METODY REAKCJI
IMMUNOENZYMATYCZNYCH
mgr Magdalena Kujawiak
Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
RadioImmunoAssay (RIA)
Metody radioimmunologiczne (RIA) wykrywaj
ą
reakcj
ę
Ag ze
swoistym dla niego Ab w oparciu o pomiar radioaktywno
ś
ci
izotopu promieniotwórczego, którym wyznakowany jest jeden z
reagentów.
U
ż
ywa si
ę
izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H. Do znakowania
antygenów białkowych u
ż
ywa si
ę
jodu a do zwi
ą
zków
drobnocz
ą
steczkowych np.: trytu lub w
ę
gla
Technika wysoce czuła i swoista, wymagaj
ą
ca jednak
stosowania podwy
ż
szonych
ś
rodków ostro
ż
no
ś
ci (izotopy
promieniotwórcze) oraz specjalistycznego sprz
ę
tu.
RIA wykorzystuje si
ę
do oznaczania st
ęż
enia w płynach
ustrojowych hormonów, białek towarzysz
ą
cych nowotworom
(antygen CEA, AFP), do oznaczania ilo
ś
ci swoistych przeciwciał
klasy Ig E, do oznaczania witamin, leków, do wykrywania
obecno
ś
ci autoprzeciwciał.
Techniki radioimmunologiczne mo
ż
na prowadza
ć
na dwa
sposoby:
- oba składniki reakcji s
ą
w fazie płynnej
- jeden ze składników reakcji jest zwi
ą
zany z faz
ą
stał
ą
(no
ś
nikiem), drugi składnik znajduje si
ę
w fazie płynnej
Metoda kompetycyjna:
Przeciwciała inkubowane s
ą
z badanym Ag w obecno
ś
ci znanej
ilo
ś
ci Ag znakowanego izotopem. Oba Ag znakowany i
nieznakowany współzawodnicz
ą
o przeciwciała. Dokonuje si
ę
pomiaru radioaktywno
ś
ci Ag wolnego, pozostałego w roztworze
i radioaktywno
ś
ci antygenu zwi
ą
zanego w kompleksie. Wyniki
odczytuje si
ę
z równolegle wykonanej krzywej kalibracyjnej.
Metoda bezpo
ś
rednia:
Znakowany Ag inkubuje si
ę
z materiałem, w którym
poszukujemy danych Ab. Utworzony kompleks: znakowany Ag-
Ab wytr
ą
ca si
ę
z roztworu i mierzy radioaktywno
ść
zwi
ą
zan
ą
z
osadem. St
ęż
enie badanego Ab oblicza si
ę
z wykonanej
równolegle krzywej kalibracyjnej.
Metoda RIA została wyparta
przez testy ELISA, gdzie
sygnał radioaktywny
zast
ą
piono sygnałem
kolorymetrycznym.
ELISA
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny, jest
jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach
biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych
Słu
ż
y do:
– wykrywania i okre
ś
lania st
ęż
e
ń
leków, hormonów, enzymów,
nawet je
ż
eli wyst
ę
puj
ą
ona w bardzo małych ilo
ś
ciach w
płynach tkankowych
– do oceny odporno
ś
ci humoralnej (ocena st
ęż
enia
immunoglobulin w surowicy), układu dopełniacza (okre
ś
lenie
st
ęż
enia poszczególnych jego składników)
– rutynowo stosuje si
ę
w diagnostyce wirusa CMV, HIV,
rozpoznaniu WZW A itp.
– mo
ż
e te
ż
by
ć
stosowany do wykrywania alergenów
pokarmowych tj. mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w
przemy
ś
le spo
ż
ywczym
Test ELISA nale
ż
y do szerszej grupy tzw.
test
test
ó
ó
w fazy sta
w fazy sta
ł
ł
ej
ej, ale
nie jest pierwszym, który zosta
ł
wynaleziony, chocia
ż
jest
jednym z najcz
ęś
ciej stosowanych.
W metodzie ELISA stosuje si
ę
96- dołkow
ą
płytk
ę
płaskodenn
ą
wykonan
ą
z syntetycznych polimerów. Czuło
ść
tej metody
dorównuje metodzie RIA, a jest znacznie ta
ń
sza, prostsza i nie
nara
ż
a na kontakt z substancjami radioaktywnymi.
ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania
obecno
ś
ci Ab lub Ag w badanych próbach. Mo
ż
emy zastosowa
ć
metod
ę
po
ś
redni
ą
(2) lub bezpo
ś
redni
ą
(1). W metodzie
bezpo
ś
redniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab, które s
ą
znakowane natomiast w po
ś
redniej pierwsze Ab swoiste do Ag
nieznakowane i drugie Ab znakowane enzymem swoiste do
pierwszych przeciwciał.
ETAPY TESTU ELISA
1.
Opłaszczanie przeprowadza si
ę
przez dodanie do studzienki
antygenu przeznaczonego do
umieszczenia na fazie stałej.
Cało
ść
jest nast
ę
pnie inkubowana
przez okre
ś
lony czas, najpierw
zwykle w temperaturze 37°C, a
potem 4°C, cho
ć
mo
ż
liwe s
ą
tak
ż
e
inne metody, co zale
ż
y od
przeprowadzanego badania.
Temperatura jest jednym z
najwa
ż
niejszych czynników, nie
mo
ż
e jednak przekroczy
ć
56°C,
gdy
ż
w przypadku białek dojdzie do
denaturacji.
2.
Po przeprowadzeniu opłaszczenia
nale
ż
y jeszcze zablokowa
ć
miejsca
niezaj
ę
te przez antygen. Dokonuje
si
ę
tego za pomoc
ą
czynników
blokuj
ą
cych, np. roztworu
owoalbuminy lub odtłuszczonego
mleka, co zapobiega
nieselektywnemu przył
ą
czaniu si
ę
białek do fazy stałej podczas
nast
ę
pnych etapów testu,
wymagaj
ą
cych tak
ż
e inkubacji w
okre
ś
lonych temperaturach.
3. Nast
ę
pnie dodajemy
do studzienek płytki
próby surowicy w której
b
ę
dziemy wykrywa
ć
obecno
ść
Ab swoistych
do opłaszczonych Ag.
4. Dodajemy Ab
znakowane ezymem
skierowane przeciwko
ludzkim przeciwciałom.
5. Nanosimy substrat
dla enzymu np..
chromogen.
6. Odczytujemy wyniki
na spektrofotometrze.
Sandwich ELISA:
Ten rodzaj testu immunoenzymatycznego s
ł
u
ż
y zwykle do
okre
ś
lania st
ęż
enia danego antygenu (białka) w badanej
próbce. Angielska nazwa tej metody, sandwich ELISA, czyli
"kanapkowa" ELISA bierze si
ę
st
ą
d,
ż
e antygen wi
ą
zany jest
pomi
ę
dzy dwiema "warstwami" przeciwcia
ł
, co najlepiej mo
ż
na
prze
ś
ledzi
ć
, obserwuj
ą
c przebieg tej metody.
Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA
(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)
Stosuje si
ę
mieszank
ę
znakowanego Ag lub Ab, które s
ą
dodawane do badanego materiału. Gdy oznaczamy st
ęż
enia
przeciwciał w surowicy przeciwko danemu antygenowi,
podobnie jak w innych typach ELISA mierz
ą
cych st
ęż
enie Ab,
faza stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.
Je
ś
li na faz
ę
stał
ą
podziałamy mieszank
ą
badanej surowicy i
specyficznego wzgl
ę
dem danego antygenu mAb
wyznakowanego enzymem, to nast
ą
pi współzawodnictwo
pomi
ę
dzy przeciwciałami w surowicy, a przeciwciałem
znakowanym.
Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA
(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)
W odró
ż
nieniu od poprzednich metod nat
ęż
enie reakcji
enzymatycznej b
ę
dzie odwrotnie proporcjonalne do st
ęż
enia
przeciwciał w surowicy, gdy
ż
im wi
ę
ksze b
ę
dzie ich st
ęż
enie,
tym mniej znakowanego przeciwciała przył
ą
czy si
ę
do antygenu
umieszczonego na fazie stałej.
Stosowana jest równie
ż
alternatywna metoda, w której faza
stała jest opłaszczona przeciwciałem, natomiast rywalizacja o
miejsca wi
ążą
ce przeciwciał zachodzi mi
ę
dzy
standaryzowanym, wyznakowanym antygenem, a antygenem
zawartym w badanym materiale. Podobnie jak w wersji ze
znakowanym przeciwciałem, tak
ż
e tutaj sygnał jest odwrotnie
proporcjonalny do st
ęż
enia badanego antygenu.
