Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii
Katedra Biologii Molekularnej
Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią

Biologia II rok

========================================================

Ćwiczenie 1

Sekwencjonowanie DNA

Prowadzący: mgr Michalina Filipiak i mgr Karolina Sawiuk

Sekwencjonowanie jest techniką umożliwiającą określenie kolejności nukleotydów w

analizowanym fragmencie DNA. Przełom nad pracami przyniósł rok 1977, w którym

opublikowano dwie metody:

A) chemicznej degradacji DNA, znanej jako metoda Maxama i Gilberta

B) kontrolowanej terminacji replikacji (zwana również metodą dideoksy) Sangera i

Coulsona

A) Metoda opracowana przez Maxama i Gilberta, polega na degradacji wyznakowanych

na końcu 3’ lub 5’ cząsteczek DNA odczynnikami atakującymi specyficznie wiązania

fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym odpowiedniej zasadzie azotowej.

Warunki reakcji są tak ustalone, że w poszczególnych cząsteczkach zostaje przecięte

jedno lub dwa wiązania, przez co otrzymuje się zbiór fragmentów DNA o różnej

długości. Równolegle w czterech probówkach prowadzi się reakcje modyfikacji dla

nukleotydów: G, A + G, T + C i C. Stosuje się tutaj reakcje dla A + G, T + C,

ponieważ uzyskanie specyficznej degradacji w pozycji A i T jest bardzo trudne.

Uzyskane fragmenty rozdzielane są w żelach poliakrylamidowych i poddawane

autoradiografii. Na autoradiogramie widoczne są tylko prążki odpowiadające

fragmentom zaczynającym się od wyznakowanego końca 3’ lub 5’, ułożone w postaci

drabinki, w której każdy kolejny szczebel odpowiada fragmentom różniącym się od

otaczających go o jeden nukleotyd.

Miejsce cięcia

Związki chemiczne

G

siarczan dimetylu + piperydyna

G + A

siarczan dimetylu + piperydyna +

kwas mrówkowy

C

hydrazyna/chlorek sodu + piperydyna

C + T

hydrazyna + piperydyna

Piperydyna powoduje degradację wiązań

N-glikozydowych i fosfodiestrowych, co wykorzystywane

jest w metodzie sekwencjonowania DNA

według Maxama-Gilberta.

Autoradiogram- obraz różnych frakcji DNA w formie ciemnych prążków na wywołanej

kliszy. Najmniejszym cząsteczkom odpowiadają prążki położone najdalej od jednej z

krawędzi kliszy (odpowiadającej miejscu naniesienia próbek na żel).

B) Drugą, częściej obecnie stosowaną, metodę sekwencjonowania DNA opracował

zespół F. Sangera. Metoda ta polega na analizie produktów syntezy in vitro DNA na

jednoniciowej matrycy, począwszy od przygotowanego oligonukleotydowego startera,

komplementarnego do końca 3’ matrycy. Równolegle stosuje się cztery różne

mieszaniny reakcyjne, przy czym każda zawiera tylko jeden z czterech 2’,3’-

dideoksynukleotydów. Gdy 2’,3’-dideoksynukleotyd zostanie wbudowany w

cząsteczkę DNA (w miejsce odpowiedniego nukleotydu) następuje terminacja syntezy

w pozycji, w której został włączony do rosnącej nici. Cztery zbiory fragmenów o

zakończonym łańcuchu poddaje się następnie elektroforezie i odczytuje sekwencję

zasad DNA z czterech ścieżek na autoradiogramie.

Skład mieszaniny reakcyjnej:



ta sama matryca



starter



mieszanina deoksyrybonukleotydów (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)



bufor



polimeraza DNA



jeden z ddNTP, będących analogami dNTP (odpowiednio: ddATP, ddTTP, ddCTP,
ddGTP)

Dideoksynukleotydy to zmodyfikowane nukleotydy, pozbawione grupy hydroksylowej w

pozycji 3' deoksyrybozy. Zmiana ta uniemożliwia dalszą syntezę nici DNA. Co więcej,

zatrzymanie wydłużania łańcucha nukleotydowego następuje zawsze w pozycji zajmowanej

przez ten sam dideoksynukleotyd.

