1
Ćwiczenie 3
Analiza wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)
metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem
spektrofotometrycznym UV
1. Wprowadzenie
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA, w literaturze ang. PAH)
powstają z materiału organicznego podczas pirolizy lub niepełnego spalania. Najczęściej
ź
ródłem zanieczyszczeń środowiska związkami WWA są: rafinerie ropy naftowej, przemysł
koksowniczy, elektrownie i elektrociepłownie, przemysł materiałów plastycznych i
farbiarskich oraz spalanie odpadków. Węglowodory znajdują się równieŜ w spalinach
samochodowych i w dymie papierosowym.
Analizę WWA metodą HPLC prowadzi się w układzie faz odwróconych, tzn. na
niepolarnej fazie stacjonarnej. Ten typ chromatografii jest najbardziej odpowiedni do
rozdzielania mieszaniny związków niepolarnych lub słabo polarnych na pojedyncze związki.
Jako fazy ruchome uŜywane są woda, acetonitryl i metanol oraz ich mieszaniny. Detektorem
stosowanym do analizy WWA moŜe być detektor spektrofotometryczny UV. Działa na
zasadzie pomiaru absorpcji promieniowania UV. Miarą sygnału z detektora jest wysokość
(lub powierzchnia) piku chromatograficznego.
Celem ćwiczenia jest dokonanie analizy ilościowej mieszaniny węglowodorów:
naftalenu i fenantrenu metodą dodatku wzorca. W metodzie dodatku wzorca wzorcem jest
substancja oznaczana. W metodzie wykorzystuje się liniową zaleŜność wielkości mierzonej
(czyli w naszym przypadku wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego) od
stęŜenia analitu. Równanie przedstawiające liniową zaleŜność wielkości mierzonej jako
funkcję stęŜenia analitu moŜna przedstawić w postaci:
Y = m × c
(1)
gdzie:
Y - wielkość mierzona, c - stęŜenie analitu, m - współczynnik.
2
Analiza ilościowa metodą dodatku wzorca składa się z dwu etapów (rys. 1):
- przygotowanie próbki analizowanej i wykonanie pomiaru. Mierzymy wysokość (lub
powierzchnię) piku chromatograficznego dla analitu.
- do tej samej próbki dodajemy znaną objętość roztworu wzorca o znanym stęŜeniu. Roztwór
mieszamy i powtórnie mierzymy wysokość piku chromatograficznego. Wysokość piku
chromatograficznego analitu wzrasta a wzrost jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.
Metodę dodatku wzorca stosujemy, jeŜeli równanie (1) ma przebieg prostoliniowy.
Ponadto, objętość próbki wprowadzanej na kolumnę chromatograficzną musi być stała.
Warunek ten jest spełniony w przypadku stosowania dozowników typu zaworu z pętlą.
a)
b)
Rysunek 1. Analiza HPLC próbki (a) oraz analiza próbki po dodaniu wzorca (b).
StęŜenie analitu moŜna policzyć na podstawie równań:
Y
0
= m × c
(2)
Y
1
= m × (c + c
p
)
(3)
gdzie: Y
0
- wysokość (lub powierzchnia) piku chromatograficznego zmierzona dla
próbki bez dodatku wzorca, Y
1
- wysokość (lub powierzchnia) piku
chromatograficznego zmierzona dla próbki po dodaniu wzorca, m –współczynnik, c -
stęŜenie analitu w próbce, c
p
- stęŜenie dodanego wzorca w próbce.
Analit
Analit + wzorzec
3
StęŜenie dodanego wzorca w próbce (c
p
) obliczmy ze wzoru:
c
p
×V
p
= c
s
× V
s
(4),
gdzie: V
p
– objętość próbki, c
s
– stęŜenie roztworu wzorca, który dodajemy do próbki,
V
s
- objętość roztworu wzorca, który dodajemy do próbki.
Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej próbki.
JeŜeli do roztworu próbki o duŜej objętości (10 - 100 ml), dodajemy roztwór wzorca za
pomocą mikrostrzykawki, która umoŜliwia dozowanie małych objętości (10 - 100 µl), to
zmiana objętości roztworu próbki po dodaniu roztworu wzorca jest nieznaczna i nie zachodzi
konieczność wprowadzania korekty objętości.
2. Wykonanie ćwiczenia
2.1. Warunki analizy chromatograficznej
Chromatograf cieczowy HPLC składa się z pompy o pojedynczym tłoku, detektora
spektrofotometrycznego UV z filtrem 254 nm oraz dozownika typu zaworu z pętlą. Do
analizy zostanie wykorzystana szklana kolumna analityczna o wymiarach 150 x 3 mm w
pancerzu stalowym. Wypełnienie (RP 18) stanowi Ŝel krzemionkowy z chemicznie
związanymi grupami oktadecylowymi czyli tzw. odwrócone fazy; średnica ziaren 7
µ
m. Fazą
ruchomą jest mieszanina metanol/woda w stosunku 85 : 15, warunki rozdziału izokratyczne.
2.2. Analiza chromatograficzna
Celem ćwiczenia jest analiza ilościowa naftalenu i fenantrenu w wodzie. NaleŜy wykonać
analizę chromatograficzną roztworu próbki. Do próbki naleŜy dodać określoną objętość
roztworu wzorca a następnie powtórnie wykonać analizę próbki. Po kaŜdej analizie
koniecznie naleŜy umyć kilkakrotnie strzykawkę a takŜe pętlę dozownika metanolem.
2.3. Opracowanie wyników
NaleŜy zmierzyć wysokości (lub powierzchnie) pików naftalenu i fenantrenu na otrzymanych
chromatogramach. Na podstawie uzyskanych danych określa się stęŜenia naftalenu i
fenantrenu w analizowanym roztworze. W opracowaniu naleŜy podać wszystkie wykonane
obliczenia.
4
3. Zakres wymaganych wiadomości
- podstawowe pojęcia i definicje dotyczące procesu chromatograficznego min. czas i objętość
retencji, czas martwy (zerowy), zredukowany czas retencji, współczynnik podziału K,
współczynnik retencji (współczynnik pojemności) k, współczynnik selektywności
α
, zdolność
rozdzielcza kolumny R
s
, sprawność kolumn chromatograficznych (WRPT, N),
- analiza ilościowa: metoda dodatku wzorca,
- wysokosprawna chromatografia cieczowa,
- schemat blokowy HPLC ze szczególnym uwzględnieniem dozownika typu zaworu z pętlą
oraz detektora spektrofotometrycznego UV,
- fazy stacjonarne i ruchome stosowane w chromatografii adsorpcyjnej i podziałowej HPLC a
zwłaszcza: Ŝel krzemionkowy i fazy odwrócone, nośniki, fazy związane chemicznie, szereg
eluotropowy,
- rozdział w warunkach izokratycznych i w gradiencie,
- budowa i zasada działania detektora spektrofotometrycznego UV, prawa absorpcji
promieniowania.
Literatura:
W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa, 1996.
Ewentualnie:
J. Minczewski, Z. Marczewski, Chemia analityczna, tom III, Analiza instrumentalna,
PWN, W-wa.
G. W. Ewing, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa.