BADANIE ZDOLNOŚCI DROŻDŻY DO PRZEPROWADZANIA PROCESU

FERMENTACJI ALKOHOLOWEJ

CELEM ĆWICZENIA JEST POZNANIE METOD BADANIA ZDOLNOŚCI
MIKROORGANIZMÓW DO WYTWARZANIA ALKOHOLU ETYLOWEGO Z
SACHAROZY NA PRZYKŁADZIE DROZDŻY Saccharomyces cerevisiae

ZAKRES ĆWICZENIA

-

określenie żywotności i stanu odżywienia szczepu Saccharomyces cerevisiae

stanowiącego zaszczepienie hodowli fermentacyjnej,

-

przeprowadzenie procesu fermentacji melasy i określenie stopnia jej wykorzystania

jako substratu oddechowego,

-

obliczenie wydajności procesu wytwarzania alkoholu etylowego.

INSTRUKCJA

MATERIAŁY

Próbki do badań: szczep Saccharomyces cerevisiae, pochodzący z produktu handlowego
drożdży piekarniczych.

Podłoża: melasa o zawartości sacharozy ok. 50%, roztwór soli: woda destylowana – 1 dm

3

,

(NH

4

)

2

SO

4

– 3,75 g, MgCl

2

– 0,28 g, Na

2

HPO

4

– 1,90 g oraz woda destylowana o temp. 30

0

C

– 200 cm

3

.

Odczynniki:

kwas siarkowy 1N, roztwór błękitu metylenowego, płyn Lugola, 5% roztwór

fenolu w wodzie redestylowanej, kwas siarkowy 96%.

Szkło:

pipety o poj. 1-2 i 10 cm

3

, kolby stożkowe, rurki fermentacyjne zaopatrzone w korki

gumowe dopasowane do kolb hodowlanych, zlewki o poj. 250 i 500 cm

3

, kolby miarowe o

poj. 100 i 500 cm

3

, probówki chemiczne, szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe.

Sprzęt: alkoholomierze, statywy do probówek.

Aparatura:

waga techniczna, mikroskop, pehametr, zestaw do destylacji alkoholu,

spektrofotometr, łaźnia wodna.

WYKONANIE DOŚWIADCZENIA

Określenie żywotności i stanu odżywienia szczepu Saccharomyces cerevisiae

-

Przygotować zaszczepienie pożywki wprowadzając 5 g prasowanych drożdży do 50

cm

3

jałowego roztworu soli fizjologicznej o temp. 30

0

C.

-

Pobrać kroplę tak przygotowanej zawiesiny i umieścić na szkiełku przedmiotowym.

Dodać kroplę roztworu błękitu metylenowego i obserwować komórki drożdży pod
mikroskopem. Komórki martwe barwią się na kolor szafirowo – niebieski, żywe są
bezbarwne. Podać procent martwych komórek.

-

Ocenić stan odżywienia drożdży na podstawie zawartości glikogenu w komórkach

drożdży. W tym celu umieścić na szkiełku przedmiotowym kroplę zawiesiny drożdży
i zalać płynem Lugola. Komórki zawierające glikogen wykazują ciemnobrunatne
zabarwienie, natomiast jasnożółte zabarwienie świadczy o jego braku. Stwierdzenie

obecności glikogenu w komórkach dowodzi, że stosowane do zaszczepienia drożdże
są świeże i były prawidłowo przechowywane (temp. 4

0

C w okresie nie dłuższym niż

jeden miesiąc). Próba negatywna świadczy o wykorzystaniu przez drożdże
komórkowych materiałów zapasowych (glikogenu), co ma miejsce wówczas gdy
drożdże są stare i były nieprawidłowo przechowywane.

Określenie wydajności procesu fermentacji

-

Nastawić hodowlę i oznaczyć wstępne parametry kontrolne procesu. W tym celu

bezpośrednio

przed

nastawieniem

doświadczenia

przygotować

pożywkę

fermentacyjną rozpuszczając 60 g melasy w 150 cm

3

wody destylowanej o temp.

30

0

C. W kolbie o poj. 500 cm

3

, odczyn pH wodnego roztworu melasy doprowadzić

do wartości 7,0, następnie dodać jeszcze ok. 3 cm

3

1N kwasu siarkowego i 50 cm

3

jałowego roztworu soli – pH pożywki powinno wynosić 5,0 – 5,5. Odlać 50 cm

3

pożywki, a pozostałe 100 cm

3

wyjałowić w autoklawie.

-

Po wystudzeniu, zaszczepić podłoże uprzednio przygotowaną zawiesiną drożdży.

