Ćwiczenia z immunologii.

Ćwiczenia dla III roku Farmacji

ĆWICZENIE I - Centralny i obwodowy układ limfatyczny.

Część teoretyczna:

1. Charakterystyka centralnego i obwodowego układu limfatycznego:

a) budowa i funkcja centralnych i obwodowych narządów limfatycznych;
b) komórki immunologicznie kompetentne –podział i funkcje;

2. Metody izolacji narządów układu limfatycznego, oraz komórek immunologicznie

kompetentnych.

Część praktyczna:

1. Izolacja leukocytów krwi obwodowej:

a) metodą lizy erytrocytów
b) metodą wirowania w gradieńcie Ficolu-Uropolina

2. Ocena żywotności i jednolitości uzyskanych leukocytów.
3. Różnicowanie i określanie aktywności poszczególnych subpopulacji leukocytów .
4. Określanie aktywności bójczej neutrofili krwi obwodowej za pomocą testu z błękitem

nitrotetrazoliowym, wykazanie zdolności do fagocytozy in vitro fagocytów.

ĆWICZENIE II - Odczyny serologiczne (część 1)

Część teoretyczna

1. Budowa i podział przeciwciał, antygenów, rola dopełniacza w mechanizmach

immunologicznych.

2. Mechanizmy reakcji antygen – przeciwciało:

a) odczyn percypitacji
b) odczyn aglutynacji: czynnej, biernej, hemoaglutynacji
c) odczyn wiązania dopełniacza

Część praktyczna
Odczyny serologiczne:

1. Percypitacja:

a) odczyn percypitacji pierścieniowej (probówkowej)

b) odczyn flokulacyjny- odczyn USR z antygenem kardiolipinowym dla kiły
c) immunodyfuzja płytkowa

2. Aglutynacji:

a) bezpośredniej:

- identyfikacja szczepu Salmonella do grupy serologicznej lub do serotypu

- identyfikacja szczepu Shigella do gatunku

b) pośrednia:

- identyfikacja szczepu Streptococcus do grupy serologicznej za pomocą zestawu Slidex
Strepto-kit

- identyfikacja szczepów Staphylococcus do gatunku za pomocą zestawu Slidex Staph-
kit

a) hemaglutynacja krwinek baranich wirusem grypy lub krwinek kurzych wirusem

NDV

1

ĆWICZENIE III - Odczyn serologiczne (część 2).

Część teoretyczna

1. Techniki odczynów immunoenzymatycznych i radioimmunologocznych.
2. Zastosowanie fluorescencji w immunologii.

Część praktyczna

1. Oznaczanie przeciwciał i antygenów grupowych krwi ludzkiej.
2. Immunoelektroforeza przeciwprądowa.
3. Test ELISA .

2

ĆWICZENIE I - Centralny i obwodowy układ limfatyczny.

I. Odporność wrodzona (nieswoista) i nabyta (swoista).

W otoczeniu naszym występują różne drobnoustroje chorobotwórcze: wirusy, bakterie,
grzyby, pasożyty. Każdy z nich wywołuje określone zmiany patologiczne w organizmie
człowieka i jeśli namnożą się w sposób nie kontrolowany to mogą spowodować śmierć
żywiciela.
Podstawowa strategia obronna organizmów zwierzą rozwinięta w czasie ewolucji, polega na
nie dopuszczeniu do wniknięcia i osiedlenia się mikroorganizmów chorobotwórczych w
tkankach. Zadanie to spełniają różne bariery anatomiczne i funkcjonalne. Jeśli jednak
drobnoustrój przełamał je, celem obrony organizmu jest zlokalizowanie zakażenia i usuniecie
mikroorganizmów przy udziale mechanizmów nieswoistych. Jednocześnie uruchamiane są
mechanizmy odporności swoistej, prowadzące do wytworzenia, przeciwciał i swoiście
uczulonych komórek, a także do wystąpienia swoistej pamięci immunologicznej. Dzięki niej po
ponownym zakażeniu tym samym drobnoustrojem osobnik wykazuje pewną odporność i
infekcja ma inny przebieg.

Mechanizmy odpowiedzialne za niewrażliwość organizmu na zakażenie zaliczyć można

do odporności nieswoistej (wrodzonej) i swoistej (nabytej).

Odporność wrodzona funkcjonuje bez uprzedniego kontaktu z drobnoustrojem i często

nie ulega usprawnieniu przy następnych infekcjach. Na przykład powierzchnia ciała pokryta
skórą stanowi efektywną barierę dla większości mikroorganizmów. Pokrywa włosowa (sierść),
złuszczanie zrogowaciałego naskórka, kwaśny odczyn potu związany z obecnością kwasu
mlekowego oraz występowanie kwasów tłuszczowych w wydzielinach gruczołów potowych i
łojowych działają ochronnie. Zdecydowana większość drobnoustrojów wnika do organizmu
przez drogi oddechowe i moczowo-płciowe, oraz przewód pokarmowy. Rolę ochronną spełnia
w tym przypadku wiele czynników, np.: ruch rzęsek nabłonka migawkowego usuwający
mikroorganizmy, odruch kaszlu, kichania, wymiotny. Ochronne działanie ma też warstwa śluzu
pokrywająca błony śluzowe, niskie pH soku żołądkowego, obecność sperminy w nasieniu oraz
lizozymu, enzymu, występującego w wielu wydzielinach. Na powierzchni ciała, w jamie ustnej,
jelitach i w pochwie żyje w normalnych warunkach wiele gatunków bakterii stanowiących
fizjologiczną florę organizmu. Posiada ona także właściwości ochronne przez konkurowanie z
drobnoustrojami chorobotwórczymi. Jeśli drobnoustrój sforsuje tą linie obrony i wniknie do
organizmu, napotka komórki fagocytarne. Ich funkcja polega na pochłanianiu różnych
cząsteczek, w tym drobnoustrojów i ich niszczeniu.

Fagocyty, komórki pochodzące ze szpiku kostnego, rozmieszczone są w tych

miejscach organizmu, gdzie mogą napotkać drobnoustroje, np.: występują w zatokach wątroby,
przez które przepływa duża ilość krwi, wyścielają pęcherzyki płucne oraz występują w obrębie
stawów. Komórki fagocytarne obecne są także w śledzionie, węzłach chłonnych, nerkach,
mózgu, do których dostają się wraz ze krwią. Spośród fagocytów najważniejsze to granulocyty
obojętnochłonne czyli neutrofile i makrofagi, te ostatnie stanowią przekształcone formy
monocytów, które po wniknięciu do tkanek noszą specjalne nazwy z uwagi na ich lokalizację,
jak np.: komórki Browicz-Kupffera w wątrobie.

W obronie organizmu przed wirusową infekcją biorą udział leukocyty zwane

komórkami NK (natural killer). Są one zdolne do rozpoznawania i zabijania komórek
zakażonych wirusami, zwłaszcza gdy ulegną aktywacji pod wpływem czynników
pobudzających wydzielanych przez komórki zakażone np.: interferonów. Interferony stanowią
ważny czynnik odporności wrodzonej bo oprócz aktywacji komórek NK, powodują również
wystąpienie stanu przeciwwirusowego w niezakażonych komórkach organizmu. Są one
wytwarzane we wczesnych etapach infekcji, stanowią wiec pierwszą linię obrony przeciw
wirusom.

3

Do czynników rozpuszczalnych, zwanych również humoralnymi czynnikami obrony

nieswoistej należą białka surowicy, których stężenie wzrasta wielokrotnie w czasie infekcji.
Wśród białek ostrej fazy, białko C-reaktywne wiąże się elektrostatycznie z powierzchnią
bakterii uruchamiając klasyczną drogę aktywacji dopełniacza.

Dopełniacz (complement) stanowi grupę około 30 białek surowicy, które oddziaływując

wzajemnie ze sobą uczestniczą w mechanizmach wrodzonej i nabytej oporności. Układ
dopełniacza jest spontanicznie aktywowany przez składniki ściany komórkowej
mikroorganizmów (alternatywna droga aktywacji). Po aktywacji niektóre składniki dopełniacza
opłaszczając drobnoustroje ułatwiają ich fagocytozę. Inne składniki dopełniacza przyciągają
fagocyty do miejsca infekcji oddziałując chemotaktycznie, a jeszcze inne powodują lizę
bakterii.

