Skrypt ćw. (krok po kroku)!
Opis metody można znaleźć na stronie: http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/chromatografia-
cieczowa-saczenie-molekularne
Oczyszczanie lakazy:
1. Wykonać roztwór do kalibracji: szczyptę Blue Dextranu (niebieski) i szczyptę dwuchromianu
potasu (czerwony) zalać ok. 2-5 ml wody – dokładne obliczanie masy i objętości nie jest
konieczne. Roztwór ten musi mieć barwę mocno zieloną.
2. Przepłukać kolumnę chromatograficzną 20 ml wody destylowanej wprowadzając ją do
kolumny powoli, za pomocą pipety pasteur’owskiej, starając się, by prądy wody nie podnosiły
złoża oraz pilnując by żel (Sephadex G-25) nie miał kontaktu z powietrzem. Można
wykonywać w tym samym czasie, co pkt. 1.
3. Po przepłukaniu pozostawić w kolumnie minimalną ilość wody przykrywającą żel (menisk
wklęsły = dolny ma wręcz dotykać żelu).
4. Do kolumny dodać 2 ml (lub inną określoną objętość) uprzednio przygotowanego roztworu
do kalibracji.
5. Rozpocząć zbieranie do cylindra miarowego tzw. objętości martwej – bezbarwnej wody
spływającej z żelu, aż do pojawienia się barwnego Blue Dextranu.
6. „Wpuścić” roztwór do kalibracji w żel, pozostawiając jedynie menisk wklęsły na powierzchni
żelu. Zatrzymać rozdział – obserwujemy szybsze przechodzenie w żelu cząsteczek Blue
Dextranu (który symuluje lakazę), a wolniejsze czerwonego/żółtego dwuchromianu potasu
(symulującego zanieczyszczenia).
7. Powoli dolewać do kolumny wody destylowanej, by nie zburzyć żelu i nie rozcieńczać
badanego roztworu do kalibracji.
8. Spuszczać wodę destylowaną do cylindra miarowego, pamiętając o uzupełnianiu jej. Żel w
kolumnie nie może mieć kontaktu z powietrzem.
9. Obserwować barwę roztworu łapanego do cylindra. W momencie przypuszczalnej zmiany
barwy roztworu na niebieską należy zebrać kilka kropli roztworu do eppendorfu, by
sprawdzić jego kolor. Jeśli roztwór rzeczywiście jest niebieski, zamknąć przepływ w kolumnie,
zanotować w zeszycie objętość martwą zebraną w cylindrze, a następnie opróżnić cylinder i
zbierać do niego frakcję Dextranu Blue (niebieską)
a. Zwykle objętość martwa mieści się w przedziale 7-8 ml, jednak zależy ona od stężenia
przygotowanego roztworu do kalibracji oraz „zużycia” żelu Sephadex G-25. Należy
więc zachować czujność.
10. W podobny sposób jak opisano powyżej zebrać frakcję niebieską frakcję Blue Dextranu –
symuluje ona objętość, w której pojawi się bezbarwna lakaza - enzym, którego aktywność
mamy w planach oznaczyć. Pamiętać o uzupełnianiu wody destylowanej w kolumnie. Nie
dopuścić do kontaktu żelu z powietrzem.
11. Po przypuszczalnej zmianie barwy roztworu z niebieskiej na zieloną należy zebrać kilka kropli
roztworu do eppendorfu, by sprawdzić jego kolor. Jeśli nastąpiła zmiana zabarwienia
zamykamy przepływ w kolumnie i notujemy objętość Dextranu Blue po chromatografii. Jeśli
nie nastąpiła zmiana (pośpieszyliśmy się) należy kolejne krople zbierać do cylindra, a do jego
końcowego wyniku dodać objętość zgromadzoną w eppendorfach.
a. Zwykle objętość Dextranu Blue mieści się w przedziale 3-5 ml, jednak zależy ona od
stężenia przygotowanego roztworu do kalibracji oraz „zużycia” żelu Sephadex G-25.
Czujność wysoce wskazana.
12. Ważne jest, by nie zbierać w tej próbce dwuchromianu potasu (nawet kosztem zmniejszenia
ilości zebranego Dextranu Blue), gdyż symuluje on zanieczyszczenia, których chcemy się
pozbyć metodą chromatografii.
13. Po zakończeniu zbierania dwuchromianu potasu zapisujemy jego objętość – będzie to
objętość, po której w kolumnie chromatograficznej znajduje się sama woda destylowana, o
ile pamiętaliście o jej regularnym uzupełnianiu.
14. Przygotować roztwór lakazy w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 1 g/ml.
15. Spuścić wodę destylowaną do menisku dolnego, a następnie dodać 1 ml (lub inną określoną
ilość) przygotowanego roztworu lakazy.
16. Przepuścić roztwór przez chromatograf, łapiąc określone frakcje:
a. Jeśli objętości martwej w przypadku roztworu do kalibracji było np. 7 ml to oznacza,
że dokładnie po takiej objętości pierwsze cząsteczki lakazy dotrą do wylotu
chromatografu. Należy więc po 7 ml zamknąć przepływ, zanotować objętość martwą
tego przypadku i zlać łapaną do cylindra wodę.
b. Lakaza jest bezbarwna, więc nie sposób dokładnie określić momentu rozpoczęcia jej
frakcjonowania. Z tego powodu „łapiemy” do cylindra ilość określoną w procesie
kalibracji. Jeśli frakcja Dextranu Blue miała objętość np. 4 ml to oznacza, że dokładnie
taką samą objętość mamy pobrać bezbarwnego produktu z chromatografu – i,
zaprawdę powiadam wam, będzie to oczyszczony (odsolony) roztwór lakazy.
c. Po pobraniu frakcji lakazy łapiemy objętość, którą wcześniej oznaczaliśmy obecnością
barwnego dwuchromianu potasu.