Nowoczesne sekwencjonowanie metodą Sangera (metoda dideoksy pochodnych)

wykorzystuje dideoksynukleotydy wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi. Reakcja

przypomina standardową reakcję PCR z matrycą (zazwyczaj dsDNA) i polimerazą DNA,

jednak wykorzystywany jest tylko jeden starter komplementarny do sekwencji powyżej

fragmentu ulegającego sekwencjonowaniu. Dodatkowo poza mieszaniną trójfosforanów

deoksyrybonukleotydów (dNTPs), w niewielkim stężeniu występują również trójfosforany

dideoksyrybonukleotydów (ddNTPs), gdzie każdy wyznakowany jest innym barwnikiem

fluorescencyjnym. W takiej reakcji, starter zostaje wydlużony do czasu kiedy wbudowany

zostanie ddNTP. W tym momencie dalsze wydłużanie jest niemożliwe i fragment DNA o

określonej długości „wyznakowany” zostaje barwnikiem związanym z danym ddNTP. W

jednej probówce, po określonej liczbie cykli powstaje mieszanina jednoniciowych

fragmentów DNA o różnej długości i każdy zakończony jest ddNTP. Ta mieszanina

rozdzielana jest przy pomocy elektroforezy w kapilarze. Fluorescencja sczytywana jest przy

użyciu lasera do wzbudzenia i rejestratora. Każdy barwnik użyty do znakowania ddNTP

emituje światło o innej długości fali (kolorze). Program obsługującey urządzenie, każdemu

odczytowi przypisuje odpowiedni nukleotyd i generuje chromatogram (obrazek poniżej), na

którym odczyt długości fali przedstawiony jest w postaci kolorowej linii (przykładowo: A –

zielony, T – czerwony, C – niebieski, G – czarny).

Przykładowe wyniki sekwencjonowania z różnych matryc DNA (Homo sapiens i Saccharomyces cerevisiae)

Nowoczesne metody sekwencjonowania (Next Generation Sequencing)

Rozwój metod sekwencjonowania kwasów nukleinowych dąży w kierunku wysokiej

przepustowości (high throughput). Pozwala to na jednoczesną analizę wielu krótkich

sekwencji i zestawienie ich przy użyciu bioinformatyki. Trendy w unowocześnianiu

sekwencjonowania można opisać słowami: szybciej, więcej, taniej. W poniższej tabeli

przedstawione jest zestawienie zalet i wad nowoczesnych metod sekwencjonowania (tzw.

Next Generation Sequencing, NGS). Poza metodami sekwencjonowania DNA, w ostatnich

latach wynaleziono metode bezpośredniego sekwencjonowania RNA (Direct RNA

Sequencing).

Tabela przedstawiająca podsumowanie nowoczesnych metod wykorzystywanych do sekwencjonowania
DNA.

Sekwencjonowanie pojedyńczej cząsteczki w czasie rzeczywistym – SMRT (Single-

molecule real-time sequencing)

Wykorzystuje sekwencjonowanie przez syntezę. Reakcja przeprowadzana jest w studzienkach

w których na dnie przymocowana chemicznie jest polimeraza DNA. Wyznakowane

fluorescencyjnie nukleotydy DNA występują w mieszaninie reakcyjnej. Konstrukcja

studzienki pozwala na odczyt fluorescencji jedynie na dnie studzienki (poziomie polimerazy

DNA). Podczas syntezy, barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z łańcucha DNA.

Odczyt fluorescencji w pozycji polimerazy pozwala na identyfikacje nukleotydy, który jest

aktualnie wbudowywany do syntetyzowanego łańcucha DNA.

Sekwencjonowanie z użyciem jonowego pólprzewodnika – (Ion semiconductor

sequencing)

Jest to technika wynaleziona i opracowana przez firmę Ion Torrent Systems Inc. Metoda

wykorzystuje standardowa chemię reakcji PCR. Podstawą jest detekcja jonu wodorowego

uwalnianego podczas syntezy DNA. Studzienka reakcyjna wypelniona jest mieszaniną

zawierającą jeden typ nukleotydu w danym momencie, polimerazą DNA i matrycowym

fragmentem DNA (który ulega sekwencjonowaniu). Po każdym cyklu mieszanina zmienia się

na nową z innym typem nukleotydu (np. 1 cykl - dATP, 2 cykl - dTTP, 3 cykl - dCTP, 4 cykl

- dGTP). Detekcja uwolnionego jonu wodorowego oznacza, że w danych warunkach (tzn.

kiedy w reakcji był okreslony nukleotyd) doszło do syntezy DNA.

