Elementy Biotechnologii

WYKŁAD NR 3

Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii

Warszawa, 20.03.2005

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym.

Wirusy, bakterie, grzyby.

Wymagania pokarmowe.

Otrzymywanie szczepów przemysłowych - izolacja, selekcja.

Biologiczne źródła węgla, azotu, tlenu, źródła energii.

Przenoszenie energii.

ELEMENTY BIOTECHNOLOGII

WYKŁAD NR 3

literatura wykorzystana do wykładu
K. Szewczyk: Technologia biochemiczna, Wydawnictwa Politechniki Warszawskiej 1997
W.J.H. Kunicki-Goldfinger: Życie bakterii, PWN, Warszawa
J. Kączkowski: Podstawy Biochemii, rozdz. 5, WNT, Warszawa

• MIKROORGANIZMY JAKO ŹRÓDŁO BIOMASY

drożdże piekarnicze, paszowe, kultury startowe do przetwórstwa mleka,
szczepionki

• MIKROORGANIZMY JAKO MIKROFABRYKI PRODUKTÓW
METABOLIZMU

technologie produkcji metabolitów pierwotnych i wtórnych

• MIKROORGANIZMY JAKO CZYNNIKI UTYLIZUJĄCE SUBSTRATY

technologie ochrony środowiska, oczyszczanie ścieków, mikroorganizmy
w biometalurgii

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

podział mikroorganizmów według:

RODZAJU ŹRÓDŁA WĘGLA:

• organizmy autotroficzne (samożywne, bazują na CO

2

)

• organizmy heterotroficzne (cudzożywne, bazują na związkach
organicznych)

RODZAJU ŹRÓDŁA ENERGII:

• organizmy chemotroficzne (rozkład zw. chemicznych)
• organizmy fototroficzne (absorbcja promieniowania świetlnego)

RODZAJU DONORÓW ELEKTRONÓW I PROTONÓW:

• organizmy fitotroficzne (ze zw. nieorganicznych)
• organizmy organotroficzne (ze zw. nieorganicznych)

FOTOAUTOTROFY

samożywne, korzystają z energii słonecznej
(glony, sinice, niektóre bakterie)
oczyszczanie ścieków, produkcja biomasy

CHEMOLITOTROFY

korzystają z energii zredukowanych związków
(bakterie metanowe, wodorowe, żelazowe, nitryfikujące,
siarkowe)
oczyszczanie ścieków, ługowanie metali

HETEROTROFY

korzystają ze związków organicznych
(większość bakterii i grzybów)
najpowszechniej wykorzystywane w biotechnologiach

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

TYPY ODDYCHANIA
•

tlenowe

O

2

H

2

O

•

fermentacja

przemiana zw. organicznych

•

azotanowe

NO

3

-

NO

2

-

•

siarczanowe

SO

4

2-

S

2-

•

fermentacja metanowa

CO

2

CH

4

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

ORGANIZMY

PROTOTROFICZNE
syntezują wszelkie niezbędne
substancje z pojedynczego źródła
pokarmu

AUKSOTROFICZNE
wymagają dodatku witamin,
aminokwasów lub innych
zw. organicznych

cząstki z pogranicza organizmów żywych

zbudowane z jednego rodzaju kwasu nukleinowego (albo RNA albo
DNA)

otoczone płaszczem białkowym (kapsydem)

wykorzystywane do wprowadzania fragmentów informacji genetycznej
(celowe infekowanie komórek)

WIRUSY

wirusy:
bakteryjne (bakteriofagi)
sinic (cyanofagi)
roślinne
zwierzęce

podział wirusów wg budowy kapsydu:

wirusy o budowie helikoidalnej (spiralne) -
kwas nukleinowy otoczony cylindrem
białkowym o strukturze helikalnej

wirusy bryłowe (izometryczne) kwas
nukleinowy otoczony kapsydem wielościennym
najczęściej ikosaedrem ( dwudziestościanem)
lub dodekaedrem (dwunastościanem)

wirusy zawierające oprócz helikoidalnego lub
bryłowego kapsydu dodatkową otoczkę
białkową (Enveloped viruses)

wirusy złożone (binalne) nie mają struktury
helikoidalnej ani izometrycznej, są nieregularne
lub mają strukturę złożoną

WIRUSY

Electron Micrograph of
Herpes Simplex Type 6
Virus

rysunek niedostępny w wersji internetowej

WIRUSY

WIRUS TYPU HELIKOIDALNEGO

Viral Structure (Enveloped Helical Virus)

Viral Structure (Enveloped Polyhedral Virus)

WIRUS TYPU IZOMETRYCZNEGO
(BRYŁOWEGO)

rysunek niedostępny w wersji internetowej

rysunek niedostępny w wersji internetowej

rysunek niedostępny w wersji internetowej

rysunek niedostępny w wersji internetowej

WIRUSY

Electron Micrograph of Coliphage T4

Caption:-- T4 bacteriophage (DNA virus).
File Name:-- 58579A
Category:-- Viruses Type of Image:-- TEM
Magnification:-- x55,065--(Based on an image size of 1 inch
in the narrow dimension)

WIRUS TYPU BINALNEGO

(ZŁOŻONY)

rysunek niedostępny w wersji internetowej

rysunek niedostępny w wersji internetowej

WIRUSY

adsorpcja

namnażanie i dojrzewanie wirusa

zniszczenie komórki żywiciela
oi uwolnienie wirusa

penetracja

rysunek niedostępny w wersji internetowej

rysunek niedostępny w wersji internetowej

BAKTERIE

ZASTOSOWANIE

kwasu mlekowego

fermentowane napoje mleczne, sery, dekstran

przetrwalnikujące

enzymy, antybiotyki, aceton, butanol

promieniowce

antybiotyki, enzymy

fermentacji alkoholowej

etanol

metylotroficzne

biomasa z metanolu

metanogenne

biogaz

kwasu octowego

ocet, utlenianie sorbitolu

kwasu propionowego

kwas propionowy, witamina B

12

, serowarstwo

celulolityczne

degradacja celulozy

chemolitotroficzne

ługowanie rud metali

BAKTERIE

Ziarenkowce
(coccus)

sferyczne
do 1

µm

Pałeczki

podłużne
do 2

µm

Pałeczki

podłużne
2-5

µm

BAKTERIE

komórki prokariotyczne:
nukleoid (długa podwójna helisa DNA
zanurzona w cytoplazmie i stykająca się
bezpośrednio z jej składnikami)

model mozaikowy budowy błony

u prokariotów błona pełni czynności
mitochondriów:

wnikanie pokarmu (permeazy)
zawiera enzymy i przekaźniki elektronów

cholesterol
fosfatydylocholina
fosfatydyloglicerol
fosfatydyloetanoloamina
lizynofosfatydyloglicerol
inne lipidy

erytrocyty
25
23
0
20
0
32

mitochondria
5
48
1
28
0
18

Escherichia
coli
0
0
0
100
0
0

Bacillus
megaterium
0
0
45
45
10
0

rysunek niedostępny w wersji internetowej

GRZYBY

GRZYBY o znaczeniu przemysłowym

Drożdże

Pleśnie (grzyby strzępkowe)

cykl życiowy GRZYBÓW Aspergillus i Penicillium:
1. kiełkowanie konidów (strzępków)
2. namnażanie grzybni
3. sporulacja (wytwarzanie konidów)

organizmy cudzożywne, biorą udział w obiegu materii w przyrodzie -
powodują procesy gnilne

GRZYBY

Mykologia - nauka o grzybach.
Grzyby obejmują: drożdże, pleśnie i grzyby
kapeluszowe

•

chemoheterotrofy - wymagają

związków organicznych i źródeł
energii
•

absorbują składniki odżywcze

•

są względnymi

(fakultatywnymi) anaerobami
•

spośród 100,000 gatunków

grzybów tylko około 100 jest
patogenne dla organizmów
zwierzęcych
•

mają polisacharydowe ściany

komórkowe

Penicillium

zdjęcie niedostępne w wersji internetowej

GRZYBY - DROŻDŻE

Rozmnażanie-
•pączkowanie -

rozmnażanie bezpłciowe.

podział komórki w wyniku którego powstają
dwie komórki potomne - większa i mniejsza,
która stopniowo powiększy swoją objętość

.

•niektóre drożdże (np. Candida
albicans), wytwarzają przetrwalniki
(spory )
•rozmnażanie płciowe w wyniku
którego może dojść do wymiany
materiału genetycznego między
osobnikami biorącymi udział w
procesie płciowym. Podczas
rozmnażania płciowego dochodzi
do fuzji.

Cryptococcus neoformans

Saccharomyces cerevisiae

zdjęcie niedostępne w wersji internetowej

zdjęcie niedostępne w wersji internetowej

Penicilium chrysogenum, Cephalosporium acremonium, Paecilomyces varioti

GRZYBY

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus

Ashbya gossypi, Claviceps purpurea, Giberella fujikuroi

Saccharomyces cerevisiae

Candida utilis

Trichoderma wentili, T. viride, T. reesei

antybiotyki: penicylina G, cefalosporyna C, wariotyna

preparaty enzymatyczne, antybiotyki, kwas cytrynowy

witaminy

etanol i inne napoje alkoholowe

białkowe preparaty paszowe

preparaty enzymatyczne

Otrzymywanie szczepów przemysłowych

źródła mikroorganizmów przemysłowych:
środowisko naturalne oraz kolekcje czystych kultur

kolekcje czystych kultur w Polsce:
Światowa Federacja Kolekcji Kultur (WFCC):

• Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego
• Wydział Chemii i Technologii Żywności Politechniki Łódzkiej
• Akademia Techniczno-Ekonomiczna we Wrocławiu

ponadto:

• SGGW AR
• Instytut Przem. Mleczarskiego w Warszawie
• UAM
• UJ

przechowywanie szczepów przemysłowych:
•w obniżonej temperaturze

na agarze w -20

o

C, - 5

o

C (do 6 miesięcy)

w ciekłym azocie, -196

o

C w 10% wodnym roztworze glicerolu (kilka miesięcy)

•w formie bezwodnej

suszenie w 24

o

C na agarze lub piasku (okres przechowywania - kilka lat)

liofilizacja (suszenie próżniowe kultury wraz z pożywką) (wiele lat)

IZOLACJA

Otrzymywanie szczepów przemysłowych

etapy:
•wybór miejsca i pobranie próbek mikroorganizmów
•wstępna obróbka próbek
•namnażanie drobnoustrojów i selekcja czystych kultur
•testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do określonych zadań

KRYTERIA UWZGLĘDNIANE PRZY WYBORZE MIKROORGANIZMU:

• charakterystyka odżywiania

(tanie media, dostosowanie do określonego substratu)

• optimum temperatury

(najlepiej wyższa od 40

o

C - mniejsze koszty chłodzenia, eliminacja ryzyka zakażenia)

• zdolności do wzrostu w warunkach przemysłowych

odporność na typ procesu i stosowane materiały

• stabilność cech i odporność na manipulacje genetyczne
• produkcyjność

(wydajność procesu substrat

produkt na jednostkę czasu)

• łatwość wydzielenia produktu z medium pofermentacyjnego
• brak toksycznych produktów metabolizmu

IZOLACJA

Otrzymywanie szczepów przemysłowych

cechy mikroorganizmów ułatwiające prowadzenie procesów

technologicznych:
• odporność na infekcje
• brak własności pieniących
• odporność na niektóre składniki pochodzenia naturalnego
• odporność na niskie stężenie rozpuszczonego tlenu (dla organizmów

aerobowych)

• testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do określonych zadań

Otrzymywanie szczepów przemysłowych

WZBOGACAJĄCA HODOWLA W ROZTWORZE

faworyzowanie pożądanych kultur przez stworzenie warunków wzrostu bardziej korzystnych dla

pożądanego mikroorganizmu

• dodawanie substratów promocyjnych lub inhibitorów

mleczan sodowy dla bakterii propionowych
4% etanol dla bakterii kwasu octowego (Acetobacter) hamuje wzrost innych bakterii
dodatek antybiotyków selektywnie niszczących bakterie niepożądane

• tworzenie warunków korzystnych dla jednego typu bakterii przez zmianę
temperatury hodowli
• wielokrotne przesiewanie na świeże podłoża

IZOLACJA

ZASTOSOWANIE POŻYWEK STAŁYCH
stosowanie pożywki preferującej enzym występujący w pożądanym
mikroorganizmie

ROZPROSZENIE HODOWANYCH DROBNOUSTROJÓW DO MONOKULTUR

Techniki wzrostowe preferują mikroorganizmy szybkorosnące

Ulepszanie szczepów przemysłowych

Zwiększanie wydajności (produkcyjności) wybranego mikroorganizmu

•optymalizacja składu pożywki
•optymalizacja warunków hodowli
•wywoływanie mutacji i manipulacje genetyczne
•selekcja mutantów

mutacje spontaniczne - raz na 10

5

PUNKTOWA
-dotyczy pojedynczych nukleotydów
-zmienia tryplet kodujący AA lub
tryplet nonsensowny (niekodujący)

GENOMU
-obejmują większą liczbę
nukleotydów
-przemieszczenie odcinka
DNA lub inwersja
(odwrócenie kolejności)

MUTACJA

Ulepszanie szczepów przemysłowych

czynniki przyspieszające mutacje (mutagenne):
promieniowanie UV(najczęściej 100-300 nm), X,
gamma

zalety metody UV:
dostępność, prostota, łatwość, powtarzalność, duża częstotliwość mutowania,
możliwość uzyskania wszystkich typów mutacji,
wywoływanie mutacji zarówno w komórkach wegetatywnych jak i spoczynkowych.

etap 1. WYWOŁYWANIE MUTACJI INDUKOWANEJ

mutacje spontaniczne - raz na 10

5

substancje mutagenne

HNO

2

, powoduje oksydatywną dezaminację, zmienia specyficzność tworzenia par

NH

2

OH, działa na pirymidyny, głównie cytozynę

N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna, tlenki etylenu, epoksydy, 5-aminoakrydyna

ok. 90% wszystkich zmian to
dimeryzacja pirymidyn,
głównie tyminy

Ulepszanie szczepów przemysłowych

1. pożywka maksymalna - dostarczone są wszystkie składniki

2. metoda prób i eliminacji poszczególnych składników pokarmowych

(tzw. podłoża zdefiniowane, np. zawierające proste źródło węgla)

etap 2. SELEKCJA MUTANTÓW

gdy nie wiadomo, jakie wymagania pokarmowe mają zmutowane organizmy:

inkubacja w cieplarce
przenoszenie na nową płytkę

hodowle ze wskaźnikami chemicznymi i mikrobiologicznymi

np. wykrywanie enzymów
amylolitycznych podczas reakcji z I

2

dodawanie indykatorów pH w celu
wykrycia kwasó i zasad w
metabolitach

np. stosowanie drobnoustrojów
testowych w celu wykrycia czy
mutanty produkują antybiotyki

Ulepszanie szczepów przemysłowych

ADAPTACJA MIKROORGANIZMÓW

grupa
amino
kwasowa

enzym

metabolit

substrat

metabolit

akty

wac

ja

rep

res

ja

regulacja genetyczno - metaboliczna

substrat

A

1

A

2

aktywacja wsteczna

aktywacja

substrat

A

A

2

inhibicja

• wydzielanie poza komórkę enzymu
kontrolującego drogę asymilacji

• powstrzymanie produkcji końcowego
produktu kontrolującego drogę asymilacji

• eliminacja mechanizmu
rozpoznającego obecność inhibitora

modyfikacja organizmu, aby mechanizmy
kontroli wytwarzania metabolitów nie hamowały
produkcji zbyt wcześnie:

Polepszanie cech szczepów innych niż produkcyjność
• wzmacnianie odporności szczepów na infekcje
• tworzenie szczepów o słabych własnościach pieniących
• tworzenie szczepów odpornych na inne substraty
• polepszanie form morfologicznych szczepów

(cechy technologiczne np. podatność

na mieszanie, filtrację)

Media hodowlane

POŻYWKA

węgiel

ENERGIA

azot

tlen

składniki mineralne
P, S, K, Na, Ca, Mg, Fe

promotory wzrostu,
prekursory metabolitów

bufory, środki antypieniące

WODA

media w hodowli
przemysłowej muszą być
• tanie
• dostępne przez cały rok

maksymalizacja:
• wydajności produktu względem substratu,
• stężenia produktu
• szybkości wytwarzania produktu

minimalizacja:
• wytwarzania produktów ubocznych
• trudności technologicznych

(mieszania,

napowietrzania, oczyszczania)

Media hodowlane

WODA

podstawowy składnik w każdej hodowli
skład mineralny wody

(różne wymagania do różnych celów -np. browarnictwo, technologie farmaceutyczne)

dostępność w dużej ilości

ŹRÓDŁA WĘGLA

- węglowodany

skrobia

(kukurydza, ziemniaki, zboża) - hydroliza kwaśna lub enzymatyczna

sacharoza i cukry proste

zawarte w melasie (produkt uboczny w przem. cukrowniczym)

laktoza

zawarta w serwatce (produkt uboczny w mleczarstwie)

inne źródła węgla

alkohole, proste kwasy organiczne, metan,

koszty surowca to 50-70% kosztów eksploatacyjnych

czasem surowiec jest określony normami prawnymi i technicznymi
(wytwarzanie piwa, wina, napojów mlecznych)

Media hodowlane

ŹRÓDŁA AZOTU

azot nieorganiczny

sole amonowe

azot organiczny

mączka sojowa
ziarno sojowe
namok kukurydziany
hydrolizat kazeiny
mączka rybna
hydrolizat drożdży
wywar gorzelniany

zużywanie NH

4

+

zakwasza środowisko

zużywanie NO

3

-

alkalizuje środowisko

z NH

4

NO

3

najpierw przyswajane są NH

4

+

potem NO

3

-

reduktaza zotanowa (redukuje NO

3

-

NH

4

+

) jest represjonowana przez NH

4

+

ŹRÓDŁA TLENU

POWIETRZE

(dla organizmów aerobowych)

gdy stosowane są czyste kultury powietrze musi być wyjałowione (filtrowanie,
ogrzewanie, naświetlanie UV)

Media hodowlane

ŹRÓDŁA SKŁADNIKÓW MINERALNYCH

najistotniejsze

P, Mg, Mg, K, S, Ca, Cl

inne: Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn występują jako domieszki śladowe w
wystarczających ilościach

WITAMINY:

tiamina, kwas nikotynowy, kwas pantotenowy, pirydoksyna,

biotyna, ryboflawina
zawarte są w mące sojowej, ekstrakcie drożdżowymm wywarze gorzelnianym,
melasie

typowe stężenia soli mineralnych
składnik

g/dm

3

KH

2

PO

4

1-4

MgSO

4

0,25-0,3

KCl

0,5-12

CaCO

3

5-17

FeSO

4

0,01-0,1

ZnSO

4

0,1-1

MnSO

4

0,01-0,1

CuSO

4

0,003-0,01

Na

2

MoO

4

0,01-0,1

Media hodowlane

INNE SKŁADNIKI AKTYWNE

induktory, prekursory, inhibitory

np.
•kwas fenylooctowy w procesie produkcji penicyliny
•Na

3

SO

3

wiążący CH

3

CHO podczas wytwarzania gliceryny

•przy wytwarzaniu kwasu cytrynowegometale alkaliczne, fosforany i
niskie pH hamuja wytwarzanie kw. szczawiowego

ŚRODKI ANTYPIENIĄCE

•alkohole długołańcuchowe
•estry
•kwasy tłuszczowe i ich pochodne
•silikony
•inne związki, np. glikole

piana -powoduje
flotację mikroorganizmów,
wyrzucanie płynu z reaktora

środki przeciwpieniące mogą utrudniać wnikanie tlenu do płynu hodowlanego