Poszczególne czynniki uczestniczące w odporności wrodzonej współdziałają ze sobą w

organizmie. Przykładem takiego współdziałania może być lokalny odczyn zapalny. Jest to
reakcja organizmu spowodowana między innymi infekcją, która się cechuje sekwencją zmian
niezależną od czynnika, który ją wywołał: zwiększeniem dopływu krwi do miejsca infekcji oraz
zwiększoną przepuszczalnością naczyń włosowatych spowodowanych kurczeniem się komórek
śródbłonka. Leukocyty, a szczególnie neutrofile i makrofagi, migrują przez naczynia włosowate
kierując się do miejsca infekcji dzięki chemotaktycznemu działaniu np.: składnika 5a
dopełniacza. Dzięki posiadaniu receptorów podobnych do lektyn na swej powierzchni, fagocyty
niespecyficznie przyłączają różne mikroorganizmy i fagocytują je. Proces fagocytozy jest
jednak bardziej wydajny, gdy mikroorganizmy są opłaszczone prze opsoniny, swoiste
przeciwciała lub składnik C3b dopełniacza. Fagocyty posiadają na swej powierzchni receptory
zarówno dla przeciwciał jak i dla składnik C3b dopełniacza. W następnym etapie drobnoustrój
jest pochłaniany do wnętrza fagocytu i najczęściej ulega zabiciu i strawieniu. Niektóre z
drobnoustrojów unikaj jednak zabiciu i przeżywają w fagocytach.

Należy podkreślić, że cząsteczka przeciwciała rozpoznaje i wiąże nie cały drobnoustrój

lecz jedną, określoną substancję na powierzchni mikroorganizmu. Tę substancję rozpoznawaną
swoiście przez przeciwciało, a także zdolną do jego produkcji, nazywamy antygenem.
Ponieważ antygeny są na ogół dużymi cząsteczkami, każde przeciwciało wiąże się zaledwie z
częścią cząsteczki antygenu. Ten fragment antygenu nazywamy determinantą antygenową lub
epitopem. Nawet najprostszy mikroorganizm stanowi mozaikę różnych antygenów, z których
każdy posiada wiele epitopów, indukuje wiec wytwarzanie w organizmie wielu przeciwciał o
różnej swoistości.

Odporność nabyta pojawia się u osobnika, który zetknął się uprzednio z

drobnoustrojem (antygenem). Zależy ona od obecności swoistych przeciwciał wytwarzanych
przez potomne komórki limfocytów B tj. plazmocyty (odporność humoralna) oraz swoiście
uczulone limfocyty T (odporność typu komórkowego).

Na każdym etapie odpowiedzi immunologicznej istnieje ścisła korelacja i uzupełnianie

się mechanizmów swoistych i nieswoistych.

II. Centralne i obwodowy układ immunologiczny.

Układ odpornościowy zwany też układem limfatycznym lub immunologicznym

podobnie jak układ nerwowy jest rozprzestrzeniony po całym organizmie Pełnie on bardzo
ważne funkcje: zwalcza zakażenia różnymi drobnoustrojami i pasożytami oraz chroni przed
rozwojem chorób nowotworowych. Układ immunologiczny jest również za odrzucanie
przeszczepów. W niektórych przypadkach jest tez odpowiedzialny za występowanie
patologicznych reakcji nadwrażliwości oraz autoagresji.

Podstawowymi komórkami układu immunologicznego są: limfocyty, komórki

dendrytyczne, makrofagi. Ich współdziałanie jest podstawą funkcjonowania tego układu. W
reakcjach immunologicznych uczestniczą tez inne komórki: granulocyty i komórki tuczne, a
także przeciwciała, układ dopełniacza oraz biochemiczne mediatory reakcji np.: interferony,

4

limfokiny, histamina. Wszystkie komórki immunologicznie kompetentne pochodzą ze szpiku
kostnego, a niektóre z nich(limfocyty) swe właściwości czynnościowe uzyskują w centralnych
narządach limfatycznych.

I. Centralne narządy limfatyczne.

1. Szpik kostny (Bone marrow) - czerwony krwiotwórczy szpik kostny zbudowany jest z

dwóch przedziałów: naczyniowego i po za naczyniowego.
Do krwi przez ściany zatok szpikowych przedostają się jedynie komórki dojrzałe.
W szpiku istnieją - totipotencjalne komórki pnia (stem cells) będące źródłem dwóch
linii komórkowych.
Linia mieloidalna - tworzy erytrocyty, granulocyty, megakariocyty (płytki krwi) a także
monocyty i komórki tuczne.
Linia limfoidalna - tworzy limfocyty T i B oraz komórki K i NK. Powstające i
dojrzewające w szpiku kostnym limfocyty B są odpowiedzialne za reakcję typu
humoralnego. Komórki te wytwarzają znaczne ilości powierzchniowych receptorów
immunoglobulinowych. Po kontakcie z antygenem odpowiadający za niego klon
limfocytów B przekształca się w komórki plazmatyczne wydzielające immunoglobuliny.

2. Grasica (thymus) - nie bierze ona bezpośrednio udziału w odczynach

immunologicznych, lecz stanowi miejsce dojrzewania prekursorów limfocytów T.

Limfocyty opuszczając grasicę są komórkami zróżnicowanymi na subpopulacje:
- limfocyty cytotoksyczne T

C

,

- limfocyty pomocnicze T

H

,

- limfocyty supresorowe T

S

.

Poszczególne subpopulacje różnią się miedzy sobą markerami powierzchniowymi –
antygenami i receptorami. Limfocyty T obok funkcji pomocniczej w wytwarzaniu
przeciwciał odpowiadają za reakcje immunologiczne typu komórkowego.

Po uzyskaniu kompetencji limfocyty opuszczają narządy centralne, przechodzą do krwi

i zasiedlają obwodowy układ limfatyczny, w których dochodzi do ich kontaktu z
antygenami. Zasiedlanie to nie odbywa się w sposób przypadkowy, wyróżnia się
obszary grasiczozależne zasiedlane przez limfocyty T i obszary grasiczoniezależne , w
których grupują się limfocyty B. Siateczkowa struktura obwodowych narządów
umożliwia kontakt, przepływających z krwią lub limfą, antygenów z komórkami układu
immunologicznego.

II. Obwodowy układ limfatyczny.

1. Śledziona - narząd limfatyczny włączonym do krążenia krwi, pełni role filtru. Stanowi

ona u człowieka miejsce wytwarzania przeciwciał oraz są tam usuwane zużyte
erytrocyty i płytki krwi.

2. Węzły chłonne - pełnią funkcję filtru chłonki i podobnie jak śledziona są miejscem

odczynów immunologicznych. Umożliwiają kontakt przepływającym z limfą
antygenom z komórkami prezentującymi antygeny (APC) oraz ich prezentacji
dziewiczym limfocytom T. Równocześnie APC, które weszły w kontakt wcześniej z
antygenem w innych tankach (np.: błonach śluzowych), wędrują do węzłów chłonnych
gdzie prezentują go limfocytom T.

3. Grudki chłonne zlokalizowane są w różnych miejscach organizmu: w błonie śluzowej

przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, układu moczowo-płciowego, tworząc
skupiska widoczne jak np.: kępki Peyera czy wyrostek robaczkowy.

5

Komórki immunologicznie kompetentne.

1. KOMÓRKI LINII LMFOIDALNEJ - Limfocyty.

- we krwi krążącej limfocyty stanowią 20 - 30 % białych ciałek krwi.
Mikroskopowo można je podzielić na dwie różniące wielkością i pewnymi cechami
morfologicznymi grupy:

- małe pozbawione ziarnistości cytoplazmatycznych

- duże o dużych wyraźnych ziarnistościach cytoplazmatycznych
(LGL-Large Grnural Lymphpcytes)

Dalszy podział opiera się na funkcji i obecności określonych markerów

powierzchniowych. Spośród małych limfocytów wyróżniamy limfocyty T i B a większe są
utożsamiane z komórkami K i NK.

Limfocyty B

Stanowią 5 - 15 % limfocytów krwi obwodowej, ich główną funkcją jest produkcja

przeciwciał oraz prezentacja antygenu limfocytom T. Dojrzewają i różnicują się w szpiku
kostnym, w czasie tego procesu nabywają immunoglobuliny powierzchniowe klasy IgM i IgD
jako receptory dla swoistych antygenów tzw. receptory immunoglobulinowe limfocytów B
(BCR= B Cell Receptor). W tym stadium dojrzewania dochodzi do eliminacji klonów
„skazanych” rozpoznających własne antygeny. Limfocyty B po opuszczeniu szpiku osiedlają
się w obwodowych narządach limfatycznych w strefach grasiczoniezależnych.

Oprócz BCR na swej powierzchni posiadają również: receptory dla fragmentów

dopełniacza, receptory dla fragmentu Fc przeciwciała, cząsteczki CD 40 (biorącej udział w
interakcji z limfocytami T) oraz MHC klasy II związane z funkcją prezentacji antygenu.

Po kontakcie z antygenem limfocyty B przekształcają się w komórki plazmatyczne

wytwarzające przeciwciała oraz długo żyjące limfocyty B, komórki pamięci.

Limfocyty T

Stanowią 80 % wszystkich limfocytów we krwi, pełnią w organizmie funkcje

regulacyjne i efektorowe. Prekursory limfocytów T obecne są w grasicy gdzie ulegają
dojrzewaniu i różnicowaniu do form dojrzałych. W trakcie procesu dojrzewania dochodzi do
eliminacji klonów komórek rozpoznających własne antygeny podobnie jak dla limfocytów B
Dochodzi do rearanżacji genów dla receptorów TCR (T Cell Receptor) oraz pojawienia się na
ich powierzchni cząsteczek różnicujących, związanych z ich funkcją - receptorów CD4 lub
CD8. Inne charakterystyczne markery dla limfocytów T to CD2 (receptor dla erytrocytów
barana), CD28 i CD40L (ligand dla CD40).

Funkcja regulacyjna limfocytów T obejmuje praktycznie wszystkie etapy odpowiedzi

immunologicznej, mogą powodować jej nasilenie (funkcja pomocnicza) lub hamowanie
(funkcja supresorowa). Reakcje te wywierane są głównie przez wydzielanie cytokin
oddziaływających na inne komórki.

Funkcja efektorowa poprzez działanie cytotoksyczne prowadząca do uszkodzenia

innych komórek lub kształtowaniu reakcji zapalnych o typie opóźnionym.

Limfocyty T pomocnicze (helperowe) - T

H

z cząsteczką CD4 - pełnią funkcje

stymulacji odpowiedzi immunologicznej i są zdolne do rozpoznawania antygenu w
kontekście cząsteczek MHC II .

Limfocyty T cytotoksyczne - T

C

posiadają cząsteczkę CD8, wywierają głównie rekcje

cytotoksyczne po rozpoznaniu antygenu w kontekście cząsteczek MHC I. Uczestniczą w
procesach zabijania komórek zakażonych wirusami i komórek nowotworowych.

6

Limfocyty T supresorowe - T

S

podobnie jak limfocyty T

C

na swojej powierzchni mają

cząsteczki oznaczone CD8. T

S

całkowicie lub częściowo hamują czynność limfocytów B i

innych komórek T.

Komórki NK.

Około 10 % limfocytów krwi to LGL, które nie posiadają na swojej powierzchni

markerów pozwalających zaliczyć je do limfocytów T czy B. Większość to komórki NK,
które pod względem czynnościowym mają zdolność do spontanicznego działania, a wiec nie
wymagającego uczulania. Zabijają komórki nowotworowe, zakażone wirusem lub komórki
narządów przeszczepionych. Reakcja komórek NK jest szybka i nie wymaga obecności na
powierzchni komórek cząsteczeki MHC, ani wcześniejszego kontaktu z antygenem. Komórki
NK mogą uczestniczyć w selekcji o typie toksyczności zależnej od przeciwciał ADCC.

2. KOMÓRKI LINII MIELOIDALNEJ.

Monocyty i makrofagii.

Stanowią 5-10 % jednojądrzastych komórek krwi. Osiadłe monocyty w tkankach

przechodzą zmiany czynnościowe i stają się makrofagami tkankowymi. Na swojej
powierzchni posiadają receptory dla immunoglobulin oraz dla dopełniacza, liczne adhezyny i
MHC klasy II. Posiadają właściwości fagocytarne i pełnią rolę w eliminacji antygenów w nie
swoistej fazie reakcji immunologicznej oraz prezentują sfagocytowany antygen limfocytom T.
Również są źródłem cytokin np.: IL-1, TNF-α modulujących zarówno odpowiedź swoistą jak i
nie swoistą.

Komórki dendrytyczne.

Zlokalizowane zarówno w narządach limfatycznych jak i nie limfatycznych np.: skóra i

błony śluzowe. W skórze są nazywane komórkami Langerhansa. Zasadniczą ich funkcją jest
przetwarzanie i prezentowanie antygenu limfocytom. Mają na powierzchni receptory MHC II.

Granulocyty obojętnochłonne (neutrofile).

Stanowią około 90 % wszystkich białych ciałek krwi obwodowej. Mają wielopłatowe

jądro. Ziarnistości cytoplazmatyczne zawierają enzymy o silnych właściwościach
cytolitycznych i przeciwbakteryjnych (mieloperoksydaza, lizozym,laktoferyna). Generują duże
ilości toksycznych rodników ponadtlenkowych. Neutrofile na powierzchni posiadają receptory
dla przeciwciał, dopełniacza oraz adhezyny. Uczestniczą w fagocytozie.

Granulocyty kwasochłonne (eozynofile).

Stanowią 2 - 5 % leukocytów krwi, wyróżniają się dwupłatowym jądrem i licznymi

ziarnistościami cytoplazmatycznymi. W odpowiedzi na stymulację produkują leukotrieny.
Posiadają na powierzchni receptory dla dopełniacza i przeciwciał. Ich główna funkcja polega
na zwalczaniu pasożytów oraz patologicznych reakcjach alergii.

Granulocyty zasadochłonne (bazofile).

Stanowią około 0,5 - 1 % leukocytów. Ziarnistości cytoplazmatyczne zawierają głównie

histamine i enzymy. Wyróżnia je obecność receptorów IgE

7

Komórki tuczne.

Komórki tuczne należą do szeregu mieloidalnego ale rozwijają się nie zależnie od

bazofili i są osiadłe w tkankach. Pod wpływem stymulacji wytwarzają histaminę,
prostaglandyne D i leukotrieny. Są podstawowym źródłem TNF-α, posiadają receptory dla IgE.

III. Metody izolacji narządów układu limfatycznego, oraz komórek

immunologicznie kompetentnych.

Źródłem komórek immunologicznie kompetentnych do oceny ich aktywności oraz do

badań naukowych jest krew i centralne oraz obwodowe narządy limfatyczne. Ocenę jakościową
i funkcjonalną układu immunologicznego przeprowadza się najczęściej poprzez określenie
znaczników (markerów) powierzchniowych i cytoplazmatycznych izolowanych komórek, a
także czynności poszczególnych składowych tego układu.

1. Zasady i etapy izolacji komórek z krwi.

Krew obwodową w celu zapobieżenia krzepnięciu można pobierać na:
a) heparynę (bez środka konserwującego) w ilości 20 IU/ml krwi,
b) cytrynian sodu – 3,8-5%,
c) EDTA (wersenian sodu ) - 4 mM,
d) kulki szklane - odwłóknienie krwi (enzymatyczne przekształcenie i polimeryzacja

cząsteczek fibrynogenu z wytworzeniem fibryny na powierzchni kuleczek)

Krew pobrana na jeden z wyżej wymienionych środków przeciwkrzepliwych lub

odwłóknioną, poddaj się następnie procesowi sedymentacji przez 1-2 godzin w 37

0

C.

Uprzednie dodanie do pełnej krwi 1/5 objętości płynu hodowlanego, lub 3% żelatyny,

lub wielocząsteczkowego dekstranu (do końcowego stężenia 1- 1,5 %) zwiększa liczbę
uzyskanych leukocytów.

Uzyskany nasącz (supernatant) po sedymentacji krwinek czerwonych (osocze), zawiera

oprócz znacznej ilości limfocytów także monocyty, granulocyty, jak również niewielką ilość
erytrocytów. W celu uzyskania określonych populacji leukocytów przeprowadza się kolejne
etapy izolacji.

