322

www.postepybiochemii.pl

Agnieszka Olejnik-Schmidt

*

Agnieszka Gronowalska
Marcin Schmidt

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii

Żywności, Wydział Nauk o Żywności i

Żywieniu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poz-

naniu

*

Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii

Żywności, Wydział Nauk o Żywności i

Żywieniu, Uniwersytet Przyrodniczy w

Poznaniu, ul. Wojska Polskiego 48, 60-627

Poznań; tel.: (61) 84 66 024, e-mail: agao@

up.poznan.pl,

Artykuł otrzymano 26 czerwca 2013 r.

Artykuł zaakceptowano 2 lipca 2013 r.

Słowa kluczowe: heterologiczna ekspresja ge-

nów, GRAS, L. lactis, nizyna, system NICE

Wykaz skrótów: GRAS (ang. Generally Regar-

ded As Safe) — uznawany za bezpieczny; MIC

(ang. Minimal Inhibitory Concentration) — mini-

malne stężenie hamujące wzrost; NICE (ang.

NIsin Controlled gene Expression system) — nizy-

nowy system ekspresyjny; RBS (ang. ribosome

binding site) — miejsce wiązania rybosomu

Podziękowania: Praca powstała w trak-

cie realizacji projektu badawczego MNiSW

NN312 323935.

Charakterystyka systemu nizynowego jako narzędzia do produkcji

białek i peptydów w komórkach

Lactococcus lactis

StreSzczenie

r

ozwój technologii badawczych umożliwia zastosowanie coraz to większej liczby

szczepów bakterii do ekspresji rekombinowanych białek. W tym celu wykorzysty-

wane są także bakterie fermentacji mlekowej (LAB). Nizynowy system ekspresyjny jest

narzędziem molekularnym umożliwiającym ekspresję białek w komórkach paciorkow-

ców mlekowych

Lactococcus lactis. Szczepy tego gatunku wykorzystywane są szeroko

w przemyśle mleczarskim i od lat spożywane były przez człowieka wraz z żywnością

fermentowaną. Bakterie te posiadają cechy, które predysponują je jako gospodarza do

produkcji rekombinowanych białek; są to m.in.: niewielkie wymagania względem wa-

runków hodowli i poznane warunki skalowania hodowli, brak syntezy endotoksyn oraz

formowania agregatów wewnątrzkomórkowych z naprodukowanego białka, ściśle re-

gulowana ekspresja pozwalająca na produkcję białek toksycznych względem komórek

bakteryjnych. System nizynowy składa się z gospodarza (komórek bakteryjnych), wek-

tora plazmidowego oraz induktora - nizyny potrzebnej do kontrolowanej syntezy białka.

System ten z powodzeniem został zastosowany do syntezy heterologicznych peptydów

antymikrobiologicznych, produkcji eukariotycznych i prokariotycznych białek błono-

wych, syntezy białek stosowanych przy farmakologicznej produkcji szczepionek oraz w

inżynierii metabolicznej.

WprOWAdzenie

Poznanie budowy operonu nizynowego i autoregulacyjnego mechani-

zmu syntezy nizyny umożliwiło opracowanie systemu do podukcji białek

nazwanego systemem nizynowym, w komórkach paciorkowca mlekowego

(Lactococcus lactis). System ten wykazuje wiele cech, które czynią go atrakcyj-

ną alternatywą wobec powszechnie stosowanych systemów ekspresyjnych w

bakteriach pałeczki okrężnicy (E. coli), szczególnie z uwagi na brak produkcji

endotoksyn — lipopolisacharydów. Gatunek Lactococcus lactis należy do typu

Firmicutes, bakterie te to Gram-dodatnie nieruchliwe ziarniaki, nie wytwarza-

jące przetrwalników, względnie beztlenowe i prowadzące homofermentację

mlekową. Za naturalne środowisko przedstawicieli tego gatunku uważa się

rośliny zielone, choć znane są one głównie z zastosowania w przemyśle mle-

czarskim jako składnika szczepionek do produkcji serów, maślanki, kwaśnej

śmietany i kefiru [1]. Bakterie te posiadają status GRAS [2], a ich genetyka i

fizjologia zostały bardzo dobrze poznane [3].

