1

Ćwiczenie 3

Analiza wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)

metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem

spektrofotometrycznym UV

1. Wprowadzenie

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA, w literaturze ang. PAH)

powstają z materiału organicznego podczas pirolizy lub niepełnego spalania. Najczęściej

ź

ródłem zanieczyszczeń środowiska związkami WWA są: rafinerie ropy naftowej, przemysł

koksowniczy, elektrownie i elektrociepłownie, przemysł materiałów plastycznych i

farbiarskich oraz spalanie odpadków. Węglowodory znajdują się również w spalinach

samochodowych i w dymie papierosowym.

Analizę WWA metodą HPLC prowadzi się w układzie faz odwróconych, tzn. na

niepolarnej fazie stacjonarnej. Ten typ chromatografii jest najbardziej odpowiedni do

rozdzielania mieszaniny związków niepolarnych lub słabo polarnych na pojedyncze związki.

Jako fazy ruchome używane są woda, acetonitryl i metanol oraz ich mieszaniny. Detektorem

stosowanym do analizy WWA może być detektor spektrofotometryczny UV. Działa na

zasadzie pomiaru absorpcji promieniowania UV. Miarą sygnału z detektora jest wysokość

(lub powierzchnia) piku chromatograficznego.

Celem ćwiczenia jest dokonanie analizy ilościowej mieszaniny węglowodorów:

naftalenu i fenantrenu metodą dodatku wzorca. W metodzie dodatku wzorca wzorcem jest

substancja oznaczana. W metodzie wykorzystuje się liniową zależność wielkości mierzonej

(czyli w naszym przypadku wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego) od

stężenia analitu. Równanie przedstawiające liniową zależność wielkości mierzonej jako

funkcję stężenia analitu można przedstawić w postaci:

Y = m × c

(1)

gdzie:

Y - wielkość mierzona, c - stężenie analitu, m - współczynnik.

2

Analiza ilościowa metodą dodatku wzorca składa się z dwu etapów (rys. 1):

- przygotowanie próbki analizowanej i wykonanie pomiaru. Mierzymy wysokość (lub

powierzchnię) piku chromatograficznego dla analitu.

- do tej samej próbki dodajemy znaną objętość roztworu wzorca o znanym stężeniu. Roztwór

mieszamy i powtórnie mierzymy wysokość piku chromatograficznego. Wysokość piku

chromatograficznego analitu wzrasta a wzrost jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.

Metodę dodatku wzorca stosujemy, jeżeli równanie (1) ma przebieg prostoliniowy.

Ponadto, objętość próbki wprowadzanej na kolumnę chromatograficzną musi być stała.

Warunek ten jest spełniony w przypadku stosowania dozowników typu zaworu z pętlą.

a)

b)

Rysunek 1. Analiza HPLC próbki (a) oraz analiza próbki po dodaniu wzorca (b).

Stężenie analitu można policzyć na podstawie równań:

Y

0

= m × c

(2)

Y

1

= m × (c + c

p

)

(3)

gdzie: Y

0

- wysokość (lub powierzchnia) piku chromatograficznego zmierzona dla

próbki bez dodatku wzorca, Y

1

- wysokość (lub powierzchnia) piku

chromatograficznego zmierzona dla próbki po dodaniu wzorca, m –współczynnik, c -

stężenie analitu w próbce, c

p

- stężenie dodanego wzorca w próbce.

Analit

Analit + wzorzec

3

Stężenie dodanego wzorca w próbce (c

p

) obliczmy ze wzoru:

c

p

×V

p

= c

s

× V

s

(4),

gdzie: V

p

– objętość próbki, c

s

– stężenie roztworu wzorca, który dodajemy do próbki,

V

s

- objętość roztworu wzorca, który dodajemy do próbki.

Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej próbki.

Jeżeli do roztworu próbki o dużej objętości (10 - 100 ml), dodajemy roztwór wzorca za

pomocą mikrostrzykawki, która umożliwia dozowanie małych objętości (10 - 100 µl), to

zmiana objętości roztworu próbki po dodaniu roztworu wzorca jest nieznaczna i nie zachodzi

konieczność wprowadzania korekty objętości.

2. Wykonanie ćwiczenia

2.1. Warunki analizy chromatograficznej

Chromatograf cieczowy HPLC składa się z pompy o pojedynczym tłoku, detektora

spektrofotometrycznego UV z filtrem 254 nm oraz dozownika typu zaworu z pętlą. Do

analizy zostanie wykorzystana szklana kolumna analityczna o wymiarach 150 x 3 mm w

pancerzu stalowym. Wypełnienie (RP 18) stanowi żel krzemionkowy z chemicznie

związanymi grupami oktadecylowymi czyli tzw. odwrócone fazy; średnica ziaren 7

µ

m. Fazą

ruchomą jest mieszanina metanol/woda w stosunku 85 : 15, warunki rozdziału izokratyczne.

2.2. Analiza chromatograficzna

Celem ćwiczenia jest analiza ilościowa naftalenu i fenantrenu w wodzie. Należy wykonać

analizę chromatograficzną roztworu próbki. Do próbki należy dodać określoną objętość

roztworu wzorca a następnie powtórnie wykonać analizę próbki. Po każdej analizie

koniecznie należy umyć kilkakrotnie strzykawkę a także pętlę dozownika metanolem.

2.3. Opracowanie wyników

Należy zmierzyć wysokości (lub powierzchnie) pików naftalenu i fenantrenu na otrzymanych

chromatogramach. Na podstawie uzyskanych danych określa się stężenia naftalenu i

fenantrenu w analizowanym roztworze. W opracowaniu należy podać wszystkie wykonane

obliczenia.

4

3. Zakres wymaganych wiadomości

- podstawowe pojęcia i definicje dotyczące procesu chromatograficznego min. czas i objętość

retencji, czas martwy (zerowy), zredukowany czas retencji, współczynnik podziału K,

współczynnik retencji (współczynnik pojemności) k, współczynnik selektywności

α

, zdolność

rozdzielcza kolumny R

s

, sprawność kolumn chromatograficznych (WRPT, N),

- analiza ilościowa: metoda dodatku wzorca,

- wysokosprawna chromatografia cieczowa,

- schemat blokowy HPLC ze szczególnym uwzględnieniem dozownika typu zaworu z pętlą

oraz detektora spektrofotometrycznego UV,

- fazy stacjonarne i ruchome stosowane w chromatografii adsorpcyjnej i podziałowej HPLC a

zwłaszcza: żel krzemionkowy i fazy odwrócone, nośniki, fazy związane chemicznie, szereg

eluotropowy,

- rozdział w warunkach izokratycznych i w gradiencie,

- budowa i zasada działania detektora spektrofotometrycznego UV, prawa absorpcji

promieniowania.

Literatura:

W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa, 1996.

Ewentualnie:

J. Minczewski, Z. Marczewski, Chemia analityczna, tom III, Analiza instrumentalna,

PWN, W-wa.

G. W. Ewing, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa.