Techniki molekularne wykład nr 7 23.11.2010

Eukariotyczny genom jądrowy składa się ze zbioru liniowych (co najmniej 2) cząsteczek DNA, które
znajdują się w chromosomach. Zmienność dotyczy liczby chromosomów i wielkości genomu, ale nie są one
skorelowane z właściwościami biologicznymi organizmu. Paradoks wartości C- brak korelacji między
złożonością organizmu i wielkością genomu. Różnice te są efektem niejednorodności zdarzeń
ewolucyjnych, które towarzyszyły formowaniu różnych genomów. W genomach organizmów mniej
złożonych przestrzeń jest wykorzystywana oszczędniej, ponieważ geny leżą bliżej siebie.

DNA eukariontów jest upakowane w chromosomach . W upakowaniu uczestniczą białka histonowe i wraz z
DNA tworzą chromatynę. Podstawową jednostką jest nukleosom: oktametr białek histonowych z 140-150
pz DNA bezpośrednio z nim oddziałujących i 50-70 par zasad DNA łącznikowego. Nukleosomy wraz z
histonem łącznikowym tworzą chromatosom.

Strukturą wyższego rzędu jest włókno 30nm (modele solenoidowy i skręconej wstęgi)- jest to
prawdopodobnie główny typ chromatyny w jądrze interfazowym.

W jądrze komórkowym występują 2 wyraźnie różne frakcje chromatyny
- rozluźniona -.euchromatyna, bogata w transkrybowane geny, zawiera stosunkowo niewiele sekwencji
powtarzalnych
- skondensowana- heterochromatyna

Heterochromatyna konstytutywna występuje przede wszystkim w telomerach i centromerach, zbudowana
głównie z sekwencji powtarzalnych, nie kodujących białek ani RNA.

Heterochromatyna fakultatywna- euchromatyna ulegająca odwracalnej kondensacji, jej lokalizacja w
chromosomach jest różna u różnych organizmów, zależy od rodzaju tkanki i fazy rozwojowej. Obejmuje
sekwencje kodujące, które pozostają wyciszone i są nieaktywne transkrypcyjnie.

Nukleosomowa organizacja jądrowego DNA i wyższego rzędu struktury chromatynowe są istotnym
elementem w systemie regulacji transkrypcji u Eucaryota. Nukleosomy stanowią przeszkodę w transkrypcji.
Przyczyną jest blokowanie dostępu czynników transkrypcyjnych do odpowiednich sekwencji DNA.
Regulacja dostępności DNA poprzez remodelowanie histonów
- zmiana struktury nukleosomu
- przesunięcie fizyczne
- przeniesienie- zmiana pozycji

Przejście między aktywną transkrypcyjnie euchromatyną, a nieaktywną i nidostepną heterochromatyną jest
regulowane przez
- modyfikacje chemiczne histonów (acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja)
- metylację DNA
- białka niehistonowe-> m.in. HP1= z tzw. chromodomeną, rozpoznają metylowany DNA i łącząc się z nim
utrwalają stan heterochromatynizacji. Polycomb- indukują rozprzestrzenianie struktur niedostępnych
transkrypcyjnie; antagonistycznie działają białka należące do grupy Trithorax (Trx)
- miRNA, dsRNA inicjują zmiany w strukturze chromatyny poprzez indukowanie modyfikacji histonów i
DNA w locus, w którym znajduje się sekwencja do której są komplementarne. Efektem jest wyciszanie
transkrypcyjne
Podczas podziału tworzą się chromosomy metafazowe- każdy zbudowany z 2 kopii cząsteczki DNA- 2
chromatyd połączonych w centromerze, którego pozycja wyznacza długość ramion- można w ten sposób
rozróżniać chromosomy.

Rozróżnianie chromosomów umożliwia barwienie różnicowe- różne wzory prążków. Zestaw chromosomów
danego organizmu można przedstawić w postaci kariogramu.

