Podstawy analizy strukturalnej i funkcjonalnej białek, dwiczenia – biologia komórki 07.01.2014
Jak ktoś znajdzie błędy to krzyczed, za literówki i interpunkcję z góry przepraszam, jestem debilem :)

Analiza białek, kolejne etapy:

1. Przygotowanie próbek. Każdą próbkę należy utrzymywad w niskiej temperaturze (na lodzie) w celu

zahamowania działalności enzymów, które mogą rozłożyd dane białka. Próbki przygotowuje się poprzez
izolację danych białek z komórek.
Etapy izolacji białek:



Przemycie zimnym, sterylnym PBS masy komórkowej, z której ma byd izolowane białko, w celu
usunięcia pozostałości pożywki lub innych komórek.



Rozbicie błon komórki (etap pomija się w przypadku płynów ustrojowych). Po odciągnięciu roztworu
PBS komórki poddaje się zabiegom doprowadzającym do rozerwania błon komórkowych.
Odpowiednimi metodami są sonikacja (zastosowanie ultradźwięków), dzięki której można
„podziurawid” ściany komórek roślinnych, które nie ulegają lizie oraz homogenizacja w odpowiednim
homogenizatorze. Wszystkie procesy przeprowadza się w temperaturze około 4°C w celu uniknięcia
działalności enzymatycznej. Stosuje się inhibitory proteaz komórkowych, dodatkowo pH buforów
powinno byd dokładnie zmierzone, aby uniknąd uszkodzenia poszczególnych białek. Sposobem na
rozerwanie błon jest również liza osmotyczna. Komórki umieszcza się w roztworze hipotonicznym w
stosunku do cytoplazmy. W procesie osmozy woda przedostaje się do wnętrza komórek, powodując
ich pęcznienie i w koocu rozerwanie błon. Kiedy izolowane jest białko błonowe dodatkowo należy
zastosowad detergent niejonowy doprowadzający do uszkodzenia błon, bez naruszenia struktur
białkowych (np. Triton X-100).



Oddzielenie frakcji komórkowych od siebie (rozdział frakcji błon komórkowych, białek
rozpuszczalnych oraz frakcji nierozpuszczalnej na drodze wirowania).

Obecnie białka najczęściej izoluje się z komórek bakterii, drożdży oraz hodowlanych komórek ssaków na
zasadzie ich namnażania (na zasadzie rekombinacji DNA – wprowadzenie do genomu genu odpowiedzialnego
za ekspresje danego białka). Dzięki temu można uzyskad duże ilości białek, które naturalnie nie są
produkowane w wystarczających stężeniach w komórkach. W przypadku izolacji z materiału pobranego od
specyficznego osobnika należy wybrad tkankę, w której ekspresja danego białka wykazuje wysoki poziom.

2. Elektroforeza SDS – PAGE

Elektroforezę białek przeprowadza się w żelu poliakrylaminowym. Żel jest przygotowany tak, aby jego pory
miały odpowiednią wielkośd. Jej działanie jest oparte na zasadzie sita molekularnego – białka posiadające
większą masę wędrują w żelu wolniej niż białka posiadające małą masę.
Stosuje się 2 żele – rozdzielający i zagęszczający. Żel rozdzielający ma za zadanie zogniskowanie białek, tak
aby wystartowały one w tym samym czasie. Do przygotowania żelu stosuje się akrylamid i bisakrylamid,
odpowiednie bufory, różne dla żelu rozdzielającego i zagęszczającego, Temed – diamina, katalizator
polimeryzacji akrylamidu oraz SDS – dodecylosiarczan sodu – detergent jonowy nadający białkom ładunek
ujemny, dzięki temu wszystkie białka wędrują do anody. Dodatkowo dzięki obecności SDS struktura białka
zostaje rozwinięta (SDS wiąże hydrofobowe elementy białek), a białka nierozpuszczalne w wodzie stają się
rozpuszczalne. Obecnośd detergentu sprawia, że rozdział białek zawieszonych w żelu opiera się tylko na ich
masie. Dodatkowo stosuje się czynniki redukujące wiązania disiarczkowe -S-S- takie jak



-merkaptoetanol lub

DTT (ditiotreitol). Należy pamiętad o dodaniu antyoksydantów, które zapobiegają cofaniu się reakcji redukcji
wiązao disiarczkowych.
Przed nałożeniem próbek do żelu należy dokładnie oznaczyd stężenie każdej z nich za pomocą metody
Bradford (błękit kumazyny z którym reagują reszty argininy; w środowisku kwaśnym przyjmuje zabarwienie
brunatne, po reakcji z białkiem barwi się na niebiesko i wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali
595nm; natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze).
Do probówek należy dodad błękitu bromofenolowego, który służy jako marker elektroforezy oraz
odpowiedniego buforu, zwirowad, gotowad w temp. 100°C przez 5-8 minut, ponownie zwirowad. Przenieśd

do studzienki we wcześniej przygotowanym żelu poliakrylamidowym. Elektroforezę prowadzid do wyjścia
błękitu bromofenolowego z żelu rozdzielającego.
Po elektroforezie można przeprowadzid detekcję białek np. błękitem kumazyny lub barwnikami za bazie
srebra i złota.