2. Zasady i etapy izolacji komórek limfoidalnych z narządów.

W przypadku izolacji komórek z narządów materiał rozdrabnia się mechanicznie na

drobne kawałki o objętości 2-3 mm

3

. Następnie fragmenty tkankowe i zlepy komórkowe

przeciera się przez siatkę nylonową o wielkości porów 25-50

m. Materiał pochodzący z

narządów o dużej spoistości, przed przetarciem prze siatkę, poddaje się trawieniu
enzymatycznemu (kolagenaza, DNA- za) w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek.

Uzyskane komórki zawiesza się w pełnym standardowym płynie hodowlanym (płyn

Parkera, 10 % surowica płodowa, 2 mM/ml L-glutaminy, antybiotyki: 100 IU/penicyliny, 100



g/ml streptomycyny). Następnie przeprowadza się kolejne etapy izolacji.

8

Dalsze etapy izolacji.

1. Metoda rozdziału w gradiencie gęstości

Substancje jakie się używa do tworzenia gradientu to:
- Ficoll-Isopaque (Uropolina),
- Percol,
- surowica

Najczęściej stosowanym gradientem gęstości jest mieszanina Ficoll - Uropolina (1,075-

1,079). Gradient ten służy do izolacji limfocytów z krwi i płynów ustrojowych, do rozdziału
komórek nowotworowych i limfoidalnych (gradient dwustopniowy 100% - 75%). Na określoną
objętość gradientu gęstości nawarstwia się delikatnie zawiesinę komórek. Po odwirowaniu
zbiera się interfazę (warstw komórek na granicy gradientu i płynu nawarstwionego) bogatą w
komórki limfoidalne. Przez warstwę Ficollu przechodzą erytrocyty, granulocyty, które zbierają
się na dnie probówki.

Wielostopniowy gradient Percollu (gęstość roztworu podstawowego wynosi 1,130

g/ml). Podstawowe warstwy przygotowuje się z rozpuszczenia percollu podstawowego w 0,15
M NaCl. Gradient wielowarstwowy służy do rozdziału limfocytów B od T, izolacji komórek
NK, izolacji monocytów krwi oraz granulocytów. Izolowane komórki zatrzymują się na
odpowiednich warstwach w zależności od ich masy I gęstości poszczególnych warstw.

Surowica cielęca (FCS - foetl calf serum) służy do rozdziału mieszaniny komórek

różniących się masą I objętością np.: nowotworowych i limfoidalnych.

W celu sprawdzenia żywotności wyizolowanych komórek przeprowadza się barwienie

przyżyciowe: błękitem trypanu, eozyną, nigrozyną. Natomiast dla sprawdzenia jednorodności
uzyskanych populacji komórkowej sprawdza się w rozmazie barwionym metodą May-
Grunwalda Giemzy lub immunofluorescencji powierzchniowej (IMF) przy użyciu przeciwciał
monoklonalnych.

2. Metody adherencyjne.

Adherencją nazywamy zdolność przylegania do szkła bądź plastiku części komórek

krwi, zwłaszcza szeregu monocytów. Wyżej wymienionymi cechami charakteryzują się nie
tylko monocyty i makrofagi, ale także granulocyty i limfocyty B.

Należą tu:

a) rozdział komórek przy użyciu kulek szklanych;
b) przyleganie komórek do powierzchni płytki Petriego (polistyrenowe) w czasie

inkubacji (1 godzina w 37

0

C)

c) kolumny z waty nylonowej lub szklanej;
d) kolumny z cząsteczkami wielocukru lub poliakrylamidu (Sephadex G-10, Bio-

Gel)

Zawiesinę komórek inkubuje się w wyżej wymienionych kolumnach, po 30-45 min. w

temp. 37ºC wypłukuje się medium hodowlanym komórki nie przylegające do kolumny – tzn.
limfocyty T. Poprzez inkubację zawartości kolumny (szczególnie szklanej lub nylonowej) w 50
% FCS następuje uwalnianie zaadsorbowanych komórek.

3. Eliminacja erytrocytów na drodze szoku osmotycznego

a) użycie wody destylowanej (1 część płynu hodowlanego i 2 części wody, pH

4,65)

b) użycie chlorku amonu (0,83%=0,14 M NH

4

Cl z buforem TRIS, pH 7,4

9

Komórki zawiesza się w 0,5 ml ww. roztworu a lub b i inkubuje się 15 - 0 sekund w

temperaturze pokojowej. Następnie komórki odwirowuje się i zawiesza w płynie hodowlanym.
Na drodze szoku osmotycznego zawiesina komórek zostaje pozbawiona erytrocytów.

4. Tworzenie rozet.

Limfocyty T posiadają na swej powierzchni receptory, dla krwinek czerwonych barana

(antygen CD2) co umożliwia spontaniczne tworzenie rozet z tymi krwinkami (rozetki
spontaniczne E - bezpośrednie). Rozetki można oddzielić od pozostałych komórek poprzez
wirowanie w gradiencie Ficoll - Uropolina, a następnie poprzez usunięcie erytrocytów na
drodze szoku osmotycznego. Około 70% limfocytów krwi obwodowej tworzy rozetki
spontaniczne.

Rozetki pośrednie EA powstają poprzez łączenie się fragmentu Fc immunoglobuliny,

opłaszczającej erytrocyt, z receptorem dla fragmentu Fc występującym na powierzchni
limfocytów B. Nie jest to test rozpoznający tylko i wyłącznie limfocyty B, gdyż receptory Fc
posiadają także makrofagi i neutrofile. Rozetki EA tworzy około 30 % leukocytów krwi.

Rozetki EAC powstają przez połączenie kompleksu erytrocyt-przeciwciało-dopełniacz z

obecnym na limfocycie B receptorem dla składnika C3 dopełniacza. Receptory dla składników
C3 dopełniacza posiadają także monocyty i neutrofile. Rozetki EAC tworzą 10-20 %
leukocytów.

5. Immunoabsorbęty - są to nośniki (kulki szklane, cząstki agarazy) opłaszczone

swoistymi przeciwciałami przeciw antygenom danej frakcji komórek.

a) kolumny

Przez kolumnę wypełnioną jednym z nośników, opłaszczonym uprzednio odpowiednimi

przeciwciałami monoklonalnymi, przepuszcza się zawiesinę komórek. Subpopulacja komórek
wiąże się swoiście z przeciwciałami na nośniku. Aby odzyskać komórki z immunoadsorbentów
wylewa się zwartość kolumny i wypłukuje komórki mieszając immunoadsorbent w płynnie
hodowlanym.

b) panning imnoadsorbcja komórek w fazie stałej

Immunoabsorpcji można dokonać również na płytkach Petriego, które opłaszcza się

swoistymi przeciwciałami przeciw antygenom powierzchniowym danej frakcji komórek lub
lektyną wiążącą niektóre subpopulacje komórek.

c) paramagnetyczne cząstki polistyrenu

6. Zastosowanie indukowanej swoistej fluorescencji komórek, przy użyciu

cytofluorymetru.

7. Wykorzystanie fagocytozy.

Wykorzystując właściwości fagocytarne makrofagów i neutrofili można je łatwo

oddzielić od innych komórek pochodzących z interfazy i sprawdzić ich aktywność. W procesie
fagocytozy obce cząsteczki (karbonylek żelaza lub lateks) zostają otoczone wypustkami błony
komórkowej i wchłonięte do wnętrza pod postacią fagosomu. Następnie komórki te oddziela
się od przy pomocy magnesu (żelazo) lub po przez wirowanie (lateks).

Po uzyskaniu w wyniku metod izolacji, pożądanych subpolpulacji komórek można

sprawdzić ich aktywność, a przez to działanie poszczególnych typów odpowiedzi i całego
układu immunologicznego. Badania te opierają się głownie na określaniu aktywności

10

cytotoksycznej komórek, badaniu transformacji balstycznej limfocytów, wykrywaniu obecności
cytokin, określanie zdolności fagocytarnych i chemotaktycznych.

Zadania praktyczne.

Zadanie 1 A.

MATERIAŁY:
1. Krew bydlęca,
2. 0,3% roztwór galaktozy w H

2

O redestylowanej,

3. 0,1% roztwór żelatyny w 0,85% NaCl,
4. 0,85% roztwór NaCl w H

2

O redestylowanej,

5. Płyn Eagle’a z dodatkiem 10% surowicy cielęcej,
6. Probówki wirownicze,
7. Szkiełka nakrywkowe i podstawowe,
8. Pipety

WYKONANIE:

1. Schłodzoną w lodówce krew przenieść do gilz wirówkowych i wirować przez 30

min. przy 1500g.