ENZYMATYCZNE ZNACZNIKI Ab
peroksydaza chrzanowa (HRP)
– izolowana z korzeni chrzanu
– ma mał
ą
mas
ę
cz
ą
steczkow
ą
i g
ę
sto
ść
optyczn
ą
– łatwo wi
ąż
e si
ę
z białkami (do Ab za pomoc
ą
aldehydu
glutarowego)
– dzi
ę
ki du
ż
ej aktywno
ś
ci i swoisto
ś
ci jest najcz
ęś
ciej stosowana
metody immunoperoksydazowe
alkaliczna fosfataza (AP)
– otrzymywana z jelit ciel
ę
cych
– stosowana głównie jako znacznik w reakcjach z zastosowaniem
mAb
β
-D-galaktozydaza
– pochodzenia bakteryjnego
– przydatna do wykrywania kilku Ag
oksydaza glukozowa
– enzym bakteryjny
brak niebezpiecze
ń
stwa wyników fałszywie
dodatnich
WYKRYWANIE ENZYMÓW
ZNACZNIKOWYCH
peroksydaza chrzanowa
– woda utleniona
HRP + H2O2
HRP
·
H2O2
HRP
·
H2O2 + chromogen (bezbarwny)
H2O + barwny zwi
ą
zek
ortofenylodiamina
barwa pomara
ń
czowa
DAB (diaminobenzydyna)
powstaje br
ą
zowy polimer, dodanie soli
miedzi, kobaltu, niklu lub złota intensyfikuje barw
ę
i doprowadza do
jej zmiany na niebiesk
ą
/czarn
ą
TMB (tetrametylobenzydyna)
barwa
ż
ółta
alkaliczna fosfataza
– substratem s
ą
estry fosforanowe naftolu
– stopowanie reakcji 0,1N NaOH
Ab BIOTYNYLOWANE
Ab z przył
ą
czon
ą
biotyn
ą
(B), która bardzo dobrze wi
ąż
e si
ę
z
awidyn
ą
(A, białko jaja kurzego), któr
ą
z kolei mo
ż
na sprz
ęż
y
ć
z
enzymem (E).
Awidyna bardzo łatwo wi
ąż
e si
ę
z białkami o przesuni
ę
tym pI w
kierunku zasadowego, dlatego mo
ż
na j
ą
zast
ą
pi
ć
streptawidyn
ą
,
która nie posiada takich wła
ś
ciwo
ś
ci.
Ab biotynylowane stosuje si
ę
, poniewa
ż
cz
ę
sto poł
ą
czenie
enzymu z małym Ab mo
ż
e zmienia
ć
jego wła
ś
ciwo
ś
ci wi
ą
zania
si
ę
z Ag.
B
A
E
ZNACZENIE REAKCJI KONTROLNYCH
konieczne mimo wysokiej swoisto
ś
ci metody, poniewa
ż
istnieje mo
ż
liwo
ść
zaj
ś
cia reakcji krzy
ż
owych, z innym ni
ż
wykrywane Ab oraz wyst
ę
puj
ą
słabe wi
ą
zania (elektrostatyczne i hydrofobowe) miedzy materiałem
biologicznym i Ab
najcz
ęś
ciej stosowane reakcje kontrolne:
*kontrola negatywna:
– kontrola adsorpcyjna (u
ż
ycie Ab, które zostały uprzednio zwi
ą
zane ze
swoistym Ag in vitro );
– blokowanie wła
ś
ciwej reakcji przez preinkubacj
ę
ze swoistym, lecz nie
znakowanym Ab (przy reakcjach bezpo
ś
rednich);
– inkubacja z surowic
ą
nieimmunizowanego zwierz
ę
cia gatunku, który
posłu
ż
ył do uzyskania Ab, zamiast pierwszego przeciwciała swoistego
dla danego Ag (przy reakcjach po
ś
rednich);
– inkubacja bez mostka immunoglobulinowego (w reakcjach
immunoenzymatycznych z u
ż
yciem mostka);
– wykonanie reakcji wykrywaj
ą
cej aktywno
ść
enzymu znacznikowego z
pomini
ę
ciem poprzednich etapów procedury immunoenzymatycznej
*kontrola pozytywna: sprawdzaj
ą
ca czy zastosowane Ab wi
ąż
e si
ę
z Ag
Staje si
ę
coraz bardziej uznanym narz
ę
dziem w nowoczesnej
medycynie.
