Ilościowe oznaczanie białek
Zagadnienia do opracowania:
1. Stężenie roztworów: procentowe, molowe, przeliczanie stężeń.
2. Siła jonowa, pojemność, pH buforów.
3. Prawo Lamberta-Beera, molowy współczynnik ekstynkcji, własności spektralne aminokwasów aromatycznych.
4. Podstawowe informacje na temat budowy i właściwości aminokwasów i białek: właściwości chemiczne
aminokwasów, struktury rzędowe białek, podział i funkcje białek, właściwości BSA.
5. Metody ilościowego oznaczania białka oraz ograniczenia w ich stosowaniu.
Cel ćwiczenia:
Oznaczanie ilościowe białek ma na celu określenie stężenia badanego białka w próbce. Istnieje wiele metod
ilościowego oznaczania białek i peptydów. Najczęściej stosowane metody kolorymetrycznego oznaczania
zawartości białka w roztworze to:
pomiar absorbancji w nadfiolecie,
metoda Lowry’ego,
metoda Bradforda,
metoda BCA.
Każda z tych metoda ma zalety, jak również pewne ograniczenia. Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z każdą
z tych technik, jak również nabycie umiejętności dostosowania wybranej metody ilościowego oznaczania białek
w zależności od pochodzenia i zawartości badanej próbki.
1. Pomiar absorbancji w nadfiolecie
Większość białek dzięki obecności tyrozyny i tryptofanu wykazuje maksimum absorbancji dla 280 nm. Inny
aminokwas aromatyczny - fenyloalanina ma maksimum absorbancji przy 260 nm. Pomiar absorbancji jest
możliwy dzięki wykorzystaniu spektrofotometru i odpowiedniej analizie uzyskanych danych pomiarowych.
Materiały:
1. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie:
1. Ustawić spektrofotometr na 280 nm
2. Wyzerować spektrofotometr stosując kuwetę kwarcową zawierającą wodę destylowaną
3. Zmierzyć absorbancję badanej próbki dla 280 nm
4. Ustawić spektrofotometr na 260 nm
5. Wyzerować spektrofotometr stosując kuwetę zawierającą wodę destylowaną
6. Zmierzyć absorbancję badanej próbki dla 260 nm
Opracowanie wyników:
Stężenie białka w mg/ml oblicza się ze wzoru:
c
białka
= (1,55 × A
280nm
) – (0,76 × A
260nm
)
2. Metoda Lowry’ego
Metoda Lowry’ego oznaczania białka wykorzystuje czułą reakcję, która jest mieszaniną dwóch reakcji:
1) Reakcja aminokwasów z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (kwas fosforomolibdenowy). Reakcji ulega tyrozyna,
tryptofan, cysteina i prawdopodobnie histydyna występujące w białkach. Grupy boczne tych aminokwasów są
zdolne do redukcji jonów Mo i W występujących w odczynniku Folina-Ciocalteu na +VI stopniu utlenienia
do niższych tlenków.
2) Reakcja pomiędzy wiązaniami peptydowymi a jonem Cu
2+
w środowisku alkalicznym (reakcja biuretowa). Jony
miedzi ponadto biorą udział również w procesie redukcji odczynnika Folina, przez co zwiększa się czułość
oznaczenia spektrofotometrycznego.
Absorbancję powstałego barwnego (niebieskiego) produktu reakcji odczytuje się przy 750 nm.
Redukcja kwasu fosforomolibdenowego do tlenków molibdenowych zachodzi szybko w środowisku o pH 10.
Jednak przy tym pH kwas fosforomolibdenowy jest nietrwały i łatwo ulega hydrolizie do kwasu
ortofosforowego(V) i molibdenowego. Należy zatem po dodaniu odczynnika Folina-Ciocalteu natychmiast
dokładnie zmieszać badany roztwór.
Materiały:
1. Roztwór 1 mg/ml albuminy surowicy wołowej (BSA)
2. Odczynnik Lowry’ego reagent A (NaOH, Na
2
CO
3
, winian sodu, SDS)
3. Odczynnik Lowry’ego reagent B (CuSO
4
)
4. Odczynnik Folina-Ciocalteu (Na
2
WO
4
, Na
2
MoO
4
, H
3
PO
4
, HCl)
5. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie oznaczenia:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do wykonania krzywej kalibracyjnej,
o stężeniach: 1 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml, 100 μg/ml.
2. 500 μl każdego roztworu rozcieńczonego białka oraz badanej próbki pobrać do dużych kuwet, do jednej
kuwety dodać 500 μl wody jako roztwór referencyjny.
3. Do każdej kuwety dodać 2,5 ml przygotowanego bezpośrednio przed pomiarem odczynnika Lowry’ego (18 ml
odczynnika A zmieszać z 180 μl odczynnika B), kuwety zatkać przy pomocy korków, zamieszać ich zawartość
i odczekać 10 min.
4. Do każdej kuwety dodać 250 μl odczynnika Folina-Ciocalteu, zamieszać i odczekać 10 min.
5. Wykonać pomiar absorbancji dla 750 nm i wykreślić krzywą kalibracyjną.
6. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie badanej próbki.
3. Metoda Bradforda
W metodzie tej wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika Coomassie Brillant Blue G-250 (CBB-G250)
z grupami aminowymi białek za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie reagują reszty
Arg, w minimalnym stopniu reszty His, Lys, Tyr, Trp i Phe. CBB w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie,
które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana maksimum pochłaniania światła z 465
na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w badanym roztworze.
Materiały:
1. Roztwór 1 mg/ml albuminy surowicy wołowej (BSA)
2. Odczynnik Bradforda
3. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie oznaczenia:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do wykonania krzywej kalibracyjnej,
o stężeniach: 1 μg/ml; 2,5 μg/ml; 5 μg/ml; 7,5 μg/ml; 10 μg/ml.
2. 500 μl każdego roztworu rozcieńczonego białka, badanej próbki po 10-krotnym rozcieńczeniu oraz wody
destylowanej dla próby referencyjnej pobrać do małych kuwet.
3. Do każdej kuwety dodać 500 μl odczynnika Bradforda, zatkać kuwety korkami, zamieszać i odczekać 5 min.
4. Wykonać pomiar absorbancji dla 595 nm i wykreślić krzywą kalibracyjną.
5. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie badanej próbki.
4. Metoda BCA (metoda z kwasem bis-cynchoninowym)
Jest to modyfikacja metody biuretowej oznaczania białka. W środowisku alkalicznym aminokwasy budujące
białka, takie jak Tyr, Trp, Cys redukują jony Cu
2+
do jonów Cu
+
, które z kolei tworzą barwny kompleks z kwasem
bis-cynchinonowym (BCA). Absorbancję barwnego kompleksu mierzy się dla długości fali równej 562 nm.
Materiały:
1. Roztwór 1 mg/ml albuminy surowicy wołowej (BSA)
2. Odczynnik BCA reagent A (BCA, Na
2
CO
3
, winian sodu, NaOH, NaHCO
3
, pH 11,25)
3. Odczynnik BCA reagent B (CuSO
4
)
4. Roztwór białka o nieznanym stężeniu
Wykonanie oznaczenia:
1. Z wyjściowego roztworu 1 mg/ml BSA przygotować serię rozcieńczeń do wykonania krzywej kalibracyjnej,
o stężeniach: 1 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml, 100 μg/ml.
2. 50 μl każdego roztworu rozcieńczonego białka, badanej próbki oraz wody dla próby referencyjnej, pobrać
do probówek typu Eppendorf.
3. Do każdej probówki dodać 1 ml odczynnika BCA (7 ml odczynnika A zmieszać z 140 μl odczynnika B). Próbki
inkubować 15 min. w 60
0
C w termomikserze, a następnie po ostudzeniu przenieść do małych kuwet.
4. Wykonać pomiar absorbancji dla 562 nm i wykreślić krzywą kalibracyjną.
5. Wykonać pomiar absorbancji nieznanej próbki. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie białka w badanej
próbce.