1

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok II stopnia

Biochemia

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA KOFEINY I TEOBROMINY

Wstęp

Chromatografia cienkowarstwowa (CCW, ang. TLC - thin-layer chromatography) jest używana w

różnych laboratoriach do rozdziału mikrogramowych ilości substancji z ich mieszanin. Chromatografia

cienkowarstwowa opiera się na fizykochemicznych procesach rozdziału: odwracalnej adsorpcji fizycznej,

wymiany jonowej i rozdziału substancji między dwie fazy ciekłe.

Cienka warstwa (faza nieruchoma) składająca się z drobnoziarnistego materiału znajduje się na płytce

ze szkła, metalu lub folii. Mieszaninę przeznaczoną do rozdziału nanosi się punktowo lub pasmowo na linię

startu. Po umieszczeniu płytki w szczelnie zamkniętej komorze, zawierającej rozpuszczalnik / układ

rozpuszczalników (fazę ruchomą), następuje rozdział mieszaniny (rozwinięcie chromatogramu). Rozdzielone

substancje mogą być uwidocznione poprzez wzbudzenie ich fluorescencji przez światło ultrafioletowe o

odpowiedniej długości fali lub za pomocą reakcji barwnych z odpowiednimi odczynnikami, którymi spryskuje

się chromatogram po rozwinięciu.

CCW jest często nazywana „chromatografią w otwartej kolumnie”, bowiem używa się w niej tych

samych typów adsorbentów co i w chromatografii kolumnowej (adsorpcyjnej i podziałowej): np. żelu

krzemionkowego, celulozy mikrokrystalicznej, tlenku glinu, poliamidów, żeli dekstranowych.

Chromatografia cienkowarstwowa nie wymaga skomplikowanej aparatury, czas analizy jest krótki (w

przypadku warstwy nieorganicznego adsorbentu zwykle - mniej niż 1 godz.), niezbędna ilość badanego

materiału - bardzo mała, zaś wpływ towarzyszących substancji jest nieznaczny. Do wywoływania

chromatogramów można stosować „agresywne” odczynniki, których użycie jest niemożliwe w przypadku

chromatografii bibułowej ze względu na niszczenie celulozy. Gotowe płytki do chromatografii

cienkowarstwowej produkują różne firmy, m.in. Merck. Eastman. Niektóre preparaty (np. Silica Gel GF

254

firmy

Merck) zawierają domieszkę substancji fluoryzujących, które umożliwiają lokalizację związków bez używania

wywoływaczy, a jedynie przez wystawienie chromatogramu na działanie promieniowania UV (λmax.= 254 nm).

Wykonanie ćwiczenia:

Przygotowanie próbek i płytek

Przygotować roztwór alkaloidów uzyskanych na wcześniejszych ćwiczeniach. W tym celu rozpuścić 10

mg otrzymanego preparatu w 5 ml mieszaniny chloroform : metanol (3:2).

Na płytce z żelem krzemionkowym GF

254

zaznaczyć ołówkiem linię startu (2,5 cm od dolnego brzegu) i

w odpowiednich miejscach nanieść punktowo roztwory wzorców i badanego preparatu. Odległość między

plamami nie powinna być mniejsza niż 2,5 cm.

2

Do suchej komory chromatograficznej wstawić naczynie z 20 ml 10% roztworu amoniaku. Komorę

szczelnie przykryć do nasycenia parami amoniaku, a następnie wstawić płytkę z naniesionymi substancjami na

okres 20 min.

Po tym czasie naczynko z amoniakiem wyjąć, a komorę napełnić rozpuszczalnikiem i rozwijać

chromatogram.

Wywoływanie chromatogramu

a) wygaszanie fluorescencji UV

254

b) reakcje barwne - chromatogram wysuszyć i spryskać alkoholowym roztworem jodu (w ilości ok.

10 ml), odczekać 1-2 min., a następnie spryskać alkoholowym roztworem kwasu solnego (w ilości

5-10 ml). Pojawiają się plamy barwy niebieskofioletowej - dla teobrominy i ciemnobrunatnej - dla

kofeiny.

Zaliczenie ćwiczenia:

Przerysować do zeszytu rozwinięty chromatogram (uwzględniając obie metody ujawniania rozdzielonych

substancji). Wyznaczyć wartości R

f

dla wzorców i próby badanej. Zamieścić w zeszycie opis ćwiczenia.

3

Odczynniki i sprzęt:



warstwa sorbenta (faza nieruchoma) - żel krzemionkowy GF

254



układ rozpuszczalników (faza ruchoma) - chloroform : etanol (99 : 1), całkowita zawartość etanolu ok.

2%.



alkoholowy roztwór jodu - 1,1 g KJ i 2 g jodu rozpuścić w 100 ml etanolu



alkoholowy roztwór kwasu solnego - 5 ml 25% roztworu HC1 zmieszać z 5 ml 96% etanolu.



porównawcze roztwory wzorców: w 10 ml mieszaniny chloroform - metanol (3:2) rozpuszcza się

odpowiednio: 5 mg kofeiny i 3 mg teobrominy. Na punkt startu nanosi się ok. 5 µl roztworu.



komora chromatograficzna



krótka probówka



spryskiwacz



papier (do osłonięcia wyciągu przy spryskiwaniu)



lampa UV

Piśmiennictwo:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa

2. Information on Thin-Layer Chromatography I. General description of procedure and materials. Merck,

Darmstadt