chArAkteryStykA nizyny

Nizyna jest peptydem produkowanym przez wybrane szczepy Lactococcus

lactis. Należy ona do I klasy bakteriocyn, peptydów o charakterze bakterio-

bójczym. Peptyd ten dopuszczony jest do obrotu jako biokonserwant żyw-

ności [4] i stosowany w postaci komercyjne dostępnego preparatu Nisaplin

®

.

Obecnie stosowany jest w 50 krajach. Długa historia zastosowania oraz bez-

pieczeństwo dla konsumenta spowodowały, że nizyna należy do najczęściej

komercyjnie używanych bakteriocyn [5].

BUDOWA NIZyNy

Nizyna syntetyzowana jest w postaci peptydu prekursorowego. Prenizy-

na, będąca strukturalnym prekursorem nizyny, zbudowana jest z dwudzies-

tu trzech aminokwasów tworzących peptyd liderowy oraz trzydziestu czter-

ech aminokwasów stanowiących po licznych modyfikacjach dojrzałą nizynę.

Peptyd ten ulega obróbce potranslacyjnej. Wśród modyfikowanych aminok-

wasów pojawiają się rzadko spotykane dehydrobutyryna, dehydroalanina,

lantionina i β-metylolantionina. Poza nietypowymi aminokwasami nizyna

charakteryzuje się występowaniem w jej budowie pięciu pierścieni struk-

turalnych. Istnieją trzy naturalne warianty nizyny u Lactococcus lactis: nizyna

A, nizyna Q oraz nizyna Z. Wersje A i Z różnią się od siebie pojedynczym

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

323

aminokwasem w pozycji dwudziestej siódmej. W nizynie

A występuje w tym miejscu reszta histydyny, natomiast

w nizynie Z — reszta glutaminy. Nizyna Q różni się resz-

tami aminokwasowymi w pozycjach 8 i 2 w peptydzie

liderowym oraz pozycjach 15, 21, 27 i 30 propeptydu [6,7].

REGUlACjA BIOSyNtEZy NIZyNy

Biosynteza nizyny podlega autoregulacji. Operon ni-

zynowy składa się z 11 genów nisABTCIPRKFEG (Ryc. 1).

Sekwencja nisA jest genem strukturalnym i koduje nizy-

nę. Klaster nizynowy zawiera trzy promotory: silny pro-

motor P

nisA

, oraz słabe P

nisF

i P

nisR

. Promotor P

nisR

jest kon-

stytutywny, natomiast promotory P

nisA

i P

nisF

aktywowane

są obecnością nizyny w podłożu hodowlanym. Nizyna

syntetyzowana jest na rybosomach jako peptyd prekurso-

rowy zawierający peptyd liderowy. W dojrzewaniu nizy-

ny bierze udział dehydrataza NisB, która po oddziaływa-

niu z peptydem liderowym dehydratuje reszty treoniny

i seryny w prenizynie, do odpowiednio, dehydroalaniny

oraz dehydrobutyryny.

Następnie, na skutek działania NisC, pięć zdehydraty-

zowanych jednostek bierze udział w cyklizacji poprzez

sparowanie z resztą cysteiny. Rezultatem jest utworze-

nie charakterystycznej struktury zwanej pierścieniami

β-metylolantioninowymi. transport przekształcanej mo-

lekuły poprzez błonę komórkową odbywa się w wyniku

działania białka transportującego NisT, który jest pompą

typu ABC wykorzystującą energię hydrolizy AtP. Dele-

cja bądź zakłócenia w działaniu nisT redukują zewnątrz-

komórkowe wydzielanie nizyny. transportery ABC od-

powiedzialne za wydzielanie określonych antybiotyków

są najczęściej dedykowane do transportu specyficznego

dla siebie polipeptydu. transporter NisT w odróżnieniu

od innych posiada bardzo szeroki zakres specyficzności.

