Diagnostyka molekularna w medycynie

Wydział Lekarski II rok
Osoba prowadz

ąca: Dr n.biol. Anna Wawrocka

Diagnostyka molekularna chorób genetycznych

Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami
biologii molekularnej.

Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe.

Molekularne badania diagnostyczne pozwalają na szybką weryfikację rozpoznania
klinicznego i stanowią nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych
genetycznie.

Izolacja DNA

-

pełna krew obwodowa (limfocyty)

-

komórki płynu owodniowego (AFC)

-

komórki kosmówki (CVS)

-

hodowle fibroblastów

-

komórki epitelialne

-

cebulki włosów

-

plamy krwi, nasienia

-

fragmenty tkanek

-

szpik kostny

Metody izolacji DNA:

1.

Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów

2.

Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek

3.

Izolacja DNA poprzez zastosowanie gotowych zestawów dostępnych komercyjnie

Izolacja DNA z krwi obwodowej – metod

ą wysalania białek

Etapy:
1.

Liza komórek bezjądrzastych

2. Liza leukocytów
3. Odbiałczanie
4. Wytrącanie DNA alkoholem


PCR- (ang.polymerase chain reaction) reakcja ła

ńcuchowa polimerazy

Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i
funkcji genów.

Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.

Nagroda Nobla z chemii w 1993r.

Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro
szybkie powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu
reakcji odwrotnej transkrypcji).

Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z
których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA. Startery te
są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA

W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

- synteza nici komplementarnej 68-72°C

Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA
umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej
elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się
przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są
widoczne po naświetleniu światłem UV.

PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Polega ona na amplifikacji fragmentu
DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne),
a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

Multipleks PCR

jednorazowo można amplifikować
ok.10 markerów

można badać DNA zmieszany
i zdegradowany

Zastosowanie: duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje

Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide)

polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną
dla produktu PCR

sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany

Zastosowanie:
wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza

MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR)

Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA

Dwusiarczyn sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl

W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym
Porównanie próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia
metylację cytozyny

PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i
niemetylowanej.

Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS)
U podstaw patogentycznych PWS znajduje się regulacja ekspresji genów nazywana

rodzicielskim

piętnem genomowym. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu
15 pochodzącym od ojca, które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15
pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w tym samym cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od
matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.

Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS:
Kontrola- obecność kopii matczynej i ojcowskiej
PWS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej
AS - obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej

Sekwencjonowanie DNA, główne metody

Metoda enzymatyczna – polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA

Metoda chemiczna – znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi
dla poszczególnych zasad

Sekwencjonowanie DNA, metod

ą enzymatyczną

Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r.

Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-
dideoksynukleozydotrifosforanów (ddNTP). Wbudowanie ddNTP (terminatora) powoduje
zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. W każdej reakcji stosowany jest tylko jeden
nukleotyd terminujący.

Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. Net Generation Sequencing)

Pozwala na sekwencjonowanie setek milionów lub miliardów par zasad za jednym zamachem
(exom sequencing – sekwencjonowanie całego exomu- wszystkich sekwencji kodujących
genomu)

• Umożliwia sekwencjonowanie złożonej mieszaniny DNA

• Zazwyczaj generuje stosunkowo krótkie sekwencje

• Obróbka i składanie sekwencji wymagają dedykowanych programów i dużej mocy
obliczeniowej

• W praktyce od 2005 roku, cały czas testowane nowe rozwiązania

QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction)

QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji
chromosomowych). Jest to ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.

Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats)

Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na
drodze amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży

Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa
się za pomocą sekwenatora kapilarnego

MLPA (ang. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification)

“Analiza ilościowa typu Multiplex wielu genów jednocześnie”, Detekcja zmian liczby kopii 45
genomowych sekwencji DNA w jednej, prostej do przeprowadzenia reakcji PCR.
-Minimum 20 ng ludzkiego DNA lub 10-120 ng RNA
-Analiza częściowo zdegradowanego DNA

DNA ze skrawków parafinowych

Tkanek w formalinie

Płodowy DNA uzyskany z plazmy krwi matczynej.

-Rozróżnienie sekwencji które różnią się pojedynczym nukleotydem, detekcja znanych mutacji
oraz SNP (delecji lub duplikacji ale nie substytucji)
- metoda stosowana głównie do wykrywania delecji oraz duplikacji DNA

Hybrydyzacja (renaturacja) –
Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z
różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do
utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).

Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne oligomery
-syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty
-cDNA
-fragmenty chromosomów
-całe genomy bakteryjne


Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje

Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji -

mikromacierze do badania ekspresji genów

najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA

mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)

mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-do badania ekspresji obszarów
pozagenowych

mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- badanie ekspresji różnych
form splicingowych tego samego genu

mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)

mikromacierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA

Mikromacierze typu SNP

Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym
eksperymencie nawet kilkuset mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób
genetycznych.

Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych
oraz oceny ryzyka rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.

Mikromacierze ekspresyjne

Przykłady zastosowa

ń

Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:

w środowisku (np. podanie leku)

w genotypie (np. obecność transgenu)

Znajdowanie genów, których ekspresja różni się

między tkankami

podczas rozwoju

w tkance chorej i zdrowej

między gatunkami.