plik

CHROMATOGRAFIA GAZOWA

1.WST

ĘP

W chromatografii gazowej (GC) faz

ą ruchomą jest gaz, zwany w tym przypadku gazem nośnym.

Faz

ą stacjonarną w chromatografii gazowej może być ciecz osadzona na nośniku stałym w postaci

jednorodnego filmu (warstwy) lub cia

ło stałe – adsorbent. W pierwszym przypadku układ

nazywamy chromatografi

ą podziałową (ang. gas-liquid chromatography, GLC) natomiast w

drugim, chromatografi

ą adsorpcyjną (ang. gas-solid chromatography, GSC).

Typowy chromatogram otrzymywany poprzez analiz

ę roztworu próbki badanej metodą

chromatografii gazowej zamieszczony jest na rysunku 15b. Najcz

ęściej pierwszy pik, jaki pojawia

ę na chromatogramie próbki jest pikiem rozpuszczalnika, w którym została ona rozpuszczona.

Zwykle pik rozpuszczalnika jest te

ż największym sygnałem na chromatogramie.

2. APARATURA

Analiz

ę związków chemicznych techniką chromatografii gazowej wykonuje się przy użyciu

chromatografów gazowych. Schemat chromatografu gazowego przedstawiono na rysunku 40. Gaz

śny (faza ruchoma) doprowadzony z butli (1) płynie przez regulator przepływu (2) do

dozownika (3), a nast

ępnie przez kolumnę (4) i detektor (5), skąd jest usuwany na zewnątrz do

atmosfery. Kolumna jest umieszczona w termostacie (piecu chromatograficznym) (6).

Temperatura dozownika, detektora i kolumny jest odpowiednio regulowana. Do dozownika

wprowadza si

ę próbkę, która po przejściu w stan pary w dozowniku, miesza się ze strumieniem

gazu no

śnego i następnie jest przenoszona do kolumny. W kolumnie następuje rozdzielenie

chromatograficzne sk

ładników próbki, które opuszczają kolumnę wraz z gazem nośnym i trafiają

kolejno do detektora. Sk

ładniki próbki generują w detektorze sygnał elektryczny i w ten sposób są

monitorowane. Sygna

ły elektryczne po wzmocnieniu we wzmacniaczu mogą być rejestrowane w

komputerze lub rejestratorze (7) w postaci chromatogramu (8).

Gaz no

śny

W chromatografii gazowej faz

ę ruchomą stanowią gazy o małej gęstości, niskiej lepkości, w

órych współczynniki dyfuzji są duże. Najczęściej jest to: wodór, azot, argon lub hel. Gazy te

przechowywane s

ą w postaci sprężonej w butlach stalowych (1 na rysunku 40).

Ruch gazu przez kolumn

ę wymuszany jest jego ciśnieniem w butli i ustalany do odpowiedniej

ędkości przepływu za pomocą reduktora ciśnienia, umieszczonego na butli (2 na rysunku 40).

Przy wyborze gazu no

śnego należy się kierować przede wszystkim rodzajem wybranego detektora

oraz cen

ą, dostępnością i czystością gazu. Wymagana czystość gazów wynosi >99,999%.

Dozownik

Dozownik jest elementem umo

żliwiającym wprowadzenie próbki w strumień gazu nośnego, który

przenosi j

ą do kolumny. Stosując chromatografię gazową można analizować substancje, które w

warunkach chromatografowania maj

ą postać gazów lub par. Około 20% znanych związków

chemicznych spe

łnia ten warunek i można je analizować techniką chromatografii gazowej. Są to

substancje gazowe oraz ciek

łe i stałe, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie jest wyższa

ż 350°C – 400°C. Klasyczne dozowanie próbki do typowej kolumny kapilarnej polega na

wprowadzeniu niewielkich obj

ętości (0,1 – 2 μl) cieczy (roztworu próbki) do dozownika za

pomoc

ą strzykawki. Prawidłowy sposób odmierzenia w strzykawce danej objętości roztworu

óbki przedstawia rysunku 41.