Może transportować nie tylko całkowicie zmodyfikowa-

ną i dojrzałą nizynę, ale również częściowo i w pełni nie-

zmodyfikowaną jej formę. Gen nisP koduje subtylizynę

odpowiedzialną za zewnątrzkomórkową proteolityczną

aktywację nizyny i jest odpowiedzialna za odłączanie

peptydu liderowego od końca aminowego prenizyny.

Peptyd liderowy powoduje, że prenizyna jest nieaktyw-

na. Krótko po przetransportowaniu lub jeszcze w trak-

cie transportu prekursora nizyny, peptyd liderowy jest

usuwany przez subtylizynę, a prenizyna przekształca się

w dojrzałą postać nizyny. Aktywna nizyna jest zdolna do

indukowania systemu, który reguluje jej biosyntezę [7-

9]. Przy autoregulacji procesu syntezy nizyna indukuje

transkrypcję genów operonu nizynowego poprzez dwu-

składnikowy system regulujący — NisRK. Białko NisK

jest kinazą histydynową umiejscowioną w błonie cytopla-

zmatycznej i działa jako receptor dla całkowicie dojrzałej

nizyny. Natomiast NisR jest regulatorem odpowiedzi o

charakterze czynnika transkrypcyjnego. Kiedy nizyna

przyłącza się do N-terminalnej domeny zewnątrzkomór-

kowej NisK następuje autofosforylacja histydyny w do-

menie cytoplazmatycznej tego receptora. Grupa fosfora-

nowa przenoszona jest na asparaginian białka NisR, co

uruchamia wiązanie się regulatora odpowiedzi do pro-

motorów P

nisA

i P

nisF

. Nizyna funkcjonuje jako peptydowy

feromon. Mutanty nizyny oraz modyfikowana prenizyna

mogą działać również jako induktory transkrypcji ge-

nów. Bakterie Lactococcus lactis syntetyzujące nizynę mają

rozwiniętą oporność przeciwko bakteriobójczej aktywno-

ści tego peptydu. Oporność ta jest osiągana dzięki dwóm

różnym systemom: NisFEG, który jest transporterem ABC

oraz lipoproteinie NisI [6,8-11].

kOnStrukcjA SySteMu nice

Badania nad nizyną pod względem struktury i

funkcji oraz nad klastrem genów nisABTCIPRKFEG

zaangażowanych w autoregulację biosyntezy nizyny

umożliwiły budowę nizynowego systemu ekspresyjne-

go (NICE). System ten opracował w 1996 roku Pascalle

de Ryter (NIZO Food Research, Holandia). Przeniósł on

promotor P

nisA

do wektora plazmidowego oraz skonstru-

ował szczep gospodarza Lactococcus lactis poprzez wpro-

wadzenie do chromosomu szczepu nie posiadającego

operonu nizinowego genów nisR i nisK. W laboratoriach

badawczych NIZO opracowano szereg szczepów i kom-

patybilnych z nimi wektorów, z których produkcja białka

indukowana jest nizyną. System nizynowy jest obecnie

komercyjnie dostępny pod anglojęzyczną nazwą NICE

Expression System for Lactococcus lactis. W jego skład

wchodzi szczep gospodarza, kompatybilny wektor pla-

zmidowy oraz induktor — nizyna potrzebny dla kontro-

lowanej syntezy białka [12].

