Biologia molekularna – Laboratorium
Porównanie budowy DNA i RNA
Kwasy nukleinowe należą
do
związków
wielofunkcyjnych, czyli w
ich budowie cząsteczkowej
można wyróżnić różne
grupy funkcyjne, które w
zależności
od
swoich
właściwości,
będą
wpływały na zachowanie
budowanej przez siebie
substancji. W kwasach
nukleinowych obecne są
reszty kwasowe kwasu
nieorganicznego,
grupy
hydroksylowe,
grupy
aminowe
i
wiązanie
hemiacetalowe. Znane są
dwa
rodzaje
kwasów
nukleinowych:
kwas
rybonukleinowy
(RNA)
oraz
kwas
deoksyrybonukleinowy
(DNA).
Ogólnie opisując ich budowę, stwierdzamy, że są biopolimerami, których podstawowym składnikiem
budowy jest nukleotyd.
Budowa zasad purynowych i pirymidynowych;
Jeden nukleotyd kwasu nukleinowego (RNA lub DNA) będzie się
składać z:
A) jednej z zasad azotowych:
puryny (dla RNA i DNA): adeniny, guaniny, pirymidyny
(dla RNA): cytozyny, uracylu
(dla DNA): cytozyny, tyminy
B) cząsteczki pentozy:
dla RNA - rybozy
dla DNA - deoksyrybozy
C) reszty kwasu fosforowego (V)
nukleotyd adeniny nukleotyd guaniny nukleotyd cytozyny
nukleotyd tyminy nukleotyd uracylu
Odkrycie budowy DNA w 1953 roku stało się przełomem w dziedzinie genetyki. W 1962 odkrywcy, James
Watson, Francis Crick i Maurice Wilkins, otrzymali za nie Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii. Pierwsze
informacje na temat kwasów nukleinowych pojawiają
się w roku 1869 gdy niemiecki badacz J. Meischer
wyizolował z jąder ludzkich komórek materiał, który
zawierał fosfor i był odporny na rozkładający białka
enzym pepsynę.
Nukleotydy łączą się ze sobą resztami kwasu
fosforowego (V) przez przyłączenie do atomów węgla
dwóch sąsiednich pentoz, odpowiednio do C3’ i do
C5’. Oznaczenie prim (‘) odnosi się do węgli z
drugiego
związku
pierścieniowego
tworzącego
nukleotyd. Połączenie dwóch sąsiednich nukleotydów.
Wiązania wodorowe łączą obie nici ze sobą. Należy zwrócić uwagę na to jakie zasady łączą się ze sobą.
Wiązania wodorowe występują, odpowiednio w DNA;
2 wiązania między - Adeniną (A) i Tyminą (T)
3 wiązania między - Guaniną (G) i Cytozyną (C)
Model budowy transportowego RNA (t-RNA) Tak samo jak w DNA występują wiązania wodorowe
odpowiednio:
2 wiązania między - Adeniną (A) i Uracylem (U)
3 wiązania między- Guaniną (G) i Cytozyną (C)
Elektroforeza kwasów nukleinowych;
Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację
absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroferogramów preparatów znakowanych
izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik
preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji.
Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z
komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej
i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu
cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą
cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w
przypadku denaturacji białek) lub mocznika (w przypadku denaturacji DNA lub białek).
W elektroforezie żelowej ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje, jest żel
elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów, agaru lub skrobi (metoda historyczna),
uformowany w płytkę długości kilkunastu – kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku
milimetrów (rzadziej jest to słupek – elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w
zagłębienie w żelu – studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np. w
formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako
wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd
roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną
elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000
V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki
oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc
(na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności
elektroforetycznej.
Podział technik elektroforezy DNA
•Agarozowa (horyzontalna)
-w stałym polu elektrycznym
-w zmiennym polu (PFGE)
•Akrylamidowa (wertykalna)
-denaturująca
-niedenaturująca
•elektroforezę w żelu agarozowym stosuje się do rozdzielania dużych cząsteczek DNA.
•elektroforezę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania małych fragmentów DNA.
•Elektroforeza dna w żelu agarozowym w stałym polu elektrycznym jest rutynową techniką wizualizacji
DNA i RNA
Zalety elektroforezy agarozowej
• duży zakres rozdzielanych fragmentów DNA od kilkuset pz do 40 kpz (w elektroforezie w stałym polu) i
Mpz (w zmiennym polu elektrycznym)
•łatwość przygotowania żelu i elektroforezy
•jest nietoksyczna
Wady
•mała zdolność rozdzielcza żeli agarozowych
•agaroza jest stosunkowo droga
Barwienie żeli agarozowych
Bromek etydyny (EB) jest używany najczęściej, lecz jest silnie mutagenny. Należy unikać barwienia żeli
przed elektroforezą (tzn. barwnik dodany do agarozy lub do buforu). Daje dość silne tło i żele powinno się
odbarwiać przed archiwizacją.
SYBR Green, SYBR Gold bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko alkalicznych warunkach, WADA!!! -
drogi.
Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym.
Wielkość cząsteczki -dsDNA liniowe migruje w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do ilości par
zasad (odwrotnie proporcjonalna do log10 z masy cząsteczkowej).
Konformacja DNA - super zwinięta kolista forma (CCC), Otwarto kolista (OC) i liniowa (LIN) Forma migrują
w żelu z różną szybkością. Względna ruchliwość tych form zależy od stęż. agarozy, natężenia prądu, siły
jonowej buforu i gęstości super skrętów formy CCC. Najlepiej dla odróżnienia form stosować odpowiednie
markery (zwykle plazmidy i fragmenty DNA).
Obecność bromku etydyny w żelu i buforze.
Interkalacja bromku etydyny powoduje spadek ładunku negatywnego w dsDNA i wzrost sztywności i
długości DNA. Stopień migracji jest opóźniony o około 15%.
Napięcie prądu – w niskim napięciu, stopień migracji liniowych fragmentów DNA jest proporcjonalny do
zaaplikowanego napięcia. W wyższym napięciu mobilność wysokocząsteczkowych fragmentów nie jest
proporcjonalna do napięcia.
Skład buforu do elektroforezy – w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno, w buforach o
zbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku powoduje wydzielanie się ciepła co może prowadzić do
rozpuszczenia żelu i denaturacji DNA.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Polimer akrylamidu może służyć do rozdziału dsDNA i ssDNA według wielkości i konformacji. Żele
poliakrylamidowe mają trzy główne cechy korzystniejsze niż żele agarozowe:
-ich zdolność rozdzielczajest tak duża, że mogą rozdzielać cząsteczki różniące się długością równą 0.1%
(tzn. 1 bp w 1000 bp);
-można rozdzielać większe ilości DNA można rozdzielać do 10 μg DNA w jednej ścieżce (1 cm x 1 mm) bez
utraty zdolności rozdzielczej;
- DNA odzyskane z żelu akrylamidowego jest Bardzo czyste (metodami podobnymi do odzyskiwania z
agarozy) i można go używać np. do iniekcji zarodków mysich).
Zdolność rozdzielcza
zależy od wielkości porów jakie tworzy polimer, a to zależy od stężenia akrylamidu i N,N’-
metylenbisakrylamidu oraz od szeregu innych czynników jak natężenie prądu czy grubość żelu. Zakres
stężenia akrylamidu to 3.5% -20%, w którym dzieli się fragmenty 6-2000 pz. Stosunek bisakrylamidu do
akrylamidu wynosi zwykle 1:30
Żele akrylamidowe nie mogą być barwione przed elektroforezą, ponieważ bromek etydyny hamuje
polimeryzację akrylamidu, ale barwią się po elektroforezie, lecz z mniejszą efektywnością niż agaroza. Do
barwienia DNA w tych żelach można używać także innych barwników jak SYBR.
Rodzaje żeli akrylamidowych w elektroforezie DNA:
Żele denaturujące służą do rozdzielania i oczyszczania ssDNA lub RNA. Te żele są polimeryzowane w
obecności mocznika, formamidu lub formaldehydem co hamuje tworzenie par w DNA.
Zdenaturowany DNA migruje w tych żelach z szybkością niezależną od składu zasad i ich sekwencji.
Stosuje się m.in. do rozdziału RNA, izolacji radioaktywnych sond i do rozdziału produktów reakcji
sekwencyjnych. Żele niedenaturujące są używane do rozdziału i oczyszczania dsDNA.
Zasadniczo dsDNA migruje w żelach z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log10 z ich wielkości.
Jednakże szybkość migracji zależy też od składu zasad i fragmenty tej samej wielkości mogą migrować z
szybkością różniącą się nawet o 10%. Zwykle służą do preparowania bardzo czystego DNA i do wykrywania
interakcji DNA- białko (EMSA -Gel Shift Assay).