BADANIE ZDOLNOŚCI DROŻDŻY DO PRZEPROWADZANIA PROCESU
FERMENTACJI ALKOHOLOWEJ
CELEM ĆWICZENIA JEST POZNANIE METOD BADANIA ZDOLNOŚCI
MIKROORGANIZMÓW DO WYTWARZANIA ALKOHOLU ETYLOWEGO Z
SACHAROZY NA PRZYKŁADZIE DROZDŻY Saccharomyces cerevisiae
ZAKRES ĆWICZENIA
-
określenie żywotności i stanu odżywienia szczepu Saccharomyces cerevisiae
stanowiącego zaszczepienie hodowli fermentacyjnej,
-
przeprowadzenie procesu fermentacji melasy i określenie stopnia jej wykorzystania
jako substratu oddechowego,
-
obliczenie wydajności procesu wytwarzania alkoholu etylowego.
INSTRUKCJA
MATERIAŁY
Próbki do badań: szczep Saccharomyces cerevisiae, pochodzący z produktu handlowego
drożdży piekarniczych.
Podłoża: melasa o zawartości sacharozy ok. 50%, roztwór soli: woda destylowana – 1 dm
3
,
(NH
4
)
2
SO
4
– 3,75 g, MgCl
2
– 0,28 g, Na
2
HPO
4
– 1,90 g oraz woda destylowana o temp. 30
0
C
– 200 cm
3
.
Odczynniki:
kwas siarkowy 1N, roztwór błękitu metylenowego, płyn Lugola, 5% roztwór
fenolu w wodzie redestylowanej, kwas siarkowy 96%.
Szkło:
pipety o poj. 1-2 i 10 cm
3
, kolby stożkowe, rurki fermentacyjne zaopatrzone w korki
gumowe dopasowane do kolb hodowlanych, zlewki o poj. 250 i 500 cm
3
, kolby miarowe o
poj. 100 i 500 cm
3
, probówki chemiczne, szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe.
Sprzęt: alkoholomierze, statywy do probówek.
Aparatura:
waga techniczna, mikroskop, pehametr, zestaw do destylacji alkoholu,
spektrofotometr, łaźnia wodna.
WYKONANIE DOŚWIADCZENIA
Określenie żywotności i stanu odżywienia szczepu Saccharomyces cerevisiae
-
Przygotować zaszczepienie pożywki wprowadzając 5 g prasowanych drożdży do 50
cm
3
jałowego roztworu soli fizjologicznej o temp. 30
0
C.
-
Pobrać kroplę tak przygotowanej zawiesiny i umieścić na szkiełku przedmiotowym.
Dodać kroplę roztworu błękitu metylenowego i obserwować komórki drożdży pod
mikroskopem. Komórki martwe barwią się na kolor szafirowo – niebieski, żywe są
bezbarwne. Podać procent martwych komórek.
-
Ocenić stan odżywienia drożdży na podstawie zawartości glikogenu w komórkach
drożdży. W tym celu umieścić na szkiełku przedmiotowym kroplę zawiesiny drożdży
i zalać płynem Lugola. Komórki zawierające glikogen wykazują ciemnobrunatne
zabarwienie, natomiast jasnożółte zabarwienie świadczy o jego braku. Stwierdzenie
obecności glikogenu w komórkach dowodzi, że stosowane do zaszczepienia drożdże
są świeże i były prawidłowo przechowywane (temp. 4
0
C w okresie nie dłuższym niż
jeden miesiąc). Próba negatywna świadczy o wykorzystaniu przez drożdże
komórkowych materiałów zapasowych (glikogenu), co ma miejsce wówczas gdy
drożdże są stare i były nieprawidłowo przechowywane.
Określenie wydajności procesu fermentacji
-
Nastawić hodowlę i oznaczyć wstępne parametry kontrolne procesu. W tym celu
bezpośrednio
przed
nastawieniem
doświadczenia
przygotować
pożywkę
fermentacyjną rozpuszczając 60 g melasy w 150 cm
3
wody destylowanej o temp.
30
0
C. W kolbie o poj. 500 cm
3
, odczyn pH wodnego roztworu melasy doprowadzić
do wartości 7,0, następnie dodać jeszcze ok. 3 cm
3
1N kwasu siarkowego i 50 cm
3
jałowego roztworu soli – pH pożywki powinno wynosić 5,0 – 5,5. Odlać 50 cm
3
pożywki, a pozostałe 100 cm
3
wyjałowić w autoklawie.
-
Po wystudzeniu, zaszczepić podłoże uprzednio przygotowaną zawiesiną drożdży.