2. Z każdej gilzy zebrać kożuszek tworzący się na granicy między erytrocytami a

osoczem i przenieść do świeżej gilzy wirówkowej.

3. Zmierzyć objętość uzyskanego koncentratu leukocytów i zmieszać z zimnym 0,3%

roztworem galaktozy w proporcji 1 część roztworu leukocytów i 1,5 części
roztworu galaktozy.

4. Delikatnie wymieszać i pozostawić w lodówce przez 3 min. Powinna wystąpić silna

liza erytrocytów widoczna jako zwiększona przejrzystość zawiesiny.

5.

Dodać 0,1% roztworu żelatyny w proporcji 1 cześć lizatu i 1,5 części żelatyny.

6.

Wirować przy 500 g przez 5-10 min. i zalać supernatant.

7.

Uzyskany na dnie osad leukocytów przemyć zimnym płynem fizjologicznym i
odwirować.

8.

Z osadu sporządzić zawiesinę w płynie Eagle’a z dodatkiem 10% surowicy
cielęcej, określić jej gęstość i żywotność komórek.

Zadanie 1 B.

MATERIAŁY:
1.

Heparynowana krew bydlęca,

2. Roztwór Ficoll-Uropolina,
3.

Płyn Parkera z dodatkiem 10% surowicą bydlęcą do hodowli,

4.

Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej(PBS)

5.

Probówki zwykłe i wirówkowe silikonowane,

6.

Pipety

WYKONANIE:

1.

Rozcieńczyć krew zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) przez
zmieszanie równych objętości krwi i PBS.

2.

Do probówki wirówkowej dodać 3 ml Ficoll-Uropolina i na powierzchnię roztworu
delikatnie nanieść 4ml rozcieńczonej krwi uzyskując mieszaninę roztworów.

4.

Wirować przy 400 g przez 30-40 min w temperaturze pokojowej.

11

Uzyskuje się rozdział na kilka faz: górną stanowi plazma, środkową stanowi
warstwa bogata w limfocyty i monocyty z niewielką (poniżej 10%) domieszką
granulocytów i płytek krwi. Środkowa warstwa oddzielona jest warstwą Ficoll-
Uropolina od osadu granulocytów i erytrocytów.

5.

Zebrać środkową fazę zawierającą limfocyty, przenieść do świeżej probówki
wirówkowej i przemyć 3 objętościami PBS.

6.

Wirować przy 100g przez 10 min w temp. pokojowej.

7.

Po ostatnim wirowaniu osad limfocytów zawiesić w płynie Parkera z dodatkiem
10 % surowicy cielęcej. Określić gęstość zawiesiny i żywotność komórek.

Zadanie 2 - sprawdzanie żywotności.

MATERIAŁY:

1.

Kamera do liczenia komórek,

2.

Pipety pasteurowskie,

3.

Probówki stożkowe,

4.

Mikroskopy,

5.

Błękit trypanu,

6.

Komórki z interfazy gradientu

WYKONANIE:

1.

Miesza się przy pomocy pipety pasterowskiej zawiesinę komórek z interfazy z
barwnikiem, w stosunku 1:1 (w probówce stożkowej).

2.

Nałożyć porcję komórek na kamerę do ich liczenia.

3.

Ocena preparatu pod mikroskopem.

Komórki żywe nie chłoną barwnika, natomiast w miarę obumierania następuje

wchłanianie barwnika najpierw w postaci ziarnistości a następnie dyfuzyjnego zabarwienia
cytoplazmy i jądra. Oprócz oceny żywotności określania się liczbę wyizolowanych komórek.

W celu określenia liczby żywych komórek w 1 ml, liczy się komórki (które nie

pochłonęły barwnika) pod mikroskopem świetlnym posługując się zwykłą siatką
np: Neubauera. Wynik z 16 kwadratów (o powierzchni 1 mm

2

mnoży się przez 10

4

)

Zadanie 3 - Sprawdzanie jednorodności leukocytów barwienia
metodą May-Grunwalda Giemzy.

MATERIAŁY:

1.

Metanol,

2.

Odczynnik May-Grunwalda (przygotowany fabrycznie),

3.

Odczynnik Giemsy (przygotowany fabrycznie),

4.

Bufor fosforanowy(przygotowany fabrycznie),
a) roztwór macierzysty A = 0,91% wodny roztwór jednozasadowego fosforanu
potasowego cz.d.a. (KH

2

PO

4

)

b) roztwór macierzysty B = 0,95% wodny roztwór dwuzasadowego fosforanu
sodowego cz.d.a. (Na

2

HPO

4

)

Zmieszać 127 ml roztworu A ze 123 ml roztworu B, dopełnić wodą do 5 L.

12

WYKONANIE:

1.

Dobrze wysuszony preparat należy utrwalić przez 20 min w czystym metanolu,

2.

Zalać preparat na 5 min roztworem May-Grunwalda (barwnik rozcieńczonym
buforem w stosunku 1:10), po tym czasie barwnik zlać, nie płukać wodą,

3.

Zalać preparat na 15 min roztworem Giemsy (barwnik wcześniej rozcieńczyć
buforem w stosunku 1:10),

4.

Po zlaniu odczynnika Giemsy należy preparaty spłukać wodą bieżącą i zalać
buforem fosforanowym na 5 min.

5.

Po wykonaniu barwienia preparaty wysuszyć w temperaturze pokojowej.

Jądra komórek barwią się na fioletowo –młodsze postacie rozwojowe na jasnofioletowo,

a formy dojrzalsze na ciemnofioletowo. Cytoplazma komórek barwi się różnorodnie, w
zależności od rodzaju i dojrzałości komórek.

Cytoplazma zasadochłonna (bazofile) barwi się barwnikiem zasadowym na różne

odcienie niebieskiego (limfocyty, monocyty, plazmocyty, prekursory krwinek czerwonych i
granulocytów).

Cytoplazma kwasochłonna barwi się barwnikiem kwaśnym (eozyna) na różne odcienie

barwy różowoczerwonej (dojrzałe formy erytroblastów, krwinek czerwonych, granulocytów).

Cytoplazma polichromatofilna barwi się jednocześnie barwnikiem zasadowym i

kwaśnym na różne odcienie fioletu. Barwy te występują w pośrednich postaciach rozwojowych
krwinek czerwonych i ich prekursorów oraz plazmocytach, dzielą się następująco:

●

Ziarnistości azurochłonne. Barwiące się azurem na różne odcienie fioletu (od granatu
do czerwieni).

●

Swoiste ziarnistości kwasochłonne (w eozynocytach - kolor żółtobrunatny).

●

Swoiste ziarnistości zasadochłonne (w bazocytach – odcienie ciemnego fioletu z
poświatą czerwoną)

Zadanie 4 - Badanie fagocytozy in vitro.

MATERIAŁY:

1.

24 godzinna hodowla bakterii np.: Sarcinia lutea.

2.

Zawiesina komórek fagocytarnych.

3.

Surowica odpornościowa przeciwbakteryjna (surowica cielęca).

4.

Dopełniacz (surowica świnki morskiej).

5.

Płyn Eaglea.

6.

Odczynniki Giemsy rozcieńczony 1:20 w H

2

O destylowanej lub barwnik Mansona.

7.

Alkohol metylowy do utrwalania preparatów.

8.

Silikonowane lub parafinowane probówki windalowskie. (lub probówki typu
eppendorf)

9.

Szkiełko podstawowe.

WYKONANIE:
1.

24 godzinna hodowla bakterii np.: Sarcinia lutea na skosie agarowym zmyć 5 ml
soli fizjologicznej. Następnie doprowadzić zawiesinę do gęstości 108 kom/ml.

2.

Zawiesinę komórek fagocytarnych zawiesić w płynie Eaglea z dodatkiem 10 %
surowicy cielęcej i doprowadzić do gęstości 106 kom/ml.

3.

Do prbówki dodać: 0,5 ml surowicy normalnej, 0,2 ml zawiesiny makrofagów,
0,2 ml zawiesiny bakterii i 0,1 ml dopełniacza; delikatnie wymieszać.

4.

Inkubować 30 min w temperaturze 37

0

C.

13

5.

Zawiesinę wirować przy 500 g, ściągnąć supernatant pozostawiając 2 krople nad
osadem.

