Metody reakcji immunoenzymatycznych

METODY REAKCJI

IMMUNOENZYMATYCZNYCH

mgr Magdalena Kujawiak

Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

RadioImmunoAssay (RIA)

Metody radioimmunologiczne (RIA) wykrywaj

reakcj

Ag ze

swoistym dla niego Ab w oparciu o pomiar radioaktywno

izotopu promieniotwórczego, którym wyznakowany jest jeden z
reagentów.

ywa si

izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H. Do znakowania

antygenów białkowych u

ywa si

jodu a do zwi

zków

drobnocz

steczkowych np.: trytu lub w

gla

Technika wysoce czuła i swoista, wymagaj

ca jednak

stosowania podwy

szonych

rodków ostro

ci (izotopy

promieniotwórcze) oraz specjalistycznego sprz

tu.

RIA wykorzystuje si

do oznaczania st

ęż

enia w płynach

ustrojowych hormonów, białek towarzysz

cych nowotworom

(antygen CEA, AFP), do oznaczania ilo

ci swoistych przeciwciał

klasy Ig E, do oznaczania witamin, leków, do wykrywania
obecno

ci autoprzeciwciał.

Techniki radioimmunologiczne mo

na prowadza

na dwa

sposoby:
- oba składniki reakcji s

w fazie płynnej

- jeden ze składników reakcji jest zwi

zany z faz

stał

(no

nikiem), drugi składnik znajduje si

w fazie płynnej

Metoda kompetycyjna:
Przeciwciała inkubowane s

z badanym Ag w obecno

ci znanej

ilo

ci Ag znakowanego izotopem. Oba Ag znakowany i

nieznakowany współzawodnicz

o przeciwciała. Dokonuje si

pomiaru radioaktywno

ci Ag wolnego, pozostałego w roztworze

i radioaktywno

ci antygenu zwi

zanego w kompleksie. Wyniki

odczytuje si

z równolegle wykonanej krzywej kalibracyjnej.

Metoda bezpo

rednia:

Znakowany Ag inkubuje si

z materiałem, w którym

poszukujemy danych Ab. Utworzony kompleks: znakowany Ag-
Ab wytr

ca si

z roztworu i mierzy radioaktywno

ść

zwi

zan

osadem. St

ęż

enie badanego Ab oblicza si

z wykonanej

równolegle krzywej kalibracyjnej.

Metoda RIA została wyparta

przez testy ELISA, gdzie

sygnał radioaktywny

zast

piono sygnałem

kolorymetrycznym.

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny, jest
jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach
biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych

Słu

y do:

– wykrywania i okre

lania st

ęż

leków, hormonów, enzymów,

nawet je

eli wyst

puj

ona w bardzo małych ilo

ciach w

płynach tkankowych

– do oceny odporno

ci humoralnej (ocena st

ęż

enia

immunoglobulin w surowicy), układu dopełniacza (okre

lenie

ęż

enia poszczególnych jego składników)

– rutynowo stosuje si

w diagnostyce wirusa CMV, HIV,

rozpoznaniu WZW A itp.

– mo

e te

stosowany do wykrywania alergenów

pokarmowych tj. mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w
przemy

le spo

ywczym

Test ELISA nale

y do szerszej grupy tzw.

test

w fazy sta

ej, ale

nie jest pierwszym, który zosta

wynaleziony, chocia

jest

jednym z najcz

ęś

ciej stosowanych.

W metodzie ELISA stosuje si

96- dołkow

płytk

płaskodenn

wykonan

z syntetycznych polimerów. Czuło

ść

tej metody

dorównuje metodzie RIA, a jest znacznie ta

sza, prostsza i nie

nara

a na kontakt z substancjami radioaktywnymi.

ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania
obecno

ci Ab lub Ag w badanych próbach. Mo

emy zastosowa

metod

redni

(2) lub bezpo

redni

(1). W metodzie

bezpo

redniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab, które s

znakowane natomiast w po

redniej pierwsze Ab swoiste do Ag

nieznakowane i drugie Ab znakowane enzymem swoiste do
pierwszych przeciwciał.