Technika ma ju
ż
ugruntowan
ą
pozycj
ę
w takich dziedzinach jak:
•biotechnologia (produkcja i selekcja przeciwciał),
•wakcynologia (produkcja i testowanie szczepionek),
•immunologia (badania naukowe i diagnostyka),
•choroby zaka
ź
ne (testy diagnostyczne o podwy
ż
szonej
czuło
ś
ci),
•onkologia (rozwój immunoterapii i testy leków
przeciwnowotworowych)
•
•
alergologii do
alergologii do
ś
ś
wiadczalnej i klinicznej (coraz cz
wiadczalnej i klinicznej (coraz cz
ęś
ęś
ciej
ciej
stosowana).
stosowana).
ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay),
synonimy
synonimy: Immunospot, ELISA Spot,
ELISA-plaque.
ELISPOT
, podobnie jak
ELISA
, opiera si
ę
na stosowaniu par
przeciwciał wi
ążą
cych oraz detekcyjnych.
Istotne ró
ż
nice:
-wi
ą
zanie przeciwciał z faz
ą
stał
ą
odbywa si
ę
w trakcie hodowli
komórkowej, dzi
ę
ki czemu ELISPOT przezwyci
ęż
a szereg problemów
metodycznych techniki ELISA oraz zapewnia wysok
ą
czuło
ść
-w
ś
ród 1 000 000 komórek mo
ż
na wykry
ć
pojedyncz
ą
komórk
ę
wydzielaj
ą
c
ą
dane białko (cytokin
ę
, białko efektorowe, receptor,
marker powierzchniowy lub przeciwciało)
-ELISPOT nie jest wra
ż
liwy na zachodz
ą
c
ą
w hodowli konsumpcj
ę
badanej cytokiny (jest to istotne np. przy oznaczaniu IL-4 lub IL-2).
Dual ELISPOT
To rozwini
ę
cie techniki, umo
ż
liwiaj
ą
ce
ś
ledzenie wydzielania ró
ż
nych
białek przez t
ę
sam
ą
komórk
ę
. Dzi
ę
ki poł
ą
czeniu metod ELISPOT i
ELISA mo
ż
na ponadto szacowa
ć ś
redni
ą
produkcj
ę
cytokin przez
pobudzone komórki.
Urz
ą
dzenie zapewnia rozbudowane mo
ż
liwo
ś
ci analizy płytek:
- analiza obrazu oparta na zaawansowanych algorytmach,
- analiza dwubarwna - Dual ELISPOT,
- mo
ż
liwo
ść
grupowania wyników i tworzenia statystyk podczas
analizy płytek i wiele innych mo
ż
liwo
ś
ci
W wielu laboratoriach barier
ą
w zastosowaniu techniki ELISPOT
jest dotychczas wysoki koszt aparatury.
Istnieje jednak mo
ż
liwo
ść
korzystania z usługowego
skanowania płytek i przesyłania skanów do firmy posiadaj
ą
cej
czytnik.
ELISPOT
Komórki inkubuje si
ę
w płytkach ELISpot.
Dno ka
ż
dego dołka płytki zostało uprzednio opłaszczone Ab wi
ążą
cymi
(pierwotne, opłaszczaj
ą
ce). Ab te s
ą
swoiste wobec interesuj
ą
cego nas
białka, np. okre
ś
lonej cytokiny, Ab, markera błonowego, receptora itd.
Je
ż
eli w trakcie hodowli komórka wydzieli interesuj
ą
ce nas białko, to
zostanie ono zwi
ą
zane z dnem dołka przez Ab wi
ążą
ce. Wi
ą
zanie takie
jest swoiste, dlatego do membrany wi
ą
zane s
ą
tylko interesuj
ą
ce nas
cz
ą
steczki.
Po zako
ń
czeniu hodowli zawarto
ść
dołków hodowlanych jest usuwana,
a płytk
ę
dokładnie i wielokrotnie płuczemy.
Na dnie dołka pozostaje jedynie badane białko zwi
ą
zane Ab
pierwotnym.
Dodajemy znakowane biotyn
ą
Ab wtórne (detekcyjne), które wi
ąż
e si
ę
z innym epitopem badanego białka.
W kolejnym etapie do utworzonego na płytce KI dodajemy sprz
ęż
ony
ze streptawidyn
ą
enzym (np. peroksydaz
ę
chrzanow
ą
- HRP).
Streptawidyna silnie wi
ąż
e si
ę
z biotyn
ą
znakuj
ą
c
ą
przeciwciało wtórne
(detekcyjne).