3. Western Blotting



Przeniesienie białek na membranę

Stosuje się

membrany PVDF (charakteryzuj

ą się odpornością na działanie rozpuszczalników organicznych oraz

wytrzyma

łością mechaniczną) oraz nitrocelulozowe (mają dużą pojemność wiązania).

W transferze na

membranę duże znaczenie mają oddziaływania hydrofobowe, dodanie metanolu ułatwia wiązanie

kompleksów białka i SDS, jednak jego duże stężenie może doprowadzić do zmniejszenia elucji białek o dużej masie z
żelu w wyniku denaturacji. Membrany przed wykonaniem transferu należy moczyć w metanolu, przepłukać wodą
dejonizowana

, a następnie moczyć w buforze do elektrotransferu (dzięki temu błona będzie w stanie oddziaływać

hydrofobowo z białkami).
Złożyć „kanapkę” (gąbka, bibułka, membrana, żel, bibułka, gąbka; wszystko nasączone buforem) zamontować w
aparacie do transferu, tak aby żel znajdował się po stronie katody. Napełnić aparat buforem, przeprowadzić
elektrotransfer.
Białka przeniesione na błonę barwi się nietrwale np. w roztworze 2% Ponceau S w 3% kwasie octowym, w celu
sprawdzenia wydajności transferu. Następnie membranę odbarwia się w wodzie dejonizowanej. Białka przeniesione
na membrana, które nie będą wybarwiane przeciwciałami należy odciąć.



Immunodetekcja

Antygeny będące przedmiotem badao identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał, bądź przeciwciał
niewyznakowanych a identyfikowanych poprzez wyznakowane przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla
pierwszorzędowych. W koocu następuje detekcja, której sposób zależy od rodzaju użytych przeciwciał.

Przed detekcją przeciwciałami membranę należy zablokowad przez potraktowanie roztworem innego białka
(odtłuszczone mleko czy tam BSA) w celu zapobiegania niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała z membrana.

 Inkubacja z przeciwniałem I-rzędowym, mającym powinowactwo do badanego białka
 Płukanie buforem TBS (usunięcie niezwiązanego przeciwciała – kilkakrotnie na wytrząsarce)
 Inkubacja z przeciwciałem II-rzędowym, znakowanym (AP, HRP…), wykazującym powinowactwo do

przeciwciała I-rzędowego

 Znowu płukanie

Zastosowanie 2 przeciwciał zwiększa czułośd reakcji. Specyficzne przeciwciała znakowane są enzymem lub izotopem.

Reakcja barwna z AP i chemiluminescencyjna z HRP – obie oparte na reakcji enzymatycznej.

a) Barwna – reakcja daje barwny produkt umożliwiający wykrycie białka

AP (alkaiczna fosfataza) przekształca BCIP

(5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan) 

wytrącenie się

niebieskiego barwnika (indygo).

+ redukcja NBT

(błękit nitrotetrazolowy)  powstaje nierozpuszczalna purpurowa sól – formazan

b) Chemiluminescencja – reakcja zachodzi z wydzieleniem energii

ECL
Utlenienie luminolu w obecności H2O2 katalizowane przez HRP (peroksydaza chrzanu)  produkt ma
mniejszą energie niż substrat, wydzielenie energii w postaci fali λ=428 nm.

Reakcja chemiluminescencji jest czulsza niż barwna.

KOIMMUNOPRECYPITACJA – metoda pozwalająca badad interakcje pomiędzy białkami.

Dodanie do mieszaniny białek kulek sefarozowych oplaszczonych przeciwciałami specyficznymi dla danego, dobrze
poznanego białka  wychwycenie tego białka za pomocą kulek  wirowanie  zebranie frakcji z kulkami 
odseparowanie zebranych białek od kulek  elektroforeza zebranych frakcji białek  jeżeli w materiale znajduje się
więcej niż jedno białko oznacza to, że białka tworzą ze sobą kompleksy i dzięki temu osadziły się razem na kulkach
sefarozowych – między białkami dochodzi do interakcji. Można przez to wywnioskowad, że wykryte bialko pełni
podobne funkcje do tego, z którym się związało.