ETAPY TESTU ELISA

Opłaszczanie przeprowadza si

przez dodanie do studzienki
antygenu przeznaczonego do
umieszczenia na fazie stałej.
Cało

ść

jest nast

pnie inkubowana

przez okre

lony czas, najpierw

zwykle w temperaturze 37°C, a
potem 4°C, cho

liwe s

tak

inne metody, co zale

y od

przeprowadzanego badania.
Temperatura jest jednym z
najwa

niejszych czynników, nie

e jednak przekroczy

56°C,

gdy

w przypadku białek dojdzie do

denaturacji.

Po przeprowadzeniu opłaszczenia
nale

y jeszcze zablokowa

miejsca

niezaj

te przez antygen. Dokonuje

tego za pomoc

czynników

blokuj

cych, np. roztworu

owoalbuminy lub odtłuszczonego
mleka, co zapobiega
nieselektywnemu przył

czaniu si

białek do fazy stałej podczas
nast

pnych etapów testu,

wymagaj

cych tak

e inkubacji w

okre

lonych temperaturach.

3. Nast

pnie dodajemy

do studzienek płytki
próby surowicy w której
b

dziemy wykrywa

obecno

ść

Ab swoistych

do opłaszczonych Ag.

4. Dodajemy Ab
znakowane ezymem
skierowane przeciwko
ludzkim przeciwciałom.

5. Nanosimy substrat
dla enzymu np..
chromogen.

6. Odczytujemy wyniki
na spektrofotometrze.

Sandwich ELISA:

Ten rodzaj testu immunoenzymatycznego s

y zwykle do

okre

lania st

ęż

enia danego antygenu (białka) w badanej

próbce. Angielska nazwa tej metody, sandwich ELISA, czyli
"kanapkowa" ELISA bierze si

e antygen wi

zany jest

pomi

dzy dwiema "warstwami" przeciwcia

, co najlepiej mo

prze

ledzi

, obserwuj

c przebieg tej metody.

Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA

(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)

Stosuje si

mieszank

znakowanego Ag lub Ab, które s

dodawane do badanego materiału. Gdy oznaczamy st

ęż

enia

przeciwciał w surowicy przeciwko danemu antygenowi,
podobnie jak w innych typach ELISA mierz

cych st

ęż

enie Ab,

faza stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.

li na faz

stał

podziałamy mieszank

badanej surowicy i

specyficznego wzgl

dem danego antygenu mAb

wyznakowanego enzymem, to nast

pi współzawodnictwo

pomi

dzy przeciwciałami w surowicy, a przeciwciałem

znakowanym.

Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA

(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)

W odró

nieniu od poprzednich metod nat

ęż

enie reakcji

enzymatycznej b

dzie odwrotnie proporcjonalne do st

ęż

enia

przeciwciał w surowicy, gdy

im wi

ksze b

dzie ich st

ęż

enie,

tym mniej znakowanego przeciwciała przył

czy si

do antygenu

umieszczonego na fazie stałej.

Stosowana jest równie

alternatywna metoda, w której faza

stała jest opłaszczona przeciwciałem, natomiast rywalizacja o
miejsca wi

ążą

ce przeciwciał zachodzi mi

dzy

standaryzowanym, wyznakowanym antygenem, a antygenem
zawartym w badanym materiale. Podobnie jak w wersji ze
znakowanym przeciwciałem, tak

e tutaj sygnał jest odwrotnie

proporcjonalny do st

ęż

enia badanego antygenu.

ENZYMATYCZNE ZNACZNIKI Ab

peroksydaza chrzanowa (HRP)

– izolowana z korzeni chrzanu
– ma mał

mas

steczkow

i g

sto

ść

optyczn

– łatwo wi

ąż

e si

z białkami (do Ab za pomoc

aldehydu

glutarowego)

– dzi

ki du

ej aktywno

ci i swoisto

ci jest najcz

ęś

ciej stosowana

metody immunoperoksydazowe

alkaliczna fosfataza (AP)

– otrzymywana z jelit ciel

cych

– stosowana głównie jako znacznik w reakcjach z zastosowaniem

mAb

-D-galaktozydaza

– pochodzenia bakteryjnego
– przydatna do wykrywania kilku Ag

oksydaza glukozowa

– enzym bakteryjny

brak niebezpiecze

stwa wyników fałszywie

dodatnich

WYKRYWANIE ENZYMÓW

ZNACZNIKOWYCH

peroksydaza chrzanowa

– woda utleniona

HRP + H2O2

HRP

H2O2

HRP

H2O2 + chromogen (bezbarwny)