Pirosekwencjonowanie (Pyrosequencing, 454 sequencing)

Metoda wykorzystuje standardową amplifikację za pomocą PCR (podobnie jak wyżej) z

mieszaniną reakcyjną, która również zawiera pojedyńczy nukleotyd. Należy zaznaczyć, że

mimo kolejności opisu w tym skrypcie, pirosekwencjonowanie jest starszą metodą niż

opisana metoda Ion Torrent Systems. Wykorzystywany jest starter który jest wydłużany w

kolejnych cyklach, o ile w mieszaninie znajduje się nukleotyd komplementarny do matrycy.

Podczas syntezy uwalniany jest fosforan organiczny, który pośrednio umożliwia

wygenerowanie światła przez enzym lucyferazę. Detekcja światła oznacza, że w danych

warunkach zaszła synteza DNA.

Sekwencjonowanie na platformie Illumina (Solexa) – Illumina (Solexa) sequencing

Metoda wykorzystuje odwracalnie zmodyfikowane nukleotydy, jednak wszystkie występują

w jednej mieszaninie. Modyfikacja zawiera barwnik fluorescencyjny umożliwiający detekcje

nukleotydy, jak również zapobiega dalszej elongacji. Po etapie syntezy, czyli addycji

nukleotydu, fluorescencja jest sczytywana, a następnie wykorzysuje się enzymy do usunięcia

modyfikacji i odpłukuje pozostałości reakcji. Podczas kolejnego cyklu dodany zostaje nowy

nukleotyd, odczytana zostaje fluorescencja i dochodzi do recyklingu (usunięcia) modyfikacji.

Wybrane, opisane powyżej metody są w pełni zautomatyzowane. W niektórych zachodzi

jedynie potrzeba uprzedniego przygotowania „biblioteki” np. poprzez ligację odpowiednich

adapterów na końcach fragmentów DNA. Należy również dodać, że zarówno wygenerowanie

danych, jak również ich dalsza analiza często wymaga zaawansowanych narzędzi

bioinformatycznych. Zautomatyzowane metody odczytu sekwencji pozwoliło na szybki

postęp w dziedzinie sekwencjonowania całych genomów. W 1995 poznano pierwsze genomy

bakterii (Haemophilus influenzae i Mycoplasma genitalium), w 1997 genom pierwszego

eukarionta - drożdży piekarskich (Saccharomyces cerevisiae), w 1998 genom pierwszego

organizmu wielokomórkowego nicienia Caenorhabditis elegans, w 2000 genom muszki

owocowej (Drosophila melanogaster). W lutym 2001 niezależnie Human Genome Project i

Celera Genomics opublikowali sekwencję ok. 3 miliardów nukleotydów genomu ludzkiego

(tj. ok. 90% genomu ludzkiego). W roku 2003 opublikowano dokument stwierdzający

zakończenie sekwencjonowania 99% genomu ludzkiego. W dzisiejszych czasach

sekwencjonowanie nie ogranicza się jedynie do analizy genomu. Pośrednio, poprzez analizę

cDNA, sekwencjonowaniu ulega transkryptom (sekwencja ulegająca transkrypcji na RNA)

organizmu lub komórki. Pozwala to m.in. na analizę ekspresji genu. Techniki

sekwencjonowania sa rozwijane i modyfikowane na bieżąco, tak że najnowsze osiągniecia w

tej dziedzinie pozwalają na analizę transkryptomu pojedyńczej komórki.

Dlaczego badania nad ludzkim genomem są tak ważne?

PERSPEKTYWY WYKORZYSTANIA

1.Rozwój bioinformatyki- dział informatyki zajmujący się badaniem DNA

2. Opracowanie mikromacierzy. Płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych

pozycjach mikroskopowej wielkości polami, zawierającymi różniące się od siebie sekwencją

fragmenty DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację

komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA.

3. Rozwój biologii ewolucyjnej- możliwość porównywania genomu ludzkiego z genomami

innych organizmów.

4. Rozpoznanie, jakie geny są odpowiedzialne za powstawanie, powiązanie i utrzymanie

systemu nerwowego- leczenie chorób neurologicznych.