Oprócz typowych chromosomów u niektórych organizmów występują również

- minichromosomy- mają stosunkowo niewielką wielkość, są bogate w geny (6x większa gęstość) i
towarzyszą makrochromosomom, np. u kury (6 makro i 33 mini).
- chromosomy B pojawiające się u niektórych osobników w populacji, najpowszechniej występują u roślin,
ale ich obecność stwierdzono również u grzybów, owadów i innych zwierząt. Wydają się być
fragmentaryczną wersją normalnych chromosomów, często niosą geny rRNA, ale nie wiadomo czy są one
aktywne, u roślin ich występowaniu towarzyszy obniżona żywotność, ich udział w populacji spada, są
gubione w wyniku nieregularności dziedziczenia.
-chromosomy holocentryczne mają wiele centromerów, zamiast jednego

Specyficzne rodzaje chromosomów
- szczoteczkowy zawiera liczne pętle boczne, będące miejscem intensywnej syntezy RNA, pętle nadają
wygląd szczoteczki
- poligeniczny powstają w wyniku kilkakrotnej endoreplikacji chromosomowego DNA, po której nie
następują podziały

Ważne elementy chromosomów to telomery i centromery. W centromerach jest dużo repetytywnego DNA i
trudno dobrze zsekwnecjonować te regiony.
U drożdży S. cerevisiae DNA centromerowy, oddziałujący z białkami kinetochoru ma długość ok. 125 bp,
ale u większości innych Euc. centromerowy region DNA jest znacznie dłuższy i złożony z powtarzających
się sekwencji DNA. U Arabidopsis thaliana centromery mają od 0,9 do 1,2 Mpz (powt. się sekw. 180pz). U
człowieka sekwencją powtórzoną jest DNA typu α 1500-30000 na centromer. Zagęszczenie genów w tym
obszarze wynosi 7-9 na 100kb, w porównaniu z 25 na 100kb w pozostałych regionach. Dopóki nie odkryto
genów w tych obszarach uznawano te regiony za nieaktywne.

Centromery wyższych eukariontów zawierają nukleosomy, które zamiast histonu H3 zawierają białko
CENP- A(CenH3), są one bardziej zwarte i sztywniejsze. Sugeruje się, że nukleosomy CENP-A znajdują się
na powierzchni centromeru, gdzie tworzą zewnętrzną powłokę, na której zbudowany jest kinetochor-
struktura białkowa stanowiąca miejsce przytwierdzenia mikrotubul uczestnicząca w przemieszczeniu
chromosomów na bieguny komórki w trakcie podziału.

Drugim istotnym elementem chromosomu są telomery, które wyznaczają prawidłowe końce chromosomów
i pozwalają na rozróżnienie ich od końców nieprawidłowych powstających w wyniku pękania
chromosomów. Telomerowy DNA u człowieka tworzą setki kopii powtórzonego motywu 5’- TTAGGG-3’,
z krótkim wystającym jednoniciowym odcinkiem 3’ na końcu dwuniciowej cząsteczki. U człowieka z
sekwencją telomerów wiążą się 2 białka: TRF1 (pomaga regulować długość telomeru) i TRF2 (utrzymuje
wystające jednoniciowe odcinki). Inne białka telomerowe uczestniczą w zakotwiczeniu chromosomów w
peryferyjnych obszarach jądra.

W DNA jądrowym eukariontów możemy wyróżnić kilka rodzajów sekwencji. Są to
- geny unikatowe (kodujące białka i niektóre rodzaje RNA)
- sekwencje regulatorowe (np. promotory, wyciszacze, wzmacniacze)
- niekodujące sekwencje o nieznanej funkcji
- sekwencje powtarzalne, do których należą m.in. transpozony i retrotranspozony

Analiza odczytanych dotychczas kompletnych sekwencji genomów organizmów Euc. wskazuje, że znaczna
część DNA obecnego w jądrze komórkowym nie koduje białek.

Porównanie katalogów genów na podstawie funkcji genów w genomie sugerują, że wszystkie eukarionty
mają taki sam podstawowy zestaw genów, ale bardziej złożone gatunki mają większą liczbę genów w każdej
kategorii funkcjonalnej. Wiele genów jest zorganizowanych w rodziny genowe- mają one podobne lub
identyczne sekwencje i np. ulegają ekspresji w różnych stadiach rozwojowych organizmu- jak geny
globinowe.

U eukariontów większość genów to geny nieciągłe. Fragmenty sekwencji kodujące białko lub RNA (rRNA,
tRNA)- eksony są poprzedzielane fragmentami niekodującymi- intronami. Biologiczny sens istnienia genów

podzielonych wynika ze znacznie większej plastyczności ewolucyjnej takiego systemu w porównaniu z
ciągłymi genami prokariontów. Eksony często odpowiadają strukturalnym i funkcjonalnym domenom
białek, są zatem genetycznymi modułami konstrukcyjnymi, z których w procesie ewolucji mogą powstawać
białka o bardzo różnorodnych funkcjach. Introny ułatwiają przestawianie eksonów na drodze rekombinacji.
Obecność intronów umożliwia alternatywny splicing- składania eksonów na różne sposoby, dzięki temu
jeden gen koduje kilka białek. 60% genów w genomie człowieka ulega alternatywnemu splicingowi.

Jądrowe genomy euk. zawierają relikty ewolucyjne- nieaktywne formy genów
- pseudogeny-> niefunkcjonalne kopie genów, które uległy inaktywacji, gdyż ich sekwencja nukleotydowa
została zmieniona w wyniku mutacji
- retropseudogeny-> nieprawidłowy produkt uboczny ekspresji genu, powstaje z kopii mRNA poprzez
syntezę cDNA, która jest następnie wstawiana do genomu. Brak intronów i sekwencji regulatorowych
- geny skrócone-> brak któregoś z końców
- fragmenty genów-> krótkie izolowane regiony pochodzące z genu

Genomy eukariotyczne, a w mniejszym stopniu również prokariotyczne zawierają elementy powtórzone.
Powtarzający się DNA można podzielić na 2 kategorie
- powtórzenia tandemowe (ok. 10%)-> powtarzające się jednostki tworzą szeregi (bloki), zaliczamy tu DNA
satelitarny znajdujący się w centromerach, minisatelity- DNA telomerowi oraz mikrosatelity. Tandemowo
powtórzone sekwencje DNA powstały w wyniku ekspansji sekwencji wyjściowej na skutek błędów w
trakcie replikacji i rekombinacji DNA
- powtórzenia rozproszone w genomie (40-45%)-> powtarzające się jednostki są rozmieszczone w całym
genomie losowo, wykazują aktywność transkrypcyjną , wiele z nich to transpozony mające zdolność do
przemieszczania się. Powtórzenia rozproszone są efektem transpozycji i mogą pochodzić od wirusów.

DNA powtórzony tandemowo zwany jest satelitarnym, tworzy satelitarne prążki podczas frakcjonowania
DNA poprzez wirowanie w gradiencie gęstości np. DNA człowieka po rozbiciu na fragmenty długości 50-
100kb tworzy główny prążek (gęstość pławna 1,701 g/cm3 i 3 prążki satelitarne 1,687, 1,693 i 1,697).
Główny prążek zawiera fragmenty DNA utworzone przeważnie z sekwencji o pojedynczych kopiach o
zawartości zasad GC ok. 40,3% -średniej dla genomu człowieka. Prążki satelitarne zawierają fragmenty
powtarzającego się DNA, których zawartość GC (wyższa) i gęstość pławna są nietypowe dla całego
genomu.

Niektóre DNA satelitarne są rozrzucone w genomie, to jednak większość znajduje się w okolicach
centromerów. Długość powtórzonych jednostek wynosi do 200pz (inni autorzy do 5000).

Należy tutaj kilka rodzin sekwencji np.
- α satelitarny DNA -> dominuje w genomie człowieka i sekwencje tej rodziny występują w centromerach
wszystkich chromosomów
- sekwencje β satelitarne zwane rodziną Sau3A

Inny DNA powtórzony tandemowo, ale nie występujący w prążkach satelitarnych gradientu gęstości
- minisatelity-> jednostki powtarzające się mają długość od 6-25pz (wg innych autorów do 100), tworzą
zgrupowania długości 20kb- większość minisatelit występuje w regionach telomerowych, są bardziej
rozproszone w genomie niż satelitarne DNA
- mikrosatelity-> jednostka powtarzająca się ma długość od 1-6pz, tworzą zgrupowania długości 150-200pz,
są efektem błędów w czasie replikacji, ich funkcja jest nieznana. Charakteryzuje je b. duża zmienność
wynikająca z różnej liczby powtórzonych jednostek

Powtórzenia rozproszone
Rozproszone i przypadkowe rozmieszczenie w genomie jest efektem transpozycji- procesu przemieszczenia
odcinków DNA. Odcinki DNA zdolne do przemieszczania się z jednego miejsca w obrębie genomu do
innego nazywamy genetycznymi elementami ruchomymi-> elementami transpozycyjnymi-> transpozonami.
Zostały one odkryte przez McClintock w latach 40 XX w podczas badań nad kukurydzą. Stwierdziła ona
występowanie niestabilnych mutacji barwy aleuronu ziarniaków kukurydzy.

Rodzaje transpozycji
- konserwatywna-> wycięcie i wstawienie elementu w innym miejscu- przemieszczeniu odcinka DNA nie
towarzyszy zwiększenie liczby kopii- efekt to zmiana pozycji w genomie
- replikacyjna-> wyjściowy element pozostaje na miejscu, a w nowe miejsce wstawiana jest kopia- proces
ten prowadzi do namnażania się transpozonu w pozycjach rozproszonych w całym genomie.

Elementy ruchome można podzielić na dwie główne klasy:



Elementy klasy I (retro elementy)

Występują u Euc. nie wykryto ich u Proc. W czasie ich transkrypcji jako produkt pośredni powstaje RNA,
które jest odwrotnie transkrybowanie przez odwrotną transkryptazę na DNA. Mogą się kopiować i wstawiać
swoje kopie w dowolne miejsce w genomie. Elementy klasy I posiadają kompletne sekwencje kodujące i nie
zawierają intronów.
Niektóre rozproszone powtórzenia wyraźnie pochodzą od wirusów. Proces retro transpozycji jest niemal
identyczny z replikacją retroelementów wirusowych, tyle że transpozycja rozpoczyna się od transkrypcji
endogennej sekwencji genomowej, a nie z egzogennego genomu wirusa.

Specyficzny mechanizm transpozycji pozwala na wyróżnienie 2 podklas w obrębie tej klasy:
- retrotranspozony pochodzenia wiralnego – posiadające długie końcowe powtórzenia (LTR)
- retrotranspozony niewiralne – nie posiadające LTR – retropozony

Retrotranspozony pochodzenia wiralnego
Kodują własną odwrotna transkryptazę i zawieraja LTR. Mają one długość 6-11 kb. Stanowią istotną częsć
wielu genomów eukariotycznych, szczególnie roślinnych.
1. Grupa copia: Tyl u drożdży, copia u Drosophila melanogaster , BARE-1 u zbóż.
2. Grupa gypsy: Ty-3 u drożdży i gypsy u D. melanogaster.

Retrotranspozony niewiralne, retropozony.
Nie zawierają terminalnych powtórzeń LTR. Dzielą się na dwie grupy:
1. LINEs (z ang. Long Interspersed Nuklear Elements) długości 1-8 kb, zawierają jedno lub dwa ORFs.
Przykładem tych elementów u rośli jest Cin4 u kukurydzy. U człowieka retropozonów LINE jest ponad mln
kopii, mają długość 6,1 kb, posiadaja 2 geny, stanowią ponad 20% genomu.
2. SINE (z ang. Short INterspersed transponsable Eleements) długości 100-400 pz, nie zawierają sekwencji
kodujących, wykorzystują odwrotna transkryptazę kodowaną przez inne elementy.
Większość SINE należy do rodziny sekwencji Alu, które nazwano od enzymu restrykcyjnego AluI. Są
bardzo powszechne u Euc. Mają największa liczbę kopii spośród wszystkich typów rozproszonego
powtarzającego się DNA w genomie człowieka. Jest ich ponad 1,7 mln kopii i zajmują 14% genomu.
Ulegają transkrypcji i transpozycji.



Elementy klasy II – Transpozony DNA

Występują u wszystkich organizmów, u Euc. rzadko, u Proc. powszechnie. Zostały odkryte u kukurydzy.
Posiadają konserwatywny model transpozycji i replikacji. Wycięciu i ponownej integracji ulega, jeden i ten
sam element. Produktem pośrednim transpozycji jest DNA. Są to elementy różnej długości, max. ok. 10 kb.
Wszystkie zawierają gen transpozazy, a na obu końcach oflankowane są odwróconymi powtórkami
sekwencji (IR). Rozpoznanie IR przez transpozazę jest niezbędne do przemieszczania.
Podczas insercji elementu przy obu końcach IR powstają krótkei duplikacje sekwencji genomu (DR).
Większość elementów pozostawia po wycięciu ślad, tzw. „odcisk stopy”, charakterystyczny dla danego typu
transpozonu.

Wśród elementów tej grupy wyróżniamy:
- strukturalnei konserwatywne elementy autonomiczne, które mogą promować własne wycięcie i
wstawienie do genomu gospodarza
- heterogenną grupę elementów nieautonomicznych, które zdolne są do przemieszczania jedynie w
obecności transpozazy kodowanej przez elementy autonomiczne

jako pierwsza w tej grupie została opisana rodzina elementów Ac/Ds (Activator/Disactivator) u kukurydzy.
Transpozon Ac koduje transpozazę, która rozpoznaje terminalnie odwrócone powtórki elementu (TIR) i w
tym miejscu go wycina. Pozwala także na integrację z miejscem docelowym.
Elementy Ds są wadliwą forma Ac, posiadają terminalne powtórki TIR, ale nie kodują transpozazy w
wyniku delecji wewnętrznych sekwencji.