H2O + barwny zwi

zek

ortofenylodiamina

barwa pomara

czowa

DAB (diaminobenzydyna)

powstaje br

zowy polimer, dodanie soli

miedzi, kobaltu, niklu lub złota intensyfikuje barw

i doprowadza do

jej zmiany na niebiesk

/czarn

TMB (tetrametylobenzydyna)

barwa

ółta

alkaliczna fosfataza

– substratem s

estry fosforanowe naftolu

– stopowanie reakcji 0,1N NaOH

Ab BIOTYNYLOWANE

Ab z przył

czon

biotyn

(B), która bardzo dobrze wi

ąż

e si

awidyn

(A, białko jaja kurzego), któr

z kolei mo

na sprz

ęż

enzymem (E).

Awidyna bardzo łatwo wi

ąż

e si

z białkami o przesuni

tym pI w

kierunku zasadowego, dlatego mo

na j

zast

streptawidyn

która nie posiada takich wła

ciwo

ci.

Ab biotynylowane stosuje si

, poniewa

sto poł

czenie

enzymu z małym Ab mo

e zmienia

jego wła

ciwo

ci wi

zania

z Ag.

ZNACZENIE REAKCJI KONTROLNYCH

konieczne mimo wysokiej swoisto

ci metody, poniewa

istnieje mo

liwo

ść

zaj

cia reakcji krzy

owych, z innym ni

wykrywane Ab oraz wyst

puj

słabe wi

zania (elektrostatyczne i hydrofobowe) miedzy materiałem

biologicznym i Ab

najcz

ęś

ciej stosowane reakcje kontrolne:

*kontrola negatywna:

– kontrola adsorpcyjna (u

ycie Ab, które zostały uprzednio zwi

zane ze

swoistym Ag in vitro );

– blokowanie wła

ciwej reakcji przez preinkubacj

ze swoistym, lecz nie

znakowanym Ab (przy reakcjach bezpo

rednich);

– inkubacja z surowic

nieimmunizowanego zwierz

cia gatunku, który

posłu

ył do uzyskania Ab, zamiast pierwszego przeciwciała swoistego

dla danego Ag (przy reakcjach po

rednich);

– inkubacja bez mostka immunoglobulinowego (w reakcjach

immunoenzymatycznych z u

yciem mostka);

– wykonanie reakcji wykrywaj

cej aktywno

ść

enzymu znacznikowego z

pomini

ciem poprzednich etapów procedury immunoenzymatycznej

*kontrola pozytywna: sprawdzaj

ca czy zastosowane Ab wi

ąż

e si

z Ag

Staje si

coraz bardziej uznanym narz

dziem w nowoczesnej

medycynie.

Technika ma ju

ugruntowan

pozycj

w takich dziedzinach jak:

•biotechnologia (produkcja i selekcja przeciwciał),
•wakcynologia (produkcja i testowanie szczepionek),
•immunologia (badania naukowe i diagnostyka),
•choroby zaka

ne (testy diagnostyczne o podwy

szonej

czuło

ci),

•onkologia (rozwój immunoterapii i testy leków
przeciwnowotworowych)

•

alergologii do

wiadczalnej i klinicznej (coraz cz

ęś

ciej

stosowana).

ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay),

synonimy

synonimy: Immunospot, ELISA Spot,

ELISA-plaque.

ELISPOT

, podobnie jak

ELISA

, opiera si

na stosowaniu par

przeciwciał wi

ążą

cych oraz detekcyjnych.

Istotne ró

nice:

-wi

zanie przeciwciał z faz

stał

odbywa si

w trakcie hodowli

komórkowej, dzi

ki czemu ELISPOT przezwyci

ęż

a szereg problemów

metodycznych techniki ELISA oraz zapewnia wysok

czuło

ść

-w

ród 1 000 000 komórek mo

na wykry

pojedyncz

komórk

wydzielaj

dane białko (cytokin

, białko efektorowe, receptor,

marker powierzchniowy lub przeciwciało)

-ELISPOT nie jest wra

liwy na zachodz

w hodowli konsumpcj

badanej cytokiny (jest to istotne np. przy oznaczaniu IL-4 lub IL-2).

