ENZYMOLOGIA – Biotransformacja – enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Biotransformacja – enzymatyczna separacja aminokwasów na

enancjomery

Wstęp

Enzymy jako odczynniki chemiczne są szczególnie przydatne w syntezach połączeń o

zdefiniowanej budowie przestrzennej, w procesach rozdziału racematów czy syntezie
peptydów.

Biotransformacje aminokwasów – rozdział racematów

Selektywne otrzymywanie czystych optycznie form (enancjomerów) aminokwasów

możliwe jest w wyniku enzymatycznej ich syntezy z prochiralnych substratów lub
enzymatycznego rozdzielenia racemicznych mieszanin ich pochodnych. Do rozdziału
racemicznych mieszanin najczęściej stosuje się katalizowane przez esterazy reakcje hydrolizy
estrów aminokwasów, selektywną hydrolizę N-acylowanych pochodnych aminokwasów za
pomocą acylaz lub katalizowane przez amidazy reakcje hydrolizy amidów aminokwasów
(Rys. 1).

Rys. 1 Rozdział racemicznych mieszanin pochodnych aminokwasów za pomocą

enzymów hydrolitycznych.

Wszystkie wymienione enzymy są ściśle stereospecyficzne i katalizują reakcje hydrolizy
substratów o konfiguracji

L

, podczas gdy izomer

D

substratu nie ulega reakcji.

1

ENZYMOLOGIA – Biotransformacja – enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery

Zastosowanie enzymów do rozdziału racemicznych mieszanin aminokwasów jest

znane od roku 1906, kiedy to Warburg uzyskał z 85% wydajnością

L

-leucynę z mieszaniny

racemicznej jej estru propylowego poddanej działaniu ekstraktu z trzustki – tak zwanej
pankreatyny. Reakcja ta stanowi pierwszy przykład biotransformacji (Rys. 2).

Rys. 2 Rozdział racemicznej mieszaniny estru propylowego leucyny za pomocą

pankreatyny

Enzymatyczna synteza wiązania peptydowego

W warunkach fizjologicznych enzymy proteolityczne katalizują hydrolizę wiązania

peptydowego, ale zdolne są również katalizować reakcję odwrotną, to jest reakcję syntezy
tego wiązania. Synteza zachodzi wówczas stereoselektywnie i nie jest wymagane blokowanie
funkcyjnych grup bocznych aminokwasów.
W enzymatycznej syntezie peptydów stosuje się proteinazy (endopeptydazy), egzopeptydazy,
które katalizują sekwencyjną hydrolizę końcowych reszt aminokwasowych nie są tu używane
(wyjątek – karboksypeptydaza Y) (Rys. 3).

Rys. 3 Enzymy wykorzystywane w reakcjach syntezy peptydów

2

ENZYMOLOGIA – Biotransformacja – enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery

Enzymatycznej syntezy wiązania peptydowego można dokonać na dwa sposoby: w procesie
kontrolowanym równowagą reakcji i w procesie kontrolowanym kinetycznie. Ponieważ
synteza wiązania peptydowego zachodzi jako reakcja odwrotna do reakcji hydrolizy, należy
dążyć do przesunięcia równowagi tej reakcji. Do kontroli równowagi reakcji stosuje się
natychmiastowe usuwanie produktu ze środowiska, w którym zachodzi proces katalizy
enzymatycznej, bądź przez zastosowanie układu dwufazowego (ekstrakcja produktu do fazy
organicznej), bądź też precypitację powstałego produktu. W przypadku procesu
kontrolowanego kinetycznie czynnikiem decydującym o przebiegu reakcji jest szybkość
tworzenia jej produktów.

Zastosowanie lipaz w syntezie organicznej
Lipazy

mogą katalizować konwersję wielu substratów i to zarówno w wodnym, jak i

apolarnym środowisku. W środowisku organicznym enzymy te katalizują reakcje
przeniesienia grup arylowych z odpowiednich donorów na akceptory inne niż woda. W
zależności od typu donora i akceptora są to reakcje, estryfikacji, transestryfikacji,
aminowania, syntezy peptydów czy też reakcje tworzenia monocyklicznych laktonów.
Przykładem enancjoselektywnej estryfikacji racemicznych kwasów jest estryfikacja kwasu 2-
bromoheksanowego n-butanolem, katalizowana przez lipazę z Candida cylindracea (Rys. 4).

Rys. 4 Enancjoselektywna estryfikacja kwasu 2-bromoheksanowego n-butanolem,

katalizowana przez lipazę z Candida cylindracea

Reakcje enzymatycznego utleniania i redukcji

Procesy utleniania i redukcji to jedne z najważniejszych reakcji jednostkowych w

chemii organicznej. W wielu przypadkach powinny one zachodzić w jak najdelikatniejszych
warunkach i dlatego próby użycia oksydoreduktaz w syntezie organicznej budzą duże
zainteresowanie. Zastosowanie znalazło już kilka enzymów z tej grupy m.in. oksydazy
aminokwasów i dehydrogenazy alkoholowe.
Oksydazy aminokwasów katalizują enancjoselektywne reakcje utleniania aminokwasów, w
wyniku czego powstają

α-ketonokwasy. Służą one zatem do otrzymywania jednego z

enancjomerów aminokwasu z jego mieszaniny racemicznej. Drugi enancjomer zostaje
enzymatycznie utleniony, a więc jest niszczony w procesie rozdziału racematu.
Dehydrogenaza alkoholowa z wątroby końskiej używana jest jako odczynnik redukujący
ketony do drugorzędowych alkoholi lub jako katalizator reakcji utleniania alkoholi do
ketonów.

Wykonanie ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest enzymatyczny rozdział racematu – chlorowodorku estru

metylowego

D

,

L

– fenyloalaniny przy użyciu

α – chymotrypsyny i izolacja

L

– fenyloalaniny.

α – Chymotrypsyna hydrolizuje wiązanie peptydowe po karboksylowej stronie aminokwasów
aromatycznych. Jest ona również zdolna hydrolizować estry tych aminokwasów, zarówno
naturalnych (fenyloalanina, tyrozyna czy tryptofan), jak i nienaturalnych (chloro- i

3

ENZYMOLOGIA – Biotransformacja – enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery

fluorofenyloalanina). Hydroliza jest enancjoselektywna, czyli ulega jej tylko ester o
konfiguracji

L

.

Materiały i sprzęt
Chlorowodorek estru metylowego

D

,

L

– fenyloalaniny

α – chymotrypsyna
0.4 M LiOH
etanol
wyparka obrotowa
polarymetr

Przebieg ćwiczenia obejmuje następujące etapy:

• Enzymatyczna reakcja hydrolizy chlorowodorku

L

– fenyloalainianu metylu w

roztworze racemicznej mieszaniny chlorowodorku

D

,

L

– fenyloalainianu metylu za

pomocą

α – chymotrypsyny

• Izolacja

L

- fenyloalaniny

• Zbadanie czystości związku poprzez oznaczenie jego skręcalności właściwej

500 mg racemicznej mieszaniny chlorowodorku estru metylowego fenyloalaniny rozpuścić w
3 ml wody destylowanej i doprowadzić przy pomocy roztworu LiOH do pH 5. Do
otrzymanego roztworu dodać 20 mg

α – chymotrypsyny rozpuszczonej w 1ml wody. W

trakcie reakcji obserwuje się szybki spadek pH, wobec czego trzeba je utrzymywać blisko
wartości pH 5, dodając kroplami roztwór LiOH. Po ostatecznym ustaleniu się pH reakcję
prowadzić jeszcze przez 10 - 20 min. Mieszaninę poreakcyjną zagęścić na wyparce obrotowej
do momentu, aż roztwór stanie się mętny. Następnie mieszaninę schłodzić w łaźni lodowej.
Kryształy

L

– fenyloalaniny odsączyć, przemyć zimnym etanolem i suszyć na powietrzu.

Czystość związku zbadać oznaczając jego skręcalność właściwą.

Opracowanie wyników
Uzyskane wyniki porównać z danymi literaturowymi dotyczącymi skręcalności właściwej

L

–

fenyloalaniny. Na tej podstawie oszacować czystość otrzymanego związku.
Metodę można zastosować w procesie przemysłowym, jednakże proces ten musi być
zmodyfikowany w taki sposób, aby zapewnić jego opłacalność. Zauważ, że w reakcji
prowadzonej tak jak podczas ćwiczenia jedynie 50% substratu zostaje przekształcona w
produkt. Zaproponuj sposób postępowania, który umożliwia lepsze wykorzystanie substratu
(WSKAZÓWKA: dodatkowy etap lub etapy).

4