5. Leczenie nowotworów.

Nowotwory są najczęściej spowodowane akumulacją kilku mutacji genowych, które aktywują

onkogeny. Zidentyfikowanie do tej pory ponad 100 onkogenów obrazuje zmiany powodujące

rozwój nowotworu. Niektóre nowotwory, choć wizualnie podobne, mają inny rozkład

ekspresji genów- poznanie ułatwia wybranie terapii.

6. Wprowadzenie metody „fingerprinting”. Metodę stosuje się w diagnostyce chorób

dziedzicznych (np. hemofilii, anemii sierpowatej, choroby Alzheimera, choroby

Huntingtona), w kryminalistyce do identyfikacji przestępców na podstawie pozostawionych

przez nich śladów biologicznych.

7. Rozwój badań nad uzależnieniami od narkotyków- kokaina wpływa na transportery

dopaminy, które różnią się u różnych ludzi.

ZNAKOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH

W pracach biologii molekularnej często zachodzi konieczność używania znakowanych

cząsteczek kwasów nukleinowych, czyli takich, które zawierają wbudowany radioaktywny

izotop lub znacznik nieradioaktywny, np. biotynę. Znakowany DNA lub RNA

wykorzystywany jest w takich technikach jak: testy hybrydyzacji, primer extension, foot-

printing, EMSA, RNA protection, sekwencjonowanie i wiele innych.

1. Najczęściej wykorzystywanymi znacznikami kwasów nukleinowych są radioaktywne

izotopy

32

P i

35

S,

3

H oraz związki nieradioaktywne, takie jak: biotyna, digoksygenina,

fluoresceina, rodamina, kumaryna. Wybór znacznika zależy głównie od czułości i

rozdzielczości testu, do którego zostanie użyty znakowany DNA, a także od trwałości

znacznika i bezpieczeństwa pracy.

2. Detekcja znaczników.

a. Znaczniki radioaktywne. Identyfikacja opiera się na detekcji promieniowania β.

Promieniowanie to można zlokalizować, wykonując ekspozycję sygnału do na błonie

radiologicznej lub z wykorzystaniem specjalistycznego sprzętu (licznik

scyntylacyjny).

b. Znaczniki nieradioaktywne. Obecność tych znaczników można zidentyfikować na

podstawie ich aktywności własnej (bezpośrednie) lub aktywności enzymów

połączonych ze znacznikiem (pośrednie)

- bezpośrednie. Związki wbudowane do DNA, takie jak rodamina, kumaryna,

fluoresceina, charakteryzują się zdolnością do emisji światła o określonej długości

fali. Ich detekcja odbywa się przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.

- pośrednie. Oparte są na technikach enzymatycznych. Znaczniki rozpoznawane są

przez specyficzne przeciwciała (ew. streptawidynę w przypadku biotyny) sprzężone z

enzymami takimi jak alkaliczna fosfataza, peroksydaza. Enzymy te po przyłączeniu

się do znacznika katalizują reakcje, które prowadzą do luminescencji lub powstania

barwnych produktów.

Przebieg ćwiczenia:

Omówienie metod sekwencjonowania.

Odczytywanie sekwencji z autoradiogramu.

Rozpoznawanie polimorfizmów na chromatogramie (wyniki minisekwencjonowania).

Zagadnienia do przygotowania

Etapy reakcji sekwencjonowania.

Modyfikacje nukleotydów stosowane w metodzie Maxama i Gilberta.

Modyfikacje klasycznych metod sekwencjonowania oraz alternatywne techniki.

Znaczniki fluorescencyjne oraz pierwiastki radioaktywne najczęściej stosowane w

znakowaniu starterów lub dNTPs.

Na czy polega strategia „shotgun sequencing”(sekwencjonowanie losowe).

Sposoby uzyskania jednoniciowego DNA w przypadku sekwencjonowania metodą terminacji

łańcucha.

Literatura obowiązkowa

1. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 74(12): 5463–5467.

2. Venter J. Craig et al.(2001), The Sequence of the Human Genome, Science 291, 1304,

1304-1351,

3. Ivo Glynne Gut, Clin Transl Oncol (2013) 15:879–881

4. Brown T. A. Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2003

5. Genetyka molekularna, Praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego.

Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2000