Dual ELISPOT

To rozwini

cie techniki, umo

liwiaj

ledzenie wydzielania ró

nych

białek przez t

sam

komórk

. Dzi

ki poł

czeniu metod ELISPOT i

ELISA mo

na ponadto szacowa

ć ś

redni

produkcj

cytokin przez

pobudzone komórki.

Urz

dzenie zapewnia rozbudowane mo

liwo

ci analizy płytek:

- analiza obrazu oparta na zaawansowanych algorytmach,
- analiza dwubarwna - Dual ELISPOT,
- mo

liwo

ść

grupowania wyników i tworzenia statystyk podczas

analizy płytek i wiele innych mo

liwo

W wielu laboratoriach barier

w zastosowaniu techniki ELISPOT

jest dotychczas wysoki koszt aparatury.

Istnieje jednak mo

liwo

ść

korzystania z usługowego

skanowania płytek i przesyłania skanów do firmy posiadaj

cej

czytnik.

ELISPOT

Komórki inkubuje si

w płytkach ELISpot.

Dno ka

dego dołka płytki zostało uprzednio opłaszczone Ab wi

ążą

cymi

(pierwotne, opłaszczaj

ce). Ab te s

swoiste wobec interesuj

cego nas

białka, np. okre

lonej cytokiny, Ab, markera błonowego, receptora itd.

eli w trakcie hodowli komórka wydzieli interesuj

ce nas białko, to

zostanie ono zwi

zane z dnem dołka przez Ab wi

ążą

ce. Wi

zanie takie

jest swoiste, dlatego do membrany wi

zane s

tylko interesuj

ce nas

steczki.

Po zako

czeniu hodowli zawarto

ść

dołków hodowlanych jest usuwana,

a płytk

dokładnie i wielokrotnie płuczemy.

Na dnie dołka pozostaje jedynie badane białko zwi

zane Ab

pierwotnym.

Dodajemy znakowane biotyn

Ab wtórne (detekcyjne), które wi

ąż

e si

z innym epitopem badanego białka.

W kolejnym etapie do utworzonego na płytce KI dodajemy sprz

ęż

ony

ze streptawidyn

enzym (np. peroksydaz

chrzanow

- HRP).

Streptawidyna silnie wi

ąż

e si

z biotyn

znakuj

przeciwciało wtórne

(detekcyjne).

Dokładne płukanie płytki usuwa nadmiar enzymu.

Nast

pnie na płytk

nanosimy substrat.

W wyniku reakcji zachodz

cej pod wpływem enzymu powstaje barwnik,

który osadza si

na dnie dołka.

Reakcj

barwn

zatrzymujemy przez dokładne wypłukanie i

wysuszenie płytki.

W miejscu reakcji immunoenzymatycznej powstaje plamka barwna.

Przyjmuje si

, ze ka

da plamka jest

ladem jednej komórki

wydzielaj

cej badane białko.

W przypadku komórek szybko dziel

cych si

, mówimy o "jednostkach

tworz

cych plamk

" (spot forming units - SFU).

Po lewej stronie wida

wynik hodowli, w której liczne komórki

wydzielały analizowane białko (w tym przypadku interferon-

). Po

prawej hodowla, w której znacznie mniej komórek wydzielało IFN-

Ostatnim etapem jest liczenie plamek.

Dawniej praca ta była wykonywana pod mikroskopem, co znacznie
zwi

kszało nakład pracy, a tym samym ograniczało zastosowanie

metody.

Obecnie liczenie plamek barwnych wykonuje si

automatyczne za

pomoc

specjalnego skanera z systemem analizy obrazu.

ELISPOT

komputerowa analiza obrazu

REAKCJE IMMUNOCHEMICZNE

Jedn

z bardziej skomplikowanych odmian reakcji po

redniej jest

reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzym-
antyenzym.

Jej zalet

jest wykrywanie nawet niewielkich ilo

ci Ag w skrawkach

parafinowych.

W tym przypadku znakowanie enzymem odbywa si

dzi

wykorzystaniu antygenowych własno

ci białek enzymatycznych.

Powstaj

kompleksy enzym- swoiste Ab.

Najcz

ęś

ciej stosowane s

kompleksy w
immunomorfologii:

(PAP) peroksydaza-
antyperoksydaza

(APAAP) fosfataza zasadowa-
antyfosfataza

Reakcja składa si

z trzech etapów:

najