluzowatej
błonki.
Sprawozdanie.
Sporządzić dokumentację zdjęciową/rysunkową otrzymanych wyników.
Skomentować uzyskane wyniki biologiczne (opisać wzrost organizmów na każdej z
pożywek, o obecności jakich organizmów może świadczyć taki wzrost). Opisać i
skomentować zaobserwowane reakcje z poszczególnymi odczynnikami, o czym one
świadczą, wzrost jakiego rodzaju organizmów mógł je spowodować.
4