Rycina 1. Schemat przedstawiający biosyntezę nizyny oraz regulację tego proce-

su u szczepów Lactococcus lactis. Operon nizynowy (nisAZBTCIPRKFEG) koduje

m.in. nizynę powstającą w formie peptydu prekursorowego (l-NisAZ), która

podlega sekrecji (1) przez produkty NisBCTP, w trakcie której dochodzi do od-

cięcia peptydu liderowego (l). Dojrzała nizyna (NisAZ) może wykazywać funk-

cję przeciwbakteryjną (2) lub sygnalną (3). Sygnał odbierany jest przez receptor

o aktywności kinazy histydynowej (NisK), która przekazuje go (4) na regulator

transkrypcji (NisR) aktywujący ekspresję z promotorów (p) operonu nizynowego

(5). Część produktów operonu nizynowego (NisIFEG) odpowiedzialna jest za od-

porność komórki na przeciwbakteryjne działanie nizyny.

324

www.postepybiochemii.pl

GOSpOdArze

Gospodarzami dla systemu nizynowego są bakterie

Gram-dodatnie. Wśród nich wymienić można bakterie

z rodzajów: Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus, Leuconos-

toc. Najważniejszymi i najchętniej używanymi są szcz-

epy bakterii fermentacji mlekowej (lAB), a zwłaszcza

Lactococcus lactis. Mikroorganizmy z gatunku Lactococcus

lactis są łatwe w hodowli. Dobrze poznane są genetyka

tych bakterii, sposoby wprowadzania DNA do komó-

rek oraz warunki powiększania skali hodowli. Szczepy

bakteryjne wykorzystywane do heterologicznej ekspresji

mogą być zdolne do samodzielnej produkcji nizyny lub

też pozbawione zdolności do syntezy tego peptydu. De-

lecja 4 par zasad w genie nisA może spowodować zaham-

owanie wytwarzania nizyny. W przypadku szczepów nie

produkujących nizyny indukcja ekspresji genów może

być osiągnięta przez dodatek nizyny do pożywki w loga-

rytmicznej fazie wzrostu bakterii.

Skuteczność indukcji syntezy heterologicznego białka

przez szczepy nie wytwarzające nizyny, ale zawierające

zintegrowane geny nisRK (indukcja kontrolowana) jest

większa od szczepów syntetyzujących nizynę. Dzieje

się tak z powodu obecności białka NisI u szczepów

produkujących nizynę. Białko to wiąże część cząsteczek

nizyny zawartych w pożywce hodowlanej. Podob-

ny efekt występuje w przypadku drugiego systemu

opornościowego — NisFEG. Szczepy produkujące nizynę

zachowują jednak zdolność do autoindukcji syntezy nizy-

ny stąd są gospodarzami produkującymi tę bakteriocynę

i samoindukującymi ekspresję genów heterologicznych

(ciągła indukcja) [7,13].

WektoRy PLAzmidoWe

Plazmidy wykorzystywane w systemie nizynowym są

transkrypcyjnymi lub translacyjnymi wektorami fuzyj-

nymi. Zasadniczymi elementami wektora plazmidowe-

go są promotor P

nisA

oraz polilinker. Przy fuzjach geno-

wych transkrypcyjnych gen przeznaczony do ekspresji

musi zostać tak zaprojektowany, aby posiadał własną

sekwencję kodującą miejsce wiązania rybosomu (RBS).

Gen bądź geny przeznaczone do ekspresji muszą także

posiadać własny kodon starto-

wy [11]. Przy fuzjach genowych

translacyjnych gen przeznaczony

do ekspresji jest zaprojektowany

tak, aby zawierał miejsce restryk-

cyjne rozpoznawane przez enzy-

my restrykcyjne NdeI (CAtAtG)

lub NcoI (CCAtGG) zawierające

kodon startowy. Umożliwia to

wprowadzenie insertu genowego

tabela 1. Szczepy L. lactis będące gospodarzami w nizynowym systemie ekspresyjnym [11].

Szczep L. lactis

Charakterystyka

NZ9700

szczep powstały w wyniku koniugacji pomiędzy dwoma producentami nizyny: szczepem NIZO B8 oraz MG1614

NZ9800

szczep niezdolny do syntezy nizyny, oporny na jej działanie

NZ 9000

szczep obecnie najczęściej używany jako gospodarz; geny nisK i nisR są zintegrowane w genie pepN szczepu MG1363

NZ3900

gospodarz używany w przemyśle spożywczym; selekcja transformantów oparta na zdolności do wzrostu na laktozie

NZ3000

w szczepie wprowadzono delecję genu lacF; szczep nie jest zdolny do wzrostu na laktozie; wzrost

na laktozie może zostać osiągnięty po wprowadzeniu genu lacF na plazmidzie

NZ9000 htrA

szczep NZ9000 pozbawiony genu htrA w wyniku delecji; gospodarz dedykowany do syntezy białek wydzielanych do podłoża

FI7847

szczep z delecją w genie nisA

tabela 2. Najczęściej stosowane wektory plazmidowe w nizynowym systemie ekspresyjnym [11].

Nazwa wektora

Charakterystyka

pNZ123

wektor wysokopopijnyz genami replikacyjnymi z L. lactis, genem CAT oraz polilinkerem do fuzji transkrypcyjnych

pNZ8020

wektor do stosowania z różnymi gatunkami komórek gospodarza. Zawiera gen oporności na

chloramfenikol (cat), promotor P

nisA

oraz polilinkerem do fuzji transkrypcyjnych

pNZ8037

wektor do stosowania z różnymi gatunkami komórek gospodarza. Wektor z genem oporności na

chloramfenikom (cat), promotorem P

nisA

i polilinker z miejscem NcoI do fuzji translacyjnych

pNZ8048

stworzony na bazie wektora pNZ8037 dodatkowo z sekwencją terminacyjną za polilinkerem

pNZ8113

stworzony na bazie wektora pNZ8048 dodatkowo z sekwencją kodującą

His-tag (znacznik fuzyjny na C-końcu rekombinowanego białka)

pNZ9530

wektor niskokopijny z genami nisR i nisK oraz genem oporności na erytromycynę, używany do

kotransformacji wraz z wektorami serii pNZ8* do stosowania u gatunków innych niż Lactococcus lactis

pNZ9520

wektor wysokokopijny z genami nisR i nisK oraz genem oporności na erytromycynę, używany do

kotransformacji wraz z wektorami serii pNZ8* do stosowania u gatunków innych niż Lactococcus lactis

*oznacza liczby od 0–9

tabela 3. Wykorzystanie nizynowego systemu ekspresyjnego do produkcji szczepionek.

Rodzaj białka

Pochodzenie rekombinowanego białka

Piśmiennictwo

Antygeny bakteryjne

antygen l7/12 Brucella abortus

[23]

podjednostka c toksyny ttFC Clostridium tetani

[24]

Antygeny wirusowe

białko niestrukturalne 4 NSP4 rotawirusa bydlęcego

[25]

epitop BCV bydlęcego koronawirusa

[26]

białko E7 ludzkiego wirusa brodawczaka typu 16

[27]

białko VP60 wirusa Norwalk

[28]

Postępy Biochemii 59 (3) 2013

325

w ramkę odczytu zawierającą sekwencję kodującą miej-

sce wiązania rybosomu [11,12].

induktOry ekSpreSji

Indukcja ekspresji zachodzi przy użyciu nizyny, jej

analogów bądź też przy użyciu supernatantu ze szcze-

pów produkujących nizynę, np. L. lactis NZ9700. Ilość ni-

zyny potrzebnej do indukcji jest niższa niż wartość MIC

(minimalne stężenie hamujące) i oscyluje w przedziale od

0,01 do 10 ng/ml. takie wartości stężenia nizyny nie są w

stanie zahamować wzrostu mikroorganizmu gospodarza

nawet jeśli gospodarz pozbawiony jest systemów opor-

ności NisI lub NisFEG. W celu prawidłowego indukowa-

nia ekspresji genów induktory muszą zostać podane w

trakcie logarytmicznej fazy wzrostu. Poziom ekspresji

jest regulowany ilością nizyny użytej do indukcji [11].

zAStOSOWAniA

System nizynowy z wykorzystaniem L. lactis znalazł

zastosowanie między innymi przy syntezie białek homo-

logicznych i heterologicznych peptydów antymikrobio-

logicznych, syntezy białek błonowych [14,15], produkcji

białek wykorzystywanych w wytwarzaniu szczepionek

(tab. 3) czy w inżynierii metabolicznej. System ten wyko-

rzystywany jest do produkcji wielkoskalowej białek oraz

produkcji białek ulegających sekrecji do podłoża hodow-

lanego [16-18]. Na skalę przemysłową z wykorzystaniem

systemu nizynowego produkowane są między innymi

lizostafyna pochodząca ze Staphylococcus simulans biovar

Staphylolyticus [19], CoA ligaza z Arabidopsis thaliana [20]

oraz enzymy szlaku syntezy folianów [21,22].

pOdSuMOWAnie

System nizynowy jest wygodnym i łatwym w użyciu

narzędziem molekularnym pozwalającym na heterolo-

giczną syntezę biomolekuł zarówno do celów badaw-

czych jak i w produkcji wielkoskalowej.

PiśmieNNiCtWo

1. Ziarno M, Godlewska A (2008) Znaczenie i wykorzystanie bakterii ro-

dzaju Lactococcus w mleczarstwie. Med Wet 64: 35-39

2. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), Scientific opinion on

the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally ad-

ded to food and feed (2012 update). EFSA j 10: 3020

3. Bayjanov jR, Starrenburg Mj, van der Sijde MR, Siezen Rj, van Hijum

SA (2013) Genotype-phenotype matching analysis of 38 Lactococcus

lactis strains using random forest methods. BMC Microbiol 13: 68

4. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) (2006) Opinion of the

scientific panel on food additives, flavorings, processing aids and ma-

terials in contact with food on request from the commission related to

the use of nisin (E234) as food additive. EFSA j 314: 1-16

5. Hagiwara A, Imai N, Nakashima H, toda y, Kawabe M, Furukawa

F, Delves-Broughton j, yasuhara K, Hayashi SM (2010) A 90-day oral

toxicity study of nisin A, an anti-microbial peptide derived from Lacto-

coccus lactis subsp. lactis, in F344 rats. Food Chem toxicol 48: 2421-2428

6. lubelski j, Rink R, Khusainov R, Moll GN, Kuipers OP (2008) Biosyn-

thesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the

model lantibiotic nisin. Cell Mol life Sci 65: 455-476

7. Mierau I, Kleerebezem M (2005) 10 years of the nisin-controlled gene

expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Biotech-

nol 9: 1-13

8. Cheigh CI, Pyun yR (2005) Nisin biosynthesis and its properties. Bio-

technol lett 27: 1641-1648

9. Kuipers OP, Beerthuyzen MM, Siezen Rj, De Vos WM (1993) Charac-

terization of the nisin gene cluster nisABtCIPR of Lactococcus lactis.

Requirement of expression of the nisA and nisI genes for development

of immunity. Eur j Biochem 216: 281-291

10. de Ruyter PG, Kuipers OP, Beerthuyzen MM, van Alen-Boerrigter I,

de Vos WM (1996) Functional analysis of promoters in the nisin gene

cluster of Lactococcus lactis. j Bacteriol 178: 3434-3439

11. Zhou XX, li WF, Ma GX, Pan yj (2006) the nisin-controlled gene ex-

pression system: construction, application and improvements. Bio-

technol Adv 24: 285-295

12. de Ruyter PG, Kuipers OP, de Vos WM (1996) Controlled gene expres-

sion systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin.

Appl Environ Microbiol 62: 3662-3667

13. Zhou XX, Wang yB, Pan yj, li WF (2008) Nisin-controlled extracel-

lular production of apidaecin in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Bio-

technol 78: 947-953

14. Kunji ER, Slotboom Dj, Poolman B (2003) Lactococcus lactis as host for

overproduction of functional membrane proteins. Biochim Biophys

Acta 1610: 97-108

15. Monné M, Chan KW, Slotboom Dj, Kunji ER (2005) Functional expres-

sion of eukaryotic membrane proteins in Lactococcus lactis. Protein Sci

14: 3048-3056

16. Ravn P, Arnau j, Madsen SM, Vrang A, Israelsen H (2003) Optimiza-

tion of signal peptide SP310 for heterologous protein production in

Lactococcus lactis. Microbiology 149: 2193-2201

17. lv j, Huang C, Zhang X, tan S (2012) Extracellular secretion of anti-

coagulant peptide hirudin in Lactococcus lactis using SP310mut2 signal

peptide. Biotechnol lett 34: 61-65

18. Ng Dt, Sarkar CA (2011) Nisin-inducible secretion of a biologically ac-

tive single-chain insulin analog by Lactococcus lactis NZ9000. Biotech-

nol Bioeng 108: 1987-1996

19. Mierau I, leij P, van Swam I, Blommestein B, Floris E, Mond j, Smid Ej

(2005) Industrial-scale production and purification of a heterologous

protein in Lactococcus lactis using the nisin-controlled gene expression

system NICE: the case of lysostaphin. Microb Cell Fact 4: 15

20. Martínez-Cuesta MC, Gasson Mj, Narbad A (2005) Heterologous ex-

pression of the plant coumarate: CoA ligase in Lactococcus lactis. lett

Appl Microbiol 40: 44-49

21. Sybesma W, Van Den Born E, Starrenburg M, Mierau I, Kleerebezem

M, De Vos WM, Hugenholtz j (2003) Controlled modulation of folate

polyglutamyl tail length by metabolic engineering of Lactococcus lactis.

Appl Environ Microbiol 69: 7101-7107

22. Sybesma W, Starrenburg M, Kleerebezem M, Mierau I, de Vos WM,

Hugenholtz j (2003) Increased production of folate by metabolic en-

gineering of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 69: 3069-3076

23. Ribeiro lA, Azevedo V, le loir y, Oliveira SC, Dieye y, Piard jC,

Gruss A, langella P (2002) Production and targeting of the Brucella

abortus antigen l7/l12 in Lactococcus lactis: a first step towards food-

grade live vaccines against brucellosis. Appl Environ Microbiol 68:

910-916

24. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy M, Goudercourt D, turneer M,

Mercenier A 2(2002) Protection against tetanus toxin after intragastric

administration of two recombinant lactic acid bacteria: impact of strain

viability and in vivo persistence. Vaccine 20: 3304-3309

25. Enouf V, langella P, Commissaire j, Cohen j, Corthier G (2001) Bovine

rotavirus nonstructural protein 4 produced by Lactococcus lactis is anti-

genic and immunogenic. Appl Environ Microbiol 67: 1423-1428

26. langella P, le loir y (1999) Heterologous protein secretion in Lacto-

coccus lactis: a novel antigen delivery system. Braz j Med Biol Res 32:

191-198

27. Bermúdez-Humarán lG, Cortes-Perez NG, le loir y, Gruss A, Ro-

driguez-Padilla C, Saucedo-Cardenas O, langella P, Montes de Oca-

326

www.postepybiochemii.pl

the NiCe system as a tool for protein expression in

Lactococcus lactis

Agnieszka Olejnik-Schmidt

*

, Agnieszka Gronowalska, marcin Schmidt

Department of Biotechnology and Food Microbiology, Poznan University of life Sciences, 48 Wojska Polskiego St., 60-627 Poznań, Poland