Następnie kolbę z hodowlą szczelnie zamknąć korkiem z rurką fermentacyjną. Całość
zważyć na wadze technicznej. Fermentację prowadzić w temp. 28 – 30
0
C, określając
w odstępach dobowych ubytek masy hodowli. Koniec fermentacji określa się na
podstawie różnicy między masą hodowli podczas ostatniego i przedostatniego
ważenia. Różnica powinna wynosić 0,2 – 0,3 g.
-
Oznaczyć zawartość sacharozy w pozostawionej pożywce metodą kolorymetryczną z
fenolem i kwasem siarkowym.
-
Oznaczyć parametry kontrolne hodowli po fermentacji: zawartość sacharozy, stężenie
alkoholu, liczbę komórek pączkujących, żywotność i odżywienie drożdży.
-
Obliczyć wydajność teoretyczną i praktyczną procesu fermentacji w przeliczeniu na
wykorzystaną sacharozę, przy założeniu, że proces przebiega w myśl reakcji:
C
12
H
22
O
11
+ H
2
O → 4 C
2
H
5
OH + 4 CO
2
Ciężar właściwy alkoholu etylowego = 0,79425 g/cm
3
. należy przyjąć, że praktyczna
wydajność fermentacji alkoholowej wynosi 94%.
Oznaczanie zawartości cukrów redukujących metodą kolorymetryczną z fenolem i
kwasem siarkowym
Przygotowanie krzywej wzorcowej.
Odważyć 100 mg sacharozy i rozpuścić w 100 cm
3
wody destylowanej. Z tak przygotowanego standardowego roztworu pobrać kolejno 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 cm
3
do kolb miarowych o poj. 100 cm
3
i uzupełnić woda destylowaną do kreski.
Otrzymane roztwory wzorcowe zawierają odpowiednio 10, 20, 30, 40, 50, 60 i 70 µg
sacharozy.
-
Do probówek chemicznych odpipetować po 1 cm
3
roztworów wzorcowych. Probówkę
kontrolną przygotować z 1 cm
3
wody destylowanej zamiast roztworu sacharozy. Do
wszystkich prób dodać po 1 cm
3
5% wodnego roztworu fenolu i dobrze wymieszać.
Następnie dodać 5 cm
3
96% kwasu siarkowego, dobrze wymieszać (ZACHOWAĆ
ZASADY BEZPIECZEŃSTWA!). Następnie probówki wstawić do wytrząsarki
wodnej o temp. 25 – 30
0
C na 20 min.
-
Pomiar ekstynkcji dokonać przy długości λ = 490 nm. Wykonać wykres krzywej
wzorcowej zawartości sacharozy w zależności od absorbancji.
Oznaczanie sacharozy w badanych próbkach
-
Pobrać próbki z hodowli przed i po fermentacji, rozcieńczając je wodą destylowaną
tak, aby stężenie sacharozy w 1 cm
3
wynosiło od 10 do 70 µg.
-
Do probówek chemicznych odpipetować po 1 cm
3
odpowiednio rozcieńczonej próby,
dalej postępować tak jak przy wykonaniu krzywej wzorcowej. Po odczytaniu
absorbancji badanych próbek, odczytać zawartość sacharozy z krzywej wzorcowej i
obliczyć jej ilość w całym podłożu hodowlanym.
Oznaczenie zawartości alkoholu w hodowli fermentacyjnej
-
Oddestylować alkohol z podłoża hodowlanego. W tym celu zawartość kolby
fermentacyjnej przenieść ilościowo do kolby destylacyjnej. Oddestylować 100 cm
3
alkoholu bezpośrednio do kolby miarowej o poj. 100 cm
3
.
-
W destylacie określić za pomocą alkoholomierza stężenie alkoholu etylowego w
procentach objętościowych.
-
Wyniki wpisać do tabeli.
Tabela 1
Wyniki badań nad procesem fermentacji alkoholowej zachodzącej przy udziale drożdży
Saccharomyces cerevisiae
Oznaczenie
Wynik badań
Charakterystyka zaszczepienia hodowli
Ż
ywotność drożdży:
Stan odżywienia:
Masa hodowli,
Po dniach hodowli
Po nastawieniu (0) – 4 -
1 – 5 -
2 – 6 -
3 - 7 -
Ilość sacharozy w hodowli
W dniu nastawienia:
Po zakończeniu hodowli:
Zużycie [g]:
Ilość alkoholu etylowego w hodowli
Po zakończeniu hodowli:
% objętościowe:
Ilość [g]:
Wydajność procesu
Teoretyczna:
Praktyczna:
Literatura:
Grabińska – Łoniewska A. (red.): Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej, OWPW,
Warszawa 1999.
Sobczak E. (red.): Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej, SGGW,
Warszawa 1996.