Po wprowadzeniu roztworu próbki do dozownika następuje gwałtowne przejście rozpuszczalnika i

óbki w stan gazu, który po zmieszaniu z gazem nośnym jest wprowadzany na kolumnę.

Praktyczne zasady dozowania próbki za pomoc

mikrostrzykawki:

•strzykawkę należy trzymać za część szklaną a nie za tłoczek,

•strzykawka jest bardzo delikatna, upuszczenie jej na twardą powierzchnię powoduje jej

zniszczenie,

•nie napełnia się całej strzykawki roztworem próbki, ponieważ w trakcie dozowania do

chromatografu gazowego cz

ęść roztworu może wydostać się na zewnątrz,

•przed nabraniem roztworu próbki do strzykawki dobrze jest zwilżyć ją za pomocą

rozpuszczalnika, w którym jest rozpuszczona (napełniając strzykawkę rozpuszczalnikiem i

usuwaj

ąc go), pozwoli to na dokładniejsze odmierzenie właściwej objętości roztworu próbki,

•należy nabierać niewielkie ilości (0,1 – 2 μl) roztworu próbki do strzykawki,

•nie należy zostawiać roztworu próbki w igle strzykawki, należy przesunąć tłoczek tak, aby

zobaczy

ć powietrze w strzykawce (rys. 44); w igle strzykawki o pojemności 10 μl mieści się

oko

ło 0,5 μl cieczy, pozostawiona w igle ciecz, po wprowadzeniu do gorącego dozownika

że spowodować wyrzucenie zawartości strzykawki w wyniku gwałtownego wzrostu

śnienia,

•igłę strzykawki przed dozowaniem próbki do chromatografu należy wytrzeć, najlepiej

papierowym r

ęcznikiem, zapobiegnie to zabrudzeniu membrany,

•tłoczek jest dłuższy od szklanej części strzykawki i nie należy go naciskać zbyt mocno przy

dozowaniu próbki, ponieważ można go zgiąć lub złamać,

•strzykawkę należy umyć rozpuszczalnikiem od razu po dozowaniu próbki i schować do

łaściwego opakowania,

•mycie strzykawki polega na wielokrotnym napełnianiu czystym rozpuszczalnikiem i

usuwaniu go, stosowane tradycyjnie trzykrotne umycie jest niewystarczaj

ące.

Dla wi

ększości kolumn kapilarnych, dopuszczalna objętość próbki wynosi 0,01 do 0,001 μl

cieczy, dlatego w chromatografii kapilarnej stosuje si

ę często dozowniki z dzieleniem strumienia

gazu no

śnego (rysunek 42). Takim dozownikiem dozuje się do kolumny tylko niewielką część

óbk, np. 1/100 – 1/300, a pozostała część jest usuwana na zewnątrz i tracona. Dzielenie próbki

powinno pozwoli

ć przede wszystkim zredukować rozmycie piku chromatograficznego, które jest

zwi

ązane z procesem gwałtownego odparowywania substancji w dozowniku i w ten sposób

polepszy

ć rozdzielczość, dlatego tzw. stosunek dzielenia jest ważnym parametrem, który

charakteryzuje ten spos

ób dozowania. Określa on stosunek objętościowy szybkości wypływu gazu

śnego zaworem odprowadzającym na zewnątrz do szybkości przepływu gazu nośnego przez

kolumn

ę.

Kolumna chromatograficzna

W kolumnie chromatograficznej zachodzi w

łaściwy proces chromatografowania i dlatego jej

rodzaj ma wp

ływ decydujący na wynik analizy chromatograficznej, czyli na jakość rozdzielenia

ładników próbki. Rozróżnia się następujące rodzaje kolumn (rysunek 43):

• pakowane (kolumny z wypełnieniem): analityczne, mikropakowane i preparatywne,

• kolumny o przekroju otwartym – kapilarne.

Kolumny pakowane nape

łnione są złożem zawierającym fazę stacjonarną w całej swojej objętości.