6.

Z uzyskanej zawiesiny zrobić rozmaz na szkiełku podstawowym, następnie
wysuszyć go na powietrzu.

7.

Utrwalać preparat 5 min w alkoholu metylowym. Ponownie wysuszyć.

8.

Barwić preparat przez 10 –15 min rozcieńczonym barwnikiem Giemsy lub przez 1
min barwikiem Mansona.

9.

Spłukać barwnik wodą destylowaną, preparat wysuszyć i oglądać pod imersją

Zadanie 5 - Test z błękitem nitrotetrazoliowym.

Test ma za zadanie ocenę aktywności neutrofili a szczególnie ich zdolności do

wytwarzania nadtlenków, które są niezbędne do zabijania bakterii. Związek ten o kolorze
żółtym w obecności nadtlenków ulega redukcji do formazonu o ciemnoniebieskim zabarwieniu.
Test polega na inkubacji krwi obwodowej z roztworem NBT, wybarwieniu i obliczeniu ilości
neutrofili ze złogami formazonu. Wyniki odnosi się do ogólnej liczby neutrofili. Odsetek
komórek metabolicznie czynnych u ludzi zdrowych wynosi 9-15%.

MATERIAŁY:

1.

Heparynowana krew ludzka lub zwierzęca.

2.

0,1% roztwór błękitu nitrotetrazoliowego (NBT) zbuforowany roztworem soli
fizjologicznej (PBS)

3.

Silikonowane probówki windalowskie, (lub probówki typu eppendorf).

4.

Szkiełka podstawowe.

5.

Alkohol metylowy.

6.

Barwnik Giemsy .

WYKONANIE:

1.

W silikonowanej probówce windalowskiej zmieszać 0,5 ml krwi i 0,5 ml roztworu
NBT.

2.

Inkubować o temp. 37

0

C przez 25 min, a następnie w temp. pokojowej przez

15 min.

3.

Wykonać rozmaz krwi na szkiełku podstawowym i wysuszyć.

4.

Utrwalać preparat w alkoholu metylowym przez 5 min.

5.

Wysuszony preparat barwić przez 15 min. rozcieńczonym (1:20) wodą
destylowaną barwnikiem Giemsy.

6.

Preparat spłukać wodą destylowaną i ponownie wysuszyć.

7.

Preparat oglądanych pod imersją. Obliczyć ilość neutrofili ze złogami
niebieskiego barwnika na ogólną liczbę 100 wyszukanych w preparacie
neutrofilów.

14

ĆWICZENIE II - Odczyny serologiczne (część 1).

Mechanizmy reakcji antygen- przeciwciało :

1.

Odczyn precypitacji.

2.

Odczyn aglutynacji: czynnej, biernej, hemaglutynacja.

3.

Odczyn wiązania dopełniacza.

Precypitacja.

Zadanie 1

Odczyn ten stosowany jest do wykrywania przeciwciał, klasyfikacji bakterii,

wykrywania antygenów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych, ustalania przynależności
gatunkowej: białek krwi, płynów ustrojowych, produktów spożywczych. Wykonuje się go w
małych, wąskich probówkach do których dodaje się surowicę odpornościową (lub badaną) a
następnie nawarstwia roztwór antygenem. Po kilku minutach na granicy zetknięcia się obu
swoistych reagentów występuje precypitacja w formie pierścienia.

MATERIAŁY:

1.

Surowica odpornościowa np.: przeciwciała kozie przeciw białkom surowicy
ludzkiej (dopełniacz zawarty w surowicy ludzkiej inaktywować przez ogrzanie w
56°C przez 30 min.).

2.

Antygen (surowica ludzka lub 0,1% roztwór albuminy ludzkiej).

3.

0,85% roztwór NaCl.

4.

Probówki precypitacyjne.

5.

Probówki windalowskie.

6.

Pipety.

WYKONANIE:

1.

W probówkach windalowskich wykonać rozcieńczenie antygenu 1: 100, 1: 200,
1: 400, 1: 800, 1: 1600, 1: 3200.

2.

Do siedmiu probówek precypitacyjnych wprowadzić pipetą kilka kropli surowicy
odpornościowej.

3.

Na surowicę odpornościową (przeciwciała) nawarstwiać kilka kropel kolejnych
rozcieńczeń antygenu unikając zmieszania reagentów.

4.

W siódmej probówce zamiast antygenu nawarstwić sól fizjologiczną.

5.

Inkubować w 37

0

C przez 30 min.

6.

Odczytać wynik obserwując wystąpienie i grubość pierścienia.

Za miano precypitacji przyjmuje się najwyższe rozcieńczenie antygenu, przy którym

występuje jeszcze pierścień precypitacyjny.

Zadanie 2. - Odczyn flokulacyjny.

Flokulacja jest odmianą precypitacji. Pojawienie się strątu w tym odczynie zachodzi w

dość wąskim przedziale ekwiwalencji. W wyniku reakcji precypitat ma formę drobnych
kłaczków, które można obserwować pod lupą. Odczyn flokulacji znalazł praktyczne
zastosowanie w serodiagnostyce kiły. Wykonuje się go stosując surowice badaną (ludzką) i
antygen kardiolipinowy.

15

MATERIAŁY:

1.

Surowica badana (ludzka) nie inaktywowana.

2.

Antygen kardiolipinowy USR (Unheated Serum-Reagin Test).

3.

Szkiełka podstawowe z wgłębieniem (Lindnera).

4.

Pipety.

5.

Strzykawki tuberkulinowe dobrane tak, aby z 1 ml antygenu uzyskać 45 kropli.

WYKONANIE:
1.

Do wgłębienia na szkiełku podstawowym nakropić 0,005 ml surowicy badanej i
jedną kroplę antygenu USR (1/45 ml).

2.

Wymieszać dobrze obie substancje umieszczając szkiełko na wytrząsarce
rotacyjnej, lub mieszać ręcznie przez 5 min.

3.

Wynik odczytać za pomocą lupy (8x powiększenie).

Pojawienie się drobnych kłaczków uznaje się za odczyn słabo dodatni. Jeśli kłaczki

łączą się w skupiska a płyn jest przeźroczysty uznaje się to za odczyn silnie dodatni. Preparat
antygenu kardiolipinowego USR zawiera dodatek choliny inaktywującej dopełniacz i dlatego
nie jest konieczna inaktywacja surowicy badanej.

Zadanie 3 - Odczyn immunodyfuzji.

W żelu agarowym lub agarozowym cząsteczki antygenu i przeciwciał mogą swobodnie

dyfundować od miejsca wprowadzenia ulegając rozcieńczeniu i tworząc gradient stężeń. W
miejscu optymalnych stężeń reagentów wytwarza się precypitat. Szybkość dyfuzji jest
odwrotnie proporcjonalna do mas cząsteczkowych antygenu i przeciwciał. W badaniach
immunologicznych stosuje się metody oparte na zasadzie dyfuzji pojedynczej (dyfunduje tylko
antygen gdyż surowicę miesza się z żelem) lub podwójnej (w żelu dyfunduje zarówno antygen
jak i przeciwciało).

Odczyn pojedynczej immunodyfuzji płytkowej.
Surowicę odpornościową (przeciwciała) miesza się z żelem i wylewa do płytki Petriego.

Po zakrzepnięciu agaru wycina się w nim zbiorniczki, które wypełnia się różnymi
rozcieńczeniami antygenu lub różnymi antygenami. W wyniku reakcji dyfundującego antygenu
z przeciwciałem występującym w stałym stężeniu w agarze, powstają okrągłe pola
precypitacyjne, których średnice są proporcjonalne do stężenia antygenu. Z krzywej wzorcowej,
uzyskanej z pomiaru średnicy pól precypitacyjnych antygenu o znanych malejących stężeniach,
można odczytać stężenie antygenu w badanej próbce. Ten rodzaj precypitacji został
wykorzystany do ilościowego określania zawartości immunoglobulin różnych klas w surowicy i
znany jest jako odczyn Manciniego. Wykreślając krzywą wzorcową na osi rzędnych odkłada
się ilość immunoglobuliny standardowej w mg% a na osi odciętych średnicę krążków
precypitacyjnych w mm.

Odczyn podwójnej immunodyfuzji płytkowej (wg Ouchtorlony’ego).
W tym odczynie zarówno antygeny jak i przeciwciała dyfundują ze studzienek

wyciętych w agarze z szybkością odwrotnie proporcjonalną do mas cząsteczkowych substancji
reagujących. Miejsca ich interakcji są widoczne w ciemnym polu jako opalizujące linie. Z
liczby i kształtu linii oraz wzajemnego stosunku sąsiadujących można wyciągnąć wiele
wniosków. Linia prosta powstaje przy podobnym stężeniu reagujących substancji i podobnej
masie cząsteczkowej antygenu i przeciwciał. Jeśli linia tworzy łuk, świadczy to o dużej różnicy
masz cząsteczkowych, wklęsłość skierowana jest w kierunku substancji o większej masie
cząsteczkowej. Gdy użyte są dwa antygeny i jedno przeciwciało, powstające linie mogą
pokazywać na stopień pokrewieństwa antygenów. Jeżeli przeciwciało wykrywa identyczny

16

determinant u obu antygenów, obie linie tworzą łuk. Nie oznacza to że antygeny są identyczne,
lecz że posiadają jeden wspólny determinant. Gdy linie przecinają się, przeciwciała rozpoznają
dwa różne determinanty. Gdy zaś tworzą ostrogę (reakcja jednostronnego zahamowania), oba
antygeny posiadają jeden wspólny determinant a jeden nich ma dodatkowy epitop.

Odczyny podwójnej immunodyfuzji płytkowej możemy podzielić na reakcje:
► identyczności
► braku podobieństwa
► częściowej identyczności
► jednostronnego zahamowania

Podwójna dyfuzja w agarze.

MATERIAŁY:
1.

Odtłuszczone w alkoholu płytki szklane lub szkiełka podstawowe.

2.

Narzędzie do wykonania studzienek w agarze.

3.

Pipeta miarowa na 10 lub 25 ml i mikropipeta do rozcieńczeń.

4.

1 % agar w PBS.

5.

Badane roztwory antygenów.

6.

Surowice odpornościowe .

7.

Wilgotna komora.

WYKONANIE:
1.

Na szklane płytki wylać gorący (około 70

O

C) roztwór agaru, do utworzenia

warstwy grubości ok. 1mm.

2.

W zastygłym agarze wyciąć studzienki.

3.

Do środkowej studzienki wprowadzić 5

l badanego antygenu, do zewnętrznych

kolejne rozcieńczenia surowicy odpornościowej (pełna, ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32).

4.

Płytki umieścić w wilgotnej komorze i inkubować w temperaturze pokojowej przez
24 godzin.

5.

Odczytać wynik i zapisać miano reakcji.

Zadanie 4 - Immunoelektroforeza.

Metoda ta stanowi połączenie elektroforezy z dyfuzją w agarze. W elektroforezie

ruchliwość cząsteczek zależy do ładunku cząsteczki i od ich wielkości w porównaniu z
wielkością porów nośnika. W praktyce można przyjąć, że stosowany 1 - 2 % żel agarowy czy
agarozowy ma tak duże pory iż wędrówka białek zależy głównie od ich ładunku. Ze względu na
amfoteryczny charakter białek decydujący wpływ na ich ruchliwość w polu elektrycznym ma
pH elektrolitu.

Antygeny rozdzielane elektroforetycznie dyfundują w różnych kierunkach. Jeśli zetkną

się z przeciwciałami zawartymi w surowicy odpornościowej, powstają łuki precypitacyjne, z
których każdy odpowiada kompleksowi antygen-przeciwciało.

Immunoelektroforeza wykonywana jest w różnych odmianach, a których najczęściej

wykonywana jest immunoelektroforeza prosta. W metodzie tej początkowo rozdziela się
elektorforetycznie antygen umieszczony w studzience wyciętej w agarze lub agarozie. Po
rozdzieleniu antygenu wycina się rowek równoległy do kierunku migracji i wypełnia surowicą
odpornościową. Po inkubacji powstają łuki precypitacyjne odpowiadające poszczególnym
antygenom. Metoda ta pozwala na wykrycie ponad 30 białek w prawidłowej surowicy ludzkiej.

17

MATERIAŁY:
1.

Odtłuszczone w alkoholu płytki szklane.

2.

Pipety miarowe na 10 lub 25 ml i mikropipety.

3.

Narzędzie do wykonania studzienek w agarze, szablony studzienek.

4.

Badane surowice ludzkie.

5.

Zestaw surowic odpornościowych (anty ludzkie IgG, IgA, IgM; anty IgG, anty
IgM, anty IgA).

6.

Surowica ludzka jako wzorzec.

7.

1 % agaroza w buforze boranowym.

8.

Bufor boranowy pH 8,6.

9.

Aparat do elektroforezy.

10. Wilgotna komora.

WYKONANIE:

1.

Na szklana płytkę wylać gorącą agarozę (ok.70

O

C) do utworzenia warstwy ok.

1mm.

2.

Po zastygnięciu wyciąć studzienki wg szablonu.

3.

Następnie nałożyć po 3

l badanych surowic do studzienek, do jednej ze

studzienek dodać surowicy wzorcowej.

4.

Płytkę umieścić w aparacie do elektroforezy, połączyć paskami bibuły ze
zbiornikami buforu, podłączyć prąd 120 V na 80 min.

5.

Wyjąć żel z aparatu i wzdłuż przewidywanego rozdziału białek wyciąć rowek wg
szablonu i usunąć z niego żel.

6.

W miejsce żelu do rowka wprowadzić zwierzęcą surowicę odpornościową
przeciwko oznaczanemu ludzkiemu antygenowi (np.: króliczą

-globulinę anty

ludzkim IgG+IgA+IgM).

7.

Płytkę umieszczamy w komorze wilgotnej. Po 24 godz. ocenić powstałe linie
precypitacji, porównać rozdział surowicy badanej z surowicą wzorcową.

Aglutynacja

Zadanie 1. -

Odczyn aglutynacji bezpośredniej - aglutynacja szkiełkowa.

Przykładem tego typu odczynów jest odczyn służący do identyfikacji pałeczek z rodzaju

Salmonella, na podstawie budowy antygenów rzęskowych (H) i somatycznych (O),
występujących w obrębie komórek tych bakterii. Do identyfikacji antygenów trzeba się
posłużyć diagnostycznymi surowicami, zwierającymi swoiste przeciwciała, skierowane
swoiście przeciw tym antygenom (anty-H i anty-O). Przeciwciała te zwane aglutyninami
powodują zlepienie komórek bakterii zawierających dla nich swoiste antygeny. Produktem
reakcji jest aglutynat w postaci obłoczkowej (H) lub grudkowej (O). Warunkiem powstawania
aglutynatów jest obecność w środowisku elektrolitu, najczęściej izotonicznego roztworu NaCl.

MATERIAŁY:
1.

Badane szczepy bakterii na skosach agarowych.

2.

Surowice diagnostyczne.

3.

Szkiełka podstawowe.

4.

Pipety.

5.

0,85% NaCl.

18

WYKONANIE:
1.

Na szkiełko podstawowe nanieść dwie krople izotonicznego roztworu chlorku sodu.

2.

W obu kroplach należy starannie zawiesić materiał ze stałej hodowli Salmonella
do uzyskania jednolitego zmętnienia.

3.

Do jednej z zawiesin bakteryjnych należy dodać kroplę surowicy HM, i lekko
kołysać szkiełkiem

4.

Po kilku minutach można odczytać wynik za pomocą lupy, umieszczając szkiełko
na ciemnym tle. Druga zawiesina bakterii w izotonicznym roztworze NaCl stanowi
kontrolę. Sprawdza się w ten sposób czy bakterie nie zlepiają się w sposób nie
swoisty bez udziału przeciwciał.

Zadanie 2 -

Odczyn aglutynacji pośredniej na przykładzie testu

Slidex Strepto-kit firmy bioMeriux.

Test Slidex Strepto-kit służy do ustalenia przynależności paciorkowców

-

hemolizujących do określonej grupy serologicznej, na podstawie zawartości wielocukru C.
Opis zadania - Skrypt z Mikrobiologii, Rozdziała - Odczyny serologiczne.

Zadanie 3 - Odczyn hemaglutynacji (OHA) jakościowej.

MATERIAŁY:

1. Krwinki kurze.
2. Płyn fizjologiczny.
3. Płyn omoczniowy z zarodków kurzych zakażonych wirusem Newcastle (NDV).
4. Pipety.
5. Szkiełko podstawowe.

