Biochemia dla Biologii nr ETCS

Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

1

ZADANIE 1

TYTUŁ: REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW I BIAŁEK

Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ć

wiczeń

Materiały i urządzenia:

• Materiały

1. białko jaja kurzego
2. roztwory przykładowych aminokwasów
3. CuSO

4

10%

4. NaOH 10%
5. etanol
6. ninhydryna
7. NaNO

2

10%

8. CH

3

COOH 2M

9. stężony kwas azotowy
10. odczynnik Millona
11. Pb(CH

3

COO)

2

12. roztwór nitroprusydku sodu2%
13. stężony HCl
14. kwas mrówkowy 20%

• Urządzenia

1. probóki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety

INFORMACJE TEORETYCZNE:

Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych w białkach i

peptydach (zbudowanych z co najmniej trzech aminokwasów). Nazwa reakcji wywodzi się od
dającego ją związku o wiązaniach amidowych - biuretu H

2

N-CO-NH-CO-NH

2

. Z wiązaniami

tego typu jony miedziowe tworzą w środowisku zasadowym kompleksy o barwie fioletowej.
W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu
peptydowym, - CO-NH -, z wytworzeniem formy-C(OH)=N-, w której grupa enolowa jest
zdolna do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jon Cu

2+

może

wytworzyć dwa wiązania jonowe (z grupami enolowymi) i cztery koordynacyjne (z atomami
azotu).

Aminokwasy ogrzewane w środowisku kwaśnym z nadmiarem ninhydryny ulegają

dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. W wyniku tego aminokwas przekształca się w
niższy (uboższy o jeden atom węgla w cząsteczce od wyjściowego aminokwasu) aldehyd,
uwalnia się CO

2

i wydziela NH

3

. Równocześnie następuje redukcja ninhydryny. Z kolei

zredukowana ninhydryna wchodzi w reakcję z nadmiarem ninhydryny niezredukowanej i
amoniakiem tworząc związek o zabarwieniu niebieskim.

Aminokwasy pod działaniem kwasu azotowego (III) przechodzą w hydroksykwasy,

przy czym azot aminokwasu (grupy aminowej) i kwasu azotowego (III) wydziela się w
postaci gazowej w ilości 1 cząsteczki na każdą grupę aminową i może być oznaczony
objętościowo:

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

2

Aminokwasy aromatyczne ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze

stężonym kwasem azotowym, dając żółto zabarwione nitrowe pochodne (fenyloalanina
wymaga do nitrowania dodatku H

2

SO

4

). Po zalkalizowaniu powstałe związki nitrowe ulegają

redukcji do amin, przyjmując równocześnie zabarwienie pomarańczowe.

Reakcja Millona zachodzi pod wpływem odczynnika Millona, który zawiera w swym

składzie jony rtęciowe (I) i (II), azotowe (III) i (V). Powstające w wyniku reakcji czerwone
zabarwienie pochodzi od kompleksu rtęciowo– fenolowo– nitrozowego. Reakcję tę daje
zarówno wolna tyrozyna, jak i związana w bialku.

W roztworach alkaliów z grupy tiolowej cysteiny oraz ugrupowania dwusiarczkowego

cystyny odszczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczkowych
S

2-

. Obecność tych jonów można wykryć za pomocą reakcji z roztworem octanu ołowiu (II).

Powstaje wówczas siarczek ołowiu (II), który wytrąca się w postaci czarnego osadu. Reakcję
tę daje zarówno cystyna i cysteina w postaci wolnej, jak i związana w białku.

W przeciwieństwie do cysteiny i cystyny siarka zawarta w cząsteczkach metioniny nie

ulega uwolnieniu w środowisku alkalicznym. Metioninę wykrywa się przy użyciu
nitroprusydku sodu w obecności glicyny. Pojawiające się różowo- brunatne zabarwienie
ś

wiadczy obecności metioniny w roztworze.

Reakcje na obecność tryptofanu są charakterystyczne dla występującego w nim układu

indolowego oraz jego reszt zawartych w różnych substancjach białkowych. Związki
zawierające ten układ dają w środowisku stężonych kwasów mineralnych z aldehydami
produkty kondensacji o zabarwieniu fioletowym.

Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1:

reakcja na wiązania peptydowe (reakcja biuretowa)

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać równą objętość 10% NaOH i parę kropli

1% CuSO

4

. Należy unikać nadmiaru CuSO

4

, ponieważ niebieska barwa

wodorotlenku miedziowego maskuje właściwy odczyn. Reakcję powtórzyć dla
dowolnego aminokwasu. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.

Podzadanie 2: reakcja ninhydrynowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego i do 1 ml 0,1% roztworu aminokwasu dodać

po 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Probówkę ogrzać do wrzenia.
Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.

Podzadanie 3: reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (iii) - dezaminacja

aminokwasów

Do 2 ml 10% NaNO

2

dodać 2 ml 2M CH

3

COOH i 0,5 ml 0,5% roztworu glicyny.

Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.

Podzadanie 4:

reakcja ksantoproteinowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml stężonego kwasu azotowego.

Ogrzać w ciągu 30 sekund. Zaobserwować zmianę zabarwienia roztworu. Po
ostudzeniu wprowadzić w nadmiarze 30% NaOH (lub roztwór stężonego amoniaku
w ilości około 2-3 ml). UWAGA! Reakcja silnie egzotermiczna. Zapisz obserwację
i wyciągnij odpowiednie wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu
tyrozyny.

Biochemia dla Biologii nr ETCS

Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek

Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii

Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii

3

Podzadanie 5: reakcja Millona – wykrywanie tyrozyny

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli odczynnika Millona i

ostrożnie ogrzać nad płomieniem. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie
wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu tyrozyny.

Podzadanie 6: reakcja cystynowa – wykrywanie cysteiny i cystyny

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 30% roztworu NaOH i ogrzewać

do wrzenia przez kilka minut. Następnie wprowadzić kilka kropel roztworu
Pb(CH

3

COO)

2

i ponownie ogrzać. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie

wnioski.

Podzadanie 7:

wykrywanie metioniny metodą mcCarthy- Sullivana

Do 2,5 ml 1% roztworu metioniny dodać 0,5 ml 30% NaOH, 3 krople 2% roztworu

nitroprusydku sodu oraz 0,5 ml 1% roztworu glicyny. Równocześnie w drugiej
probówce wykonać próbę ślepą używając wody destylowanej zamiast metioniny.
Obie probówki umieścić w łaźni o temperaturze 60°C i pozostawić na 10 minut.
Następnie oziębić i dodać 2 ml stężonego HCl. Zapisz obserwację i wyciągnij
odpowiednie wnioski.

Podzadanie 8:

reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa – wykrywanie tryptofanu

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% kwasu mrówkowego.

Po wymieszaniu, roztwór podwarstwić stężonym roztworem H

2

SO

4

. Zapisz

obserwację i wyciągnij odpowiednie wnioski.

LITERATURA

1. Biochemia”, L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze

2. „Biochemia Harpera”, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze

3. Cytobiochemia”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002

4. Biochemia- Krótkie Wykłady”, B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002

5. „Naturalne związki organiczne”, A. Kołodziejczyk, PWN, Warszawa 2003

6. Biochemia kręgowców”, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 1998, 2004

7. Ćwiczenia z biochemii”, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003