Ten rodzaj kolumn jest najcz

ęściej stosowany do preparatywnego otrzymywania niewielkich ilości

czystych zwi

ązków chemicznych.

Kolumny kapilarne pozwalaj

ą na osiągnięcie dużo wyższych sprawności niż kolumny pakowane i

obecnie wi

ększość analiz chromatograficznych wykonuje się przy zastosowaniu kolumn

kapilarnych.

Kolumny kapilarne maj

ą około 100 tys. półek teoretycznych. Fazy stacjonarne w kolumnach

kapilarnych mog

ą być zarówno adsorbentami, jak i cieczami i mogą być osadzone na ściankach

kapilar w różny sposób.

Wyróżnia się następujące rodzaje kolumn kapilarnych (rysunek 44):



WCOT (ang. wall-coated open tubular) – kapilary ze

ściankami wewnętrznymi pokrytymi

nielotn

ą ciekłą fazą stacjonarną, najczęściej związaną chemicznie ze ściankami kolumny;

jest to najbardziej popularny typ kolumn,



PLOT (ang. porous layer open tubular) – kapilary ze

ściankami pokrytymi warstwą ziaren

adsorbenta,



SCOT (ang. support-coated open tubular) – ziarna wype

łnienia pokryte są ciekłą fazą

stacjonarn

ą, obecnie rzadko stosowane.

Kolumny kapilarne do GC s

ą najczęściej wykonane ze stopionego kwarcu, czyli ditlenku krzemu.

Stopiony kwarc jest

łatwy do formowania, elastyczny i dużo wytrzymalszy niż inne szkła, co

powoduje,

że można wyprodukować kapilary o średnicy wewnętrznej od 0,1 do 1 mm i długości od

10 do 60 m.

Średnica wewnętrzna kolumn kapilarnych wynosi najczęściej: 0,1 mm, 0,25 mm, 0,32

mm lub 0,53 mm. Najcz

ęściej używane są kolumny o wymiarach 0,25 mm × 30 m. Kolumny

kapilarne przechowuje si

ę w postaci zwoju, w uchwytach chroniących je przed uszkodzeniem (rys.

43b).

Adsorbenty stosowane w chromatografii gazowej to adsorbenty w

ęglowe, żele krzemionkowe, sita

molekularne i polimery porowate.

Ciek

łe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej to najczęściej:

 fazy niepolarne – węglowodory, będące dobrymi rozpuszczalnikami substancji

niepolarnych, np. skwalan,

 fazy średniopolarne, tzw. silikony, są to siloksany o różnej masie cząsteczkowej, z których

najcz

ęściej

stosowane

polidimetylosiloksan,

polimetylofenylosiloksan

policyjanoalkilosiloksan,

 fazy polarne - glikole polietylenowe (np. Carbowax) oraz estry,

 fazy polarne oparte o kopolimery styrenu i diwinylobenzenu (np. Porapak Q).

Detektory

Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej s

ą wykrywane przez detektor w miarę, jak

eluuj

ą z kolumny. Detektor reaguje sygnałem elektrycznym na obecność chromatografowanego

zwi

ązku chemicznego w gazie nośnym opuszczającym kolumnę. Detektory można podzielić na:

• nieselektywne - detektory uniwersalne, reagują na wszystkie składniki próbki,

• selektywne - reagują na pewną grupę związków, które mają podobne właściwości

chemiczne lub fizyczne,

• specyficzne - reagują na pojedynczy związek chemiczny.

Najcz

ęściej używanym detektorem jest detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Jest to detektor

uniwersalny, czyli taki, który jest czuły na prawie wszystkie związki organiczne.

Zasada dzia

łania detektora FID przedstawiona jest na rysunku 45. Do detektora doprowadzane są z

butli dwa gazy: wodór i powietrze (9 i 10 na rysunku 40). Natężenie przepływu wodoru i powietrza

regulowane s

ą reduktorami (2 na rysunku 40). Gaz nośny wypływający z kolumny jest mieszany z

wodorem i kierowany przez dysz

ę do komory, przez którą przepływa powietrze. Wodór spala się

tworz

ąc płomień. Składniki próbki doprowadzone wraz z gazem nośnym do płomienia ulegają

spaleniu. Niewielka cz

ęść atomów węgla (około 0,0018 %) ulega jonizacji w trakcie spalenia, co

odpowiada wytworzeniu oko

ło dwóch jonów lub elektronów na 105 cząsteczek analitu

dostarczonych do detektora. W komorze znajduj

ą się dwie elektrody: jedną jest dysza palnika,

drug

ą (zbierającą) stanowi pierścień umieszczony w odpowiedniej odległości od dyszy.

Powstaj

ący prąd jonowy jest wzmacniany i rejestrowany przez potencjometr. Sygnał z detektora

jest proporcjonalny do liczby atomów w

ęgla niezwiązanych z tlenem a więc w przybliżeniu jest

proporcjonalny do masy substancji (atomy w

ęgla związane z tlenem lub siarką nie tworzą w

detektorze jon

ów, dlatego FID nie jest czuły na wymienione wyżej tlenowe i siarkowe związki

ęgla).

Chromatograf gazowy mo

że być sprzężony ze spektrometrem mas (GC/MS), który w takim

łączonym układzie będzie pełnił funkcję detektora.

3. WYBÓR PARAMETRÓW ANALIZY GC

Parametry analizy metod

ą chromatografii gazowej dobierane są do konkretnego analitu i

konkretnej próbki. Najwa

żniejsze parametry pracy układu chromatograficznego to:

 rodzaj fazy stacjonarnej,

 wymiary kolumny,

 temperatura pieca chromatograficznego,

 rodzaj detektora i dozownika,

 temperatura detektora i dozownika,

 wielkość dozowanej próbki.

Wybór fazy stacjonarnej do analizy nie jest sprawą łatwą i ciągle jeszcze bywa dokonywany

eksperymentalnie. Najwa

żniejszą cechą faz stacjonarnych, decydującą o oddziaływaniu z

ąsteczkami związków rozdzielanych jest ich polarność.

ływ długości kolumny na wyniki analizy jest następujący: im dłuższa kolumna, tym czasy

retencji s

ą większe i tym wyraźniejsze są różnice między czasami retencji dwóch substancji.

Jednak d

łuższy czas analizy powoduje, że piki są bardziej rozmyte.

Temperatura kolumny ma ogromny wp

ływ na wynik analizy. Proces chromatograficzny można

prowadzi

ć w stałej temperaturze (tzw. analiza izotermiczna) lub metodą programowanej

temperatury (analiza z programowan

ą temperaturą). Tę drugą chromatografię stosuje się wtedy,

gdy sk

ładniki mieszaniny różnią się znacząco temperaturami wrzenia, np. węglowodory z ropy

naftowej lub szereg homologiczny alkoholi.

W analizie z programowan

ą temperaturą roztwór próbki jest wprowadzany do kolumny

chromatograficznej utrzymywanej w stosunkowo niskiej temperaturze – ni

ższej (o około 90°C) niż

temperatura wrzenia najbardziej lotnego sk

ładnika próbki. Następnie temperatura kolumny

chromatograficznej jest stopniowo podwy

ższana. Narost temperatury jest odpowiednio

programowany, mo

że być stały, na przykład 4°C/min. Końcowa temperatura kolumny powinna

ć bliska temperaturze wrzenia najmniej lotnego składnika próbki, ale nie może przekraczać

dopuszczalnego limitu temperaturowego pracy kolumny, okre

ślanego przez jej producenta.

Dozowana próbka powinna być bardzo mała, wówczas strefa startowa jest bardzo wąska. Wielkość

próbki wprowadzonej do kolumny nie może być większa od pojemności sorpcyjnej kolumny,

poniewa

ż przeładowanie kolumny prowadzi do złego rozdzielenia składników próbki i

powstawania niesymetrycznych, szerokich pików. Pojemno

ść kolumny zwykle nie przekracza

oko

ło 40 ng dla pojedynczego składnika próbki.