Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ

Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby.

Wprowadzenie.

Gleba to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej

skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Posiada ona wiele

funkcji umożliwiających funkcjonowanie ekosystemów glebowych, umożliwia

zakotwiczenie roślin, dostarcza im składników odżywczych, spełnia funkcje buforujące i

filtrujące chroniąc ekosystemy przed wpływem niepożądanych substancji. Ze względu na

swój skład chemiczny oraz właściwości fizyczne gleba jest siedliskiem olbrzymiej ilości

drobnoustrojów i innych żywych organizmów. Drobnoustroje obecne w glebie rozmnażają

się i przetwarzają materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz

nagromadzają substraty niezbędne do uzupełniania zasobów próchnicy a także rozkładają i

mineralizują związki organiczne, przez co włączają w ponowny obieg pierwiastki

nieodzowne w produkcji roślinnej, opartej na asymilacji CO

2

z atmosfery. Najważniejszymi

pierwiastkami, za obieg których w naturze odpowiedzialne są mikroorganizmy glebowe, są

węgiel i azot.

Blisko 50 % masy materii organicznej dostającej się do gleby w postaci resztek

roślin i zwierząt stanowi węgiel. Mikroorganizmy znajdujące się w glebie odzyskują go na

drodze rozkładu i mineralizacji związków organicznych, z których składa się świeża materia

organiczna, w której skład wchodzą cukry proste (heksozy, pentozy), wielocukry takie jak

skrobia, chityna czy celuloza, kwasy organiczne, związki aromatyczne czy związki

hydrofobowe – np. tłuszcze i woski. W zależności od struktury chemicznej poszczególne

składniki masy roślinnej są rozkładane i mineralizowane z różną prędkością. Najszybciej

metabolizowane są przez mikroorganizmy glebowe substancje łatwo rozpuszczalne, takie

jak cukry, aminokwasy, czy kwasy organiczne. Dużo trudniej ze względu na hydrofobowość

mineralizowane są woski, tłuszcze, gumy i garbniki. Jednym z najbardziej odpornych na

rozkład materiałem roślinnym są ligniny (liczna grupa związków aromatycznych). Część

enzymów biorących udział w rozkładzie materii organicznej, wydzielana jest na zewnątrz

komórek produkujących je mikroorganizmów. Przykładem takich enzymów produkowanych

przez mikroorganizmy zewnątrzkomórkowo są np. rozkładające skrobię amylazy, czy też

hydrolizujące wiązania peptydowe obecne w białkach - proteazy. W przypadku amylaz,

głównymi ich producentami są szczepy grzybowe z rodziny Aspergillus oraz bakteryjne

1

Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ

Bacillus, Micrococcus, czy Pseudomonas. Proteazy dzieli się na alkaliczne, obojętne i

kwaśne, ze względu na optimum pH, w którym działają. Głównymi ich producentami są

szczepy Bacillus, Streptomyces, a także Aspergillus.

Kolejnym niezwykle ważnym pierwiastkiem, za którego obieg w środowisku

odpowiedzialne są organizmy zawarte w glebie, jest azot. Dzięki procesom

mikrobiologicznym azot z atmosfery zostaje włączony do związków organicznych komórek

organizmów żywych. Substancje organiczne obecne w szczątkach roślin i zwierząt są

mineralizowane przy współudziale drobnoustrojów, co umożliwia ponowne włączanie do

obiegu azotu i utrzymywanie jego stałego poziomu w atmosferze. Cykl krążenia azotu w

przyrodzie obejmuje kilka procesów. Pierwszym z nich jest wiązanie przez drobnoustroje

azotu cząsteczkowego z atmosfery, przez mikroorganizmy symbiotyczne i wolnożyjące (np.

Azotobacter czy Mycobacterium). Kolejnym jest rozkład przez drobnoustroje organicznych

połączeń azotu, czyli amonifikacja. Jest to proces powstawania jonu amonowego lub

wolnego amoniaku poprzez proteolityczny rozkład białek i dezaminację aminokwasów.

Następnym procesem jest nitryfikacja – czyli proces biologicznego utlenienia amoniaku do

azotanów przy udziale bakterii nitryfikacyjnych. Proces ten może przebiegać kilkuetapowo,

bądź też jednoetapowo. Odpowiedzialne za proces nitryfikacji są bakterie takie jak

Nitrosomonas, Nitrosospina, Nitrobacter, Nitrococcus, bądź też grzyby takie jak Aspergillus

flavus czy Penicillum. Ostatnim procesem przemian azotu przez mikroorganizmy glebowe,

uważanym za niekorzystny ze względu na zubożenie gleby z cennych dla roślin związków

azotowych, jest proces denitryfikacji, polegający na redukcji azotanów do azotu

cząsteczkowego. Za ten proces odpowiedzialne są bakterie heterotroficzne takie jak:

Pseudomonas, Bacillus, czy Micrococcus.

Cel ćwiczenia.

Celem ćwiczenia jest wykazanie zdolności mikroorganizmów obecnych w próbce

gleby do przeprowadzania reakcji rozkładu różnego rodzaju substancji organicznych i

włączania w ponowny cykl przemiany materii zakumulowanego w nich węgla i azotu.

2

Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ

Wykonanie ćwiczenia.

1. Próbkę ziemi (pół łyżeczki) umieścić w jałowej kolbce 50 ml, rozcieńczyć solą

fizjologiczną (15 ml), szyjkę kolbki zabezpieczyć parafilmem i wytrząsać

przez 5 min.. Poczekać na sklarowanie cieczy nadosadowej.

2. Pobrać po 200µl sklarowanej cieczy nadosadowej i nanieść na trzy płytki

Petriego i do dwóch jałowych probówek.

3. W mikrofalówce bądź łaźni rozgrzać do upłynnienia przygotowane podłoża

agarowe, ostudzić do 40-50 °C.

UWAGA!

Do podłoża agarowego służącego

do oznaczania aktywności lipolitycznej dodać tuż po upłynnieniu 3 g tłuszczu

roślinnego na 100 ml podłoża. Do podłoża agarowego z dodatkiem skrobi

dodać zawiesinę 1 g skrobi rozpuszczalnej w 10 ml jałowej wody.

4. Ostudzone podłoża wylewać na płytki Petriego. Pierwszą płytkę z roztworem z

gleby zalać podłożem agarowym z dodatkiem skrobi, drugą podłożem

agarowym z dodatkiem tłuszczu, trzecią podłożem Fraziera z żelatyną.

5. Do jednej przygotowanych próbówek zawierających roztwór z gleby dodać 5

ml pożywki z mannitolem, do drugiej tyle samo 1% wody peptonowej.

6. Wylane płytki oraz probówki z podłożami inkubować przez 7 dni w

temperaturze 26-30°C.

7. Po upływie czasu inkubacji dokonać odczytu płytek:

• Podłoże agarowe z dodatkiem skrobi – oznaczenie bakterii

amylolitycznych – po okresie inkubacji zalać powierzchnię płytki

płynem Lugola – szukać kolonii wokół których wystąpi strefa

przejaśnienia świadcząca o hydrolizie skrobi.

• Podłoże agarowe z tłuszczem – oznaczenie mikroorganizmów

lipolitycznych – po okresie inkubacji zalać powierzchnię podłoża 20%

roztworem siarczanu miedzi (II). Pojawienie się zielonego zabarwienia

kolonii świadczy o zdolności do hydrolizy tłuszczu.

3

Aktywność enzymatyczna mikroflory gleby –instrukcja laboratoryjna - MBOŚ

• Podłoże Fraziera z żelatyną – oznaczenie bakterii proteolitycznych –

po inkubacji powierzchnie płytki zalać nasyconym roztworem

siarczanu amonowgo, zamknąć płytkę i pozostawić na 5 min. Nadmiar

płynu ostrożnie odpipetować – obecność kolonii wokół których

powstały strefy przejaśnienia świadczy o hydrolizie białka.

• 1% woda peptonowa – wzrost bakterii w postaci zmętnienia, obecność

kożucha czy osadu oraz zmiana odczynu pH podłoża (ok. 8-9), a także

stwierdzenie obecności amoniaku odczynnikiem Nesslera – pojawia się

pomarańczowe zabarwienie – wskazuje na aktywność bakterii

amonifikacyjnych.

• Podłoże z mannitolem – oznaczenie bakterii asymilujących azot

(Azotobacter) – po okresie inkubacji o obecności tych bakterii

świadczy pojawienie się na powierzchni pożywki grubej śluzowatej

błonki.

Sprawozdanie.

Sporządzić dokumentację zdjęciową/rysunkową otrzymanych wyników.

Skomentować uzyskane wyniki biologiczne (opisać wzrost organizmów na każdej z

pożywek, o obecności jakich organizmów może świadczyć taki wzrost). Opisać i

skomentować zaobserwowane reakcje z poszczególnymi odczynnikami, o czym one

świadczą, wzrost jakiego rodzaju organizmów mógł je spowodować.

4