1 

 

 

ZAKŁAD BIOCHEMII 

UMCS 

BIOCHEMIA II 

I rok II stopnia 

Biochemia 

 

 

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA KOFEINY I TEOBROMINY 

 

Wstęp 

 

Chromatografia  cienkowarstwowa  (CCW,  ang.  TLC  -  thin-layer  chromatography)  jest  używana  w 

różnych  laboratoriach  do  rozdziału  mikrogramowych  ilości  substancji  z  ich  mieszanin.  Chromatografia 

cienkowarstwowa  opiera  się  na  fizykochemicznych  procesach  rozdziału:  odwracalnej  adsorpcji  fizycznej, 

wymiany jonowej i rozdziału substancji między dwie fazy ciekłe. 

Cienka warstwa (faza nieruchoma) składająca się z drobnoziarnistego materiału znajduje się na płytce 

ze  szkła,  metalu  lub  folii.  Mieszaninę  przeznaczoną  do  rozdziału  nanosi  się  punktowo  lub  pasmowo  na  linię 

startu.  Po  umieszczeniu  płytki  w  szczelnie  zamkniętej  komorze,  zawierającej  rozpuszczalnik  /  układ 

rozpuszczalników (fazę ruchomą), następuje rozdział mieszaniny (rozwinięcie chromatogramu). Rozdzielone 

substancje  mogą  być  uwidocznione  poprzez  wzbudzenie  ich  fluorescencji  przez  światło  ultrafioletowe  o 

odpowiedniej długości fali lub za pomocą reakcji barwnych z odpowiednimi odczynnikami, którymi spryskuje 

się chromatogram po rozwinięciu. 

CCW jest często nazywana  „chromatografią w otwartej kolumnie”, bowiem używa  się  w niej tych 

samych  typów  adsorbentów  co  i  w  chromatografii  kolumnowej  (adsorpcyjnej  i  podziałowej):  np.  żelu 

krzemionkowego, celulozy mikrokrystalicznej, tlenku glinu, poliamidów, żeli dekstranowych. 

Chromatografia  cienkowarstwowa  nie  wymaga  skomplikowanej  aparatury,  czas  analizy  jest  krótki  (w 

przypadku  warstwy  nieorganicznego  adsorbentu  zwykle  -  mniej  niż  1  godz.),  niezbędna  ilość  badanego 

materiału  -  bardzo  mała,  zaś  wpływ  towarzyszących  substancji  jest  nieznaczny.  Do  wywoływania 

chromatogramów  można  stosować  „agresywne”  odczynniki,  których  użycie  jest  niemożliwe  w  przypadku 

chromatografii  bibułowej  ze  względu  na  niszczenie  celulozy.  Gotowe  płytki  do  chromatografii 

cienkowarstwowej produkują różne firmy, m.in. Merck. Eastman. Niektóre preparaty (np. Silica Gel GF

254

 firmy 

Merck) zawierają domieszkę  substancji fluoryzujących, które umożliwiają lokalizację związków bez używania 

wywoływaczy, a jedynie przez wystawienie chromatogramu na działanie promieniowania UV (λmax.= 254 nm). 

 

 

Wykonanie ćwiczenia: 

 

Przygotowanie próbek i płytek 

Przygotować roztwór alkaloidów uzyskanych na wcześniejszych ćwiczeniach. W tym celu rozpuścić 10 

mg otrzymanego preparatu w 5 ml mieszaniny chloroform : metanol (3:2). 

 

Na płytce z żelem krzemionkowym GF

254

 zaznaczyć ołówkiem linię startu (2,5 cm od dolnego brzegu) i 

w  odpowiednich  miejscach  nanieść  punktowo  roztwory  wzorców  i  badanego  preparatu.  Odległość  między 

plamami nie powinna być mniejsza niż 2,5 cm. 

2 

 

 

 

Do  suchej  komory  chromatograficznej  wstawić  naczynie  z  20  ml  10%  roztworu  amoniaku.  Komorę 

szczelnie przykryć do nasycenia parami amoniaku, a następnie wstawić płytkę z naniesionymi substancjami na 

okres 20 min. 

 

Po  tym  czasie  naczynko  z  amoniakiem  wyjąć,  a  komorę  napełnić  rozpuszczalnikiem  i  rozwijać 

chromatogram. 

 

Wywoływanie chromatogramu 

a)  wygaszanie fluorescencji UV

254

 

b)  reakcje barwne  - chromatogram  wysuszyć i spryskać alkoholowym roztworem jodu (w ilości  ok. 

10 ml), odczekać 1-2 min., a następnie spryskać alkoholowym roztworem kwasu solnego (w ilości 

5-10 ml). Pojawiają się plamy barwy niebieskofioletowej - dla teobrominy i ciemnobrunatnej - dla 

kofeiny. 

 

 

Zaliczenie ćwiczenia: 

 

 

Przerysować  do  zeszytu  rozwinięty  chromatogram  (uwzględniając  obie  metody  ujawniania  rozdzielonych 

substancji). Wyznaczyć wartości R

f

 dla wzorców i próby badanej. Zamieścić w zeszycie opis ćwiczenia. 

 

 

3 

 

 

Odczynniki i sprzęt: 

 



 

warstwa sorbenta (faza nieruchoma) - żel krzemionkowy GF

254

 



 

układ rozpuszczalników (faza ruchoma) - chloroform : etanol (99 : 1), całkowita zawartość etanolu ok. 

2%. 



 

alkoholowy roztwór jodu - 1,1 g KJ i 2 g jodu rozpuścić w 100 ml etanolu 



 

alkoholowy roztwór kwasu solnego - 5 ml 25% roztworu HC1 zmieszać z 5 ml 96% etanolu. 



 

porównawcze  roztwory  wzorców:  w  10  ml  mieszaniny  chloroform  -  metanol  (3:2)  rozpuszcza  się 

odpowiednio: 5 mg kofeiny i 3 mg teobrominy. Na punkt startu nanosi się ok. 5 µl roztworu. 



 

komora chromatograficzna 



 

krótka probówka 



 

spryskiwacz 



 

papier (do osłonięcia wyciągu przy spryskiwaniu) 



 

lampa UV 

 

 

Piśmiennictwo: 

 

1.  Kłyszejko-Stefanowicz  L.  (red.),  2005,  Ćwiczenia  z  biochemii.  Wydawnictwo  Naukowe  PWN, 

Warszawa 

2.  Information on Thin-Layer Chromatography I. General description of procedure and materials.  Merck, 

Darmstadt