Następnie kolbę z hodowlą szczelnie zamknąć korkiem z rurką fermentacyjną. Całość
zważyć na wadze technicznej. Fermentację prowadzić w temp. 28 – 30

0

C, określając

w odstępach dobowych ubytek masy hodowli. Koniec fermentacji określa się na
podstawie różnicy między masą hodowli podczas ostatniego i przedostatniego
ważenia. Różnica powinna wynosić 0,2 – 0,3 g.

-

Oznaczyć zawartość sacharozy w pozostawionej pożywce metodą kolorymetryczną z

fenolem i kwasem siarkowym.

-

Oznaczyć parametry kontrolne hodowli po fermentacji: zawartość sacharozy, stężenie

alkoholu, liczbę komórek pączkujących, żywotność i odżywienie drożdży.

-

Obliczyć wydajność teoretyczną i praktyczną procesu fermentacji w przeliczeniu na

wykorzystaną sacharozę, przy założeniu, że proces przebiega w myśl reakcji:

C

12

H

22

O

11

+ H

2

O → 4 C

2

H

5

OH + 4 CO

2

Ciężar właściwy alkoholu etylowego = 0,79425 g/cm

3

. należy przyjąć, że praktyczna

wydajność fermentacji alkoholowej wynosi 94%.

Oznaczanie zawartości cukrów redukujących metodą kolorymetryczną z fenolem i

kwasem siarkowym

Przygotowanie krzywej wzorcowej.

Odważyć 100 mg sacharozy i rozpuścić w 100 cm

3

wody destylowanej. Z tak przygotowanego standardowego roztworu pobrać kolejno 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 cm

3

do kolb miarowych o poj. 100 cm

3

i uzupełnić woda destylowaną do kreski.

Otrzymane roztwory wzorcowe zawierają odpowiednio 10, 20, 30, 40, 50, 60 i 70 µg
sacharozy.

-

Do probówek chemicznych odpipetować po 1 cm

3

roztworów wzorcowych. Probówkę

kontrolną przygotować z 1 cm

3

wody destylowanej zamiast roztworu sacharozy. Do

wszystkich prób dodać po 1 cm

3

5% wodnego roztworu fenolu i dobrze wymieszać.

Następnie dodać 5 cm

3

96% kwasu siarkowego, dobrze wymieszać (ZACHOWAĆ

ZASADY BEZPIECZEŃSTWA!). Następnie probówki wstawić do wytrząsarki
wodnej o temp. 25 – 30

0

C na 20 min.

-

Pomiar ekstynkcji dokonać przy długości λ = 490 nm. Wykonać wykres krzywej

wzorcowej zawartości sacharozy w zależności od absorbancji.

Oznaczanie sacharozy w badanych próbkach

-

Pobrać próbki z hodowli przed i po fermentacji, rozcieńczając je wodą destylowaną

tak, aby stężenie sacharozy w 1 cm

3

wynosiło od 10 do 70 µg.

-

Do probówek chemicznych odpipetować po 1 cm

3

odpowiednio rozcieńczonej próby,

dalej postępować tak jak przy wykonaniu krzywej wzorcowej. Po odczytaniu
absorbancji badanych próbek, odczytać zawartość sacharozy z krzywej wzorcowej i
obliczyć jej ilość w całym podłożu hodowlanym.

Oznaczenie zawartości alkoholu w hodowli fermentacyjnej

-

Oddestylować alkohol z podłoża hodowlanego. W tym celu zawartość kolby

fermentacyjnej przenieść ilościowo do kolby destylacyjnej. Oddestylować 100 cm

3

alkoholu bezpośrednio do kolby miarowej o poj. 100 cm

3

.

-

W destylacie określić za pomocą alkoholomierza stężenie alkoholu etylowego w

procentach objętościowych.

-

Wyniki wpisać do tabeli.

Tabela 1

Wyniki badań nad procesem fermentacji alkoholowej zachodzącej przy udziale drożdży

Saccharomyces cerevisiae

Oznaczenie

Wynik badań

Charakterystyka zaszczepienia hodowli

Ż

ywotność drożdży:

Stan odżywienia:

Masa hodowli,
Po dniach hodowli

Po nastawieniu (0) – 4 -
1 – 5 -
2 – 6 -
3 - 7 -

Ilość sacharozy w hodowli

W dniu nastawienia:

Po zakończeniu hodowli:

Zużycie [g]:

Ilość alkoholu etylowego w hodowli

Po zakończeniu hodowli:

% objętościowe:

Ilość [g]:

Wydajność procesu

Teoretyczna:

Praktyczna:

Literatura:
Grabińska – Łoniewska A. (red.): Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej, OWPW,
Warszawa 1999.
Sobczak E. (red.): Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej, SGGW,
Warszawa 1996.