17. Należy pamiętać o uzupełnianiu wody destylowanej w kolumnie, by nie dopuścić do kontaktu
żelu z powietrzem.
18. Po otrzymaniu roztworu lakazy należy przepłukać kolumnę chromatograficzną objętością ok.
20 ml wody destylowanej.
19. Przygotowujemy próbki, które będziemy badać spektrofotometrycznie (można wykonywać w
tym samym czasie, co pkt. 18)
20. Ustalamy rozcieńczenie enzymu – lakazy (w naszym przypadku było ono 10-krotne). Oznacza
to, że do probówek dodawaliśmy składniki w następującej ilości i kolejności:
a. 500 ul buforu McIlvaine’a (o określonym pH)
b. 440 ul wody destylowanej (350 ul do uzupełnienia próbki oraz 90 ul do rozcieńczenia
enzymu)
c. 10 ul lakazy
d. 50 ul 0,5 M roztworu syryngaldazyny (DODAWAĆ TUŻ PRZED POMIAREM – stojąc
obok spektrofotometru)
e. Końcowa objętość próbki wynosi 1 ml.
21. Aby przeprowadzić pomiar należy ustawić na spektrofotometrze następujące parametry:
a. Czas trwania reakcji: 60-120 s (w zależności od ustaleń)
b. Czas trwania interwałów: 10-20 s (w zależności od ustaleń)
c. Długość fali: 525 nm
d. Factor: 2564 [nkat/l]
22. Najwyższą aktywność lakaza wykazuje w pH 5,5-6,0, więc właśnie jedną z tych wartości
należy wybrać jako pierwszą - wzorcową. Wykres zależności aktywności lakazy od pH
powinien być zgodny rozkładem normalnym (Gaussa-Laplace’a, krzywą dzwonową).
23. Po wykonaniu próbki (BEZ syryngaldazyny) przenosimy ją na stanowisko ze
spektrofotometrem (już ustawionym).
24. Należy zbadać aktywność lakazy w następujących pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0, a
następnie wyciągnąć wnioski na podstawie wyników. Każdą próbę powtarzamy dwa razy.
a. W przypadku, gdy aparat pokaże wynik ujemny uznajemy, że brak jest aktywności
enzymu w danym pH - wpisujemy 0 do tabeli.
b. W wypadku rozbieżności w wynikach o wartości przekraczającej 1/3 pierwotnego
wyniku wykonujemy trzecią, decydującą próbkę. W przypadku, gdy aktywność w niej
zaobserwowana będzie w odchyleniu 1/3 od średniej dwóch poprzednich wyników i
każdego z tych wyników z osobna, wykonujemy czwartą próbkę. Jeśli trzecia próbka
będzie porównywalna do jednej z dwóch poprzedzających ją, wybieramy te dwie
próbki do obróbki statystycznej – wyciągnięcia średniej – wspominając także o
pominięciu wyniku ostatniej próby.
i. Próbka I – 200, Próbka II – 600. Należy wykonać trzecią próbkę, ponieważ 1/3
z 600 = 200, a 600 – 200 = 400, czyli rozbieżność między próbkami jest
większa niż 1/3 wartości wyższego wyniku.
ii. Próbka III – 500. Próbka III mieści się w odchyleniu 1/3 zarówno w stosunku
do średniej dwóch poprzedzających ją próbek (400), jak i do próbki II (600),
co oznacza, że próbkami, które będziemy brać pod uwagę będą próbka II
oraz próbka III. Średnia aktywność dla danego pH będzie wynosić 550.
iii. Dlaczego tak się dzieje? Czasem przyczyną jest źle umyty tip, czasem
nieprzepipetowanie roztworu w kuwecie, czasem błąd w dodawaniu
poszczególnych składników, lub błąd maszyny. Nie należy się tym
przejmować i tego specjalnie dociekać, a powtarzać doświadczenie do
osiągnięcia oczekiwanych wniosków.
25. Otrzymane wyniki notujemy w celu wyciągnięcia wniosków końcowych i wykonania wykresu
zależności aktywności lakazy od pH.
26. Przygotowujemy odpowiednio rozcieńczoną próbkę (w naszym przypadku 50-krotnie –
2 ul próbki, 98 ul wody do rozcieńczenia, czyli ogółem 448 ul wody destylowanej) roztworu
nieoczyszczonego (tego, który nakraplaliśmy na kolumnę chromatograficzną) i mierzymy jej
aktywność w pH o najwyższej aktywności (ph 5,5-6,0).
27. Przelewamy lakazę do oddzielnych eppendorfów, szczelnie zamykamy i podpisujemy (nie
piktogramami, ale słownie, aby było jasne, która grupa wykonała dane doświadczenie) –
będziemy na niej pracować w przyszłości.
28. Wykonujemy sprawozdanie:
a. Porównujemy aktywność enzymu w różnych pH odnosząc te wartości do aktywności
nieoczyszczonego enzymu (uwzględniając różnice rozcieńczenia i objętości).
b. W MS Excel nanosimy otrzymane dane potrzebne do sporządzenia wykresu
zależności aktywności enzymu od pH.
c. Obliczamy wydajność oczyszczania.