*

e-mail: [e-mail]

key words: heterologous protein expression, GRAS microorganisms, L. lactis, nisin, NICE gene expression system

ABStRACt

the progress in genetic engineering allows to employ still growing number of bacterial strains for recombinant gene expression. Among them are

many lactic acid bacteria including

Lactococcus lactis which belongs to the most developed ones. those microorganisms are ideal for heterologous

protein expression because they can synthesize nisin which is a bacteriocin that can be used as an inductor factor. the recently developed NiCe

system is molecular tool that allows to produce heterolguos proteins in

Lactococcus lactis. the NiCe system needs three components for correct ope-

ration: host strain, plasmid and inductor factor — nisin. the NiCe system proved to be valuable tool for recombinant protein expression including

synthesis of heterologous antimicrobial peptides, membrane proteins, and vaccines development.

luna R (2003) Fusion to a carrier protein and a synthetic propeptide

enhances E7 HPV-16 production and secretion in Lactococcus lactis.

Biotechnol Prog 19: 1101-1104

28. Martín MC, Fernández M, Martin-Alonso jM, Parra F, Boga jA, Al-

varez MA (2004) Nisin-controlled expression of Norwalk virus VP60

protein in Lactobacillus casei. FEMS Microbiol lett 237: 385-391

PoLSkie toWARzyStWo BioCHemiCzNe

SkłAdki CzłoNkoWSkie W 2014 Roku

SZANOWNI PAŃStWO!

Przypominamy, że składki członkowskie za 2014 r. powinny być opłacone do 31 marca. Wysokość składki wynosi 100 zł (50 zł w przypadku

składek ulgowych). Bardzo prosimy o terminowe opłacanie składek. Członkowie, którzy są na emeryturze zwolnieni są z płacenia składek, nie

otrzymują kwartalnika „Postępy Biochemii”, ale mogą go zaprenumerować po ulgowej cenie 50 zł rocznie.

Członkowie, którzy opłacą składkę członkowską do 31 marca 2014 r. mają zapewnioną bezpłatną prenumeratę kwartalnika „Postępy Bioche-

mii”. Członkowie, którzy opłacą składkę po 31 marca powinni liczyć się z faktem, że mogą nie otrzymać wszystkich zeszytów rocznika 2014 r.

(będą otrzymywać kwartalnik do czasu wyczerpania nakładu).

Przypominamy także osobom, które zalegają ze składkami, że opłata zaległych składek, uchroni przed wszczęciem procedury skreślenia tych

osób z listy członków towarzystwa. Apelujemy o uregulowanie zaległych składek. jeszcze raz serdecznie zachęcamy do skorzystania z przywi-

lejów, jakie daje opłata składki członkowskiej w terminie.

Prenumerata „Postępów Biochemii” w 2014 roku

Prenumeratorzy instytucjonalni płacą za prenumeratę „Postępów Biochemii” 180 zł rocznie. Osoby fizyczne nie będące członkami towarzy-

stwa mogą zaprenumerować „Postępy Biochemii” w cenie 120 zł rocznie. Studenci i doktoranci nie będący członkami towarzystwa prenumerują

„Postępy Biochemii” po ulgowej cenie 50 zł rocznie. Konieczne jest przy tym udokumentowanie statusu studenta lub doktoranta odpowiednim

zaświadczeniem.

Opłaty należy wnosić do banku PekAo S.A. Oddział Warszawa, ul. Krucza 6/14; na konto 81 1240 6003 1111 0000 4947 2703;

Opłaty z zagranicy: IBAN: Pl81 1240 6003 1111 0000 4947 2703; SWIFt Code: PKOPPlPW

Koszt przelewu ponosi wpłacający.

joanna Bandorowicz-Pikuła
Skarbnik Polskiego towarzystwa Biochemicznego