Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
1
ZADANIE 1
TYTUŁ: REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW I BIAŁEK
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć
wiczeń
Materiały i urządzenia:
• Materiały
1. białko jaja kurzego
2. roztwory przykładowych aminokwasów
3. CuSO
4
10%
4. NaOH 10%
5. etanol
6. ninhydryna
7. NaNO
2
10%
8. CH
3
COOH 2M
9. stężony kwas azotowy
10. odczynnik Millona
11. Pb(CH
3
COO)
2
12. roztwór nitroprusydku sodu2%
13. stężony HCl
14. kwas mrówkowy 20%
• Urządzenia
1. probóki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
INFORMACJE TEORETYCZNE:
Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych w białkach i
peptydach (zbudowanych z co najmniej trzech aminokwasów). Nazwa reakcji wywodzi się od
dającego ją związku o wiązaniach amidowych - biuretu H
2
N-CO-NH-CO-NH
2
. Z wiązaniami
tego typu jony miedziowe tworzą w środowisku zasadowym kompleksy o barwie fioletowej.
W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu
peptydowym, - CO-NH -, z wytworzeniem formy-C(OH)=N-, w której grupa enolowa jest
zdolna do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jon Cu
2+
może
wytworzyć dwa wiązania jonowe (z grupami enolowymi) i cztery koordynacyjne (z atomami
azotu).
Aminokwasy ogrzewane w środowisku kwaśnym z nadmiarem ninhydryny ulegają
dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. W wyniku tego aminokwas przekształca się w
niższy (uboższy o jeden atom węgla w cząsteczce od wyjściowego aminokwasu) aldehyd,
uwalnia się CO
2
i wydziela NH
3
. Równocześnie następuje redukcja ninhydryny. Z kolei
zredukowana ninhydryna wchodzi w reakcję z nadmiarem ninhydryny niezredukowanej i
amoniakiem tworząc związek o zabarwieniu niebieskim.
Aminokwasy pod działaniem kwasu azotowego (III) przechodzą w hydroksykwasy,
przy czym azot aminokwasu (grupy aminowej) i kwasu azotowego (III) wydziela się w
postaci gazowej w ilości 1 cząsteczki na każdą grupę aminową i może być oznaczony
objętościowo:
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
2
Aminokwasy aromatyczne ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze
stężonym kwasem azotowym, dając żółto zabarwione nitrowe pochodne (fenyloalanina
wymaga do nitrowania dodatku H
2
SO
4
). Po zalkalizowaniu powstałe związki nitrowe ulegają
redukcji do amin, przyjmując równocześnie zabarwienie pomarańczowe.
Reakcja Millona zachodzi pod wpływem odczynnika Millona, który zawiera w swym
składzie jony rtęciowe (I) i (II), azotowe (III) i (V). Powstające w wyniku reakcji czerwone
zabarwienie pochodzi od kompleksu rtęciowo– fenolowo– nitrozowego. Reakcję tę daje
zarówno wolna tyrozyna, jak i związana w bialku.
W roztworach alkaliów z grupy tiolowej cysteiny oraz ugrupowania dwusiarczkowego
cystyny odszczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczkowych
S
2-
. Obecność tych jonów można wykryć za pomocą reakcji z roztworem octanu ołowiu (II).
Powstaje wówczas siarczek ołowiu (II), który wytrąca się w postaci czarnego osadu. Reakcję
tę daje zarówno cystyna i cysteina w postaci wolnej, jak i związana w białku.
W przeciwieństwie do cysteiny i cystyny siarka zawarta w cząsteczkach metioniny nie
ulega uwolnieniu w środowisku alkalicznym. Metioninę wykrywa się przy użyciu
nitroprusydku sodu w obecności glicyny. Pojawiające się różowo- brunatne zabarwienie
ś
wiadczy obecności metioniny w roztworze.
Reakcje na obecność tryptofanu są charakterystyczne dla występującego w nim układu
indolowego oraz jego reszt zawartych w różnych substancjach białkowych. Związki
zawierające ten układ dają w środowisku stężonych kwasów mineralnych z aldehydami
produkty kondensacji o zabarwieniu fioletowym.
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1:
reakcja na wiązania peptydowe (reakcja biuretowa)
Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać równą objętość 10% NaOH i parę kropli
1% CuSO
4
. Należy unikać nadmiaru CuSO
4
, ponieważ niebieska barwa
wodorotlenku miedziowego maskuje właściwy odczyn. Reakcję powtórzyć dla
dowolnego aminokwasu. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 2: reakcja ninhydrynowa
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego i do 1 ml 0,1% roztworu aminokwasu dodać
po 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Probówkę ogrzać do wrzenia.
Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 3: reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (iii) - dezaminacja
aminokwasów
Do 2 ml 10% NaNO
2
dodać 2 ml 2M CH
3
COOH i 0,5 ml 0,5% roztworu glicyny.
Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 4:
reakcja ksantoproteinowa
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml stężonego kwasu azotowego.
Ogrzać w ciągu 30 sekund. Zaobserwować zmianę zabarwienia roztworu. Po
ostudzeniu wprowadzić w nadmiarze 30% NaOH (lub roztwór stężonego amoniaku
w ilości około 2-3 ml). UWAGA! Reakcja silnie egzotermiczna. Zapisz obserwację
i wyciągnij odpowiednie wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu
tyrozyny.
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii
Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
3
Podzadanie 5: reakcja Millona – wykrywanie tyrozyny
Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli odczynnika Millona i
ostrożnie ogrzać nad płomieniem. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie
wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu tyrozyny.
Podzadanie 6: reakcja cystynowa – wykrywanie cysteiny i cystyny
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 30% roztworu NaOH i ogrzewać
do wrzenia przez kilka minut. Następnie wprowadzić kilka kropel roztworu
Pb(CH
3
COO)
2
i ponownie ogrzać. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie
wnioski.
Podzadanie 7:
wykrywanie metioniny metodą mcCarthy- Sullivana
Do 2,5 ml 1% roztworu metioniny dodać 0,5 ml 30% NaOH, 3 krople 2% roztworu
nitroprusydku sodu oraz 0,5 ml 1% roztworu glicyny. Równocześnie w drugiej
probówce wykonać próbę ślepą używając wody destylowanej zamiast metioniny.
Obie probówki umieścić w łaźni o temperaturze 60°C i pozostawić na 10 minut.
Następnie oziębić i dodać 2 ml stężonego HCl. Zapisz obserwację i wyciągnij
odpowiednie wnioski.
Podzadanie 8:
reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa – wykrywanie tryptofanu
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% kwasu mrówkowego.
Po wymieszaniu, roztwór podwarstwić stężonym roztworem H
2
SO
4
. Zapisz
obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.
LITERATURA
1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5. „Naturalne związki organiczne”, A. Kołodziejczyk, PWN, Warszawa 2003
6. Biochemia kręgowców”, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 1998, 2004
7. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003