WYKONANIE:

1. Sporządzić 30 % zawiesinę krwinek kurzych w płynie fizjologicznym.
2. Pobrać pipetą płyn omoczniowy z zarodków kurzych zakażonych wirusem

Newcastle i nanieść krople na szkiełko podstawowe.

3. Świeżą pipetą pobrać 30 % zawiesinę krwinek kurzych i również nanieść kroplę na

szkiełko. Zmieszać dokładnie obie krople.

4. Sporządzić równolegle kontrolę, nanosząc na drugie szkiełko kroplę 30 %

zawiesinę krwinek i kroplę płynu fizjologicznego.

5. Po kilku minutach odczytać wynik. Wynik dodatni cechuje powstanie

charakterystycznych strątów i grudek zlepionych krwinek, przy czym płyn staje się
zupełnie klarowny.

19

ĆWICZENIE II

-

Odczyny serologiczne (część 2).

Zadanie 1 -

Oznaczanie przeciwciał i antygenów grupowych krwi ludzkiej.

Odczyn aglutynacji erytrocytów wykorzystywany jest przede wszystkim w celu

określania grup krwi ludzi i zwierząt oraz w diagnostyce chorób autoimmunologicznych.
Oznaczenie grupy krwi u ludzi (układ AB0) oraz czynnika Rh ma istotne znaczenie przy
przetaczaniu krwi, w ciąży konfliktowej, medycynie sądowej (ustalanie ojcostwa, identyfikacja
plam krwi) oraz w badaniach ludzkiej populacji. Oznaczanie układu AB0 przeprowadza się na
drodze ustalenia obecności antygenów A i B w badanych krwinkach przy użyciu wzorcowych
surowic oraz określenia w badanej surowicy obecnych naturalnych izoprzeciwciał anty-A i
anty-B za pomocą wzorcowych krwinek. W przypadku wystąpienia na badanych krwinkach
antygenu A, oznacza się także podgrupę A

1

i A

2

,

używając wyciągu z nasion: Dolichos biflorus

aglutynującego erytrocyty posiadające antygen A

1

i Ulex europaeus - aglutynujący erytrocyty z

antygenem A

2

. Występujące w tych wyciągach fiotaglutyniny zlepiają erytrocyty, lecz w

przeciwieństwie do swoistych przeciwciał nie powodują ich lizy w obecności dopełniacza.
Oznaczenie wykonuje się najczęściej metodą aglutynacji szkiełkowej na płytkach szklanych lub
szkiełkach podstawowych.

MATERIAŁY:

1.

Badana surowica ludzka.

2.

Badane krwinki pacjęta.

3.

0,85% NaCl.

4.

Surowice wzorcowe: anty-A, anty-B, anty-AB.

5.

Krwinki wzorcowe A, B (0-5% zawiesina w 0,85% NaCl) oraz A

1

, A

2

(2 %

zawiesina w 0,85% NaCl).

6.

Wyciąg z nasion Dolichos biflorus i Ulex europaeus.

7.

Szkiełka podstawowe.

8.

Bagietka szklana.

9.

Probówki.

10. Pipety miarowe i pasteurowskie.

WYKONANIE:
1.

Z badanych krwinek przygotować 5% zawiesinę w 0,85% NaCl.

2.

Na czyste szkiełko nanieść w trzech miejscach po 1 kropli surowic wzorcowych w
kolejności: anty-B, anty-A i anty-AB.

3.

Do każdej surowicy dodać zawiesiny badanych krwinek.

4.

Na drugim szkiełku podstawowym nanieść w trzech miejscach po 1 kropli
wzorcowych krwinek w kolejności: krwinki grupy 0, krwinki grupy A, krwinki
grupy B. Każda kroplę na szkiełkach wymieszać oddzielną bagietką lub rogiem
szkiełka podstawowego.

5.

Po 10 minutach inkubacji w temp. pokojowej odczytać wynik aglutynacji. W
przypadku oznaczenia grupy krwi A lub AB oznaczyć podgrupę A.

6.

Do oznaczenia przygotować 2 % zawiesinę badanych krwinek w 0,85 % NaCl.

7.

Na czterech szkiełkach podstawowych nanieść z jednej strony każdego szkiełka po
kropli wyciągu z Dolichos biflorus, z drugiej strony po kropli wyciągu z Ulex
europaeus.

8.

Do obu kropli na pierwszym szkiełku dodać po jednej kropli 2 % roztworu
badanych krwinek.

9.

Na kolejne trzy szkiełka (kontrolne) nanieść po jednej kropli: 2 % zawiesiny
krwinek wzorcowych A

1

(drugie szkiełko), 2 % zawiesinę krwinek wzorcowych A

2

(trzecie szkiełko) i krwinek wzorcowych 0 (czwarte szkiełko).

20

10. Każdą kroplę na wszystkich szkiełkach wymieszać oddzielną bagietką i po 5 min.

odczytać wynik aglutynacji.

Zadanie 2

- Immunoelektroforeza przeciwprądowa.

Zadanie 3

- Pośredni test ELISA (wykrywanie przeciwciał).

1.

Antygen (wirus).

2.

Dodatnie i ujemne standardowe surowice.

3.

Badane surowice.

4.

Przeciwciała obco gatunkowe (królicze IgG) przeciw ludzkim IgG związane z
enzymem (alkaliczną fosfatazą).

5.

Bufor węglanowy do opłaszczania o pH 9,6.

6.

Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) do przemywania.

7.

Mikropłytki polistyrenowe z 96 dołkami.

8.

Spektrofotometr (Titertek multiskan).

9.

Tabletki z substratem (Sigma).

10. 3M NaOH.
11. Bufor z dwuetanoloaminą o pH 9,8. Roztwór przechowywać w ciemności w

temp. 4

0

C.

12. Pipety automatyczne z plastikowymi końcówkami.
13. Probówki plastikowe do rozcieńczeń.
14. Pipety miarowe.
15. Woda destylowana.

WYKONANIE:
1.

Opłaszczyć płytki wirusem (antygenem) o stężeniu od 100

g białka/ml do 1g

białka/ml, przy czym optymalne stężenie białka należy ustalić doświadczalnie
wcześniej przed wykonaniem testu. W celu opłaszczenia dołków antygenem
rozcieńczyć odpowiednio buforem węglanowym do opłaszczania o pH 9,6 i dodać
100

l roztworu antygenu wirusa do każdego dołka na płytce.

2.

Płytki inkubować przez noc w temp. 4

0

C.

3.

Przemyć płytki pięciokrotnie, wlewając do każdego dołka po 300

l buforu do

przemywania, a po 10 min dokładnie je wytrząsnąć lub odsączyć na bibule.

4.

Wykonać dwukrotne rozcieńczenie badanej surowicy (np. do 1:2 do 1:2048 oraz
dodatniego i ujemnego standardu w buforze do rozcieńczeń ( z surowicą cielęcą;
surowica opłaszcza na płytce miejsca nie zajęte przez antygen).

5.

Każde rozcieńczenie surowicy rozlać do dwóch dołków na płytce po 100

l/dołek

i inkubować w temp. 4

0

C przez dwie godziny.

6.

Po inkubacji płytki ponownie przemyć pięciokrotnie w buforze do przemywania i
odsączyć.

7.

Dodać znakowane enzymem obcogatunkowe przeciwciała anty -I gG w ilości
100

l/dołek.

8.

Przeciwciała wstępnie rozcieńczyć do stężenia 5

g/ml.

9.

Ponownie inkubować płytki w temperaturze 4

0

C przez godzinę.

10. Płytki przemyć dwukrotnie buforem do przemywania i raz wodą destylowaną,

dokładnie odsączyć.

11. Sporządzić roztwór substratu rozpuszczając tabletki w buforze z dwuetanoloaminą

1tabletka na 5ml roztworu.

12. Do każdego dołka dodać po 100

l świeżego substratu.

21

13. Płytki z substratem inkubować w temp. 37

0

C przez 1-2 godziny.

14. Przerwać reakcję, dodając do każdego dołka po 50

l 3 M NaOH.

15. Odczytać absorbancję (OD) przy 405 nm.
16. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi rzędnych rozcieńczenia standardu

(dodatni), a na osi odciętych- wartość OD. Wykreślić również krzywą dla badanej
surowicy.

KiZMF AMG 2006

22