Dokładne płukanie płytki usuwa nadmiar enzymu.
Nast
ę
pnie na płytk
ę
nanosimy substrat.
W wyniku reakcji zachodz
ą
cej pod wpływem enzymu powstaje barwnik,
który osadza si
ę
na dnie dołka.
Reakcj
ę
barwn
ą
zatrzymujemy przez dokładne wypłukanie i
wysuszenie płytki.
W miejscu reakcji immunoenzymatycznej powstaje plamka barwna.
Przyjmuje si
ę
, ze ka
ż
da plamka jest
ś
ladem jednej komórki
wydzielaj
ą
cej badane białko.
W przypadku komórek szybko dziel
ą
cych si
ę
, mówimy o "jednostkach
tworz
ą
cych plamk
ę
" (spot forming units - SFU).
Po lewej stronie wida
ć
wynik hodowli, w której liczne komórki
wydzielały analizowane białko (w tym przypadku interferon-
γ
). Po
prawej hodowla, w której znacznie mniej komórek wydzielało IFN-
γ
.
Ostatnim etapem jest liczenie plamek.
Dawniej praca ta była wykonywana pod mikroskopem, co znacznie
zwi
ę
kszało nakład pracy, a tym samym ograniczało zastosowanie
metody.
Obecnie liczenie plamek barwnych wykonuje si
ę
automatyczne za
pomoc
ą
specjalnego skanera z systemem analizy obrazu.
ELISPOT
komputerowa analiza obrazu
REAKCJE IMMUNOCHEMICZNE
Jedn
ą
z bardziej skomplikowanych odmian reakcji po
ś
redniej jest
reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzym-
antyenzym.
Jej zalet
ą
jest wykrywanie nawet niewielkich ilo
ś
ci Ag w skrawkach
parafinowych.
W tym przypadku znakowanie enzymem odbywa si
ę
dzi
ę
ki
wykorzystaniu antygenowych własno
ś
ci białek enzymatycznych.
Powstaj
ą
kompleksy enzym- swoiste Ab.
Najcz
ęś
ciej stosowane s
ą
kompleksy w
immunomorfologii:
(PAP) peroksydaza-
antyperoksydaza
(APAAP) fosfataza zasadowa-
antyfosfataza
Reakcja składa si
ę
z trzech etapów:
najpierw prowadzi si
ę
inkubacj
ę
z
nieznakowanym Ab pierwotnym
powstaje kompleks A-X-anty-A
nast
ę
pnie z Ab wtórnym (wi
ążą
cym,
tzw. mostkiem)
nieznakowanym
Ab zwierz
ę
cia Y skierowanym
przeciw Ab zwierz
ę
cia X - tworzy
si
ę
mostek immunoglobulinowy
do mostka przył
ą
cza si
ę
kompleks
enzym-antyenzym, w którym Ab
pochodzi od zwierz
ę
cia X
Metoda o wysokiej swoisto
ś
ci i
czuło
ś
ci, poniewa
ż
nie stosuje si
ę
chemicznego sprz
ę
gania, które mo
ż
e
deformowa
ć
cz
ą
steczki Ab, a jedno
miejsce antygenowe mo
ż
e wi
ą
za
ć
kilka
cz
ą
steczek enzymu znacznikowego.
Wizualizacja odczynu PAP:
– dwuaminobenzydyna (DAB)
brunatny produkt obecny w
komórkach lub tkankach, nierozpuszczalny w alkoholu/ksylenie
wyznacza miejsce reakcji.
– inkubacja z ka
ż
dym reagentem trwa ok. 30min. w temp. pokojowej
– zastosowanie temp. 37°C skraca czas reakcji
– w czasie wykonywania odczynu nie mo
ż
na dopu
ś
ci
ć
do
wyschni
ę
cia skrawków
komora wilgotna
Metoda APAAP:
– stosowana przy tkankach zawieraj
ą
cych du
ż
o endogennej
peroksydazy (szpik, komórki limfoidalne)
– kompleks zawiera 2 cz
ą
steczki fosfatazy zasadowej i 1 Ab
skierowanego przeciwko temu enzymowi
– wizualizacja odczynu: Nowa Fuksyna lub Fast Red
powstaje
czerwony lub ró
ż
owo-czerwony precypitat rozpuszczalny w
alkoholu (dlatego preparat musi by
ć
zamkni
ę
ty w wodnym medium
– glicero-
ż
elu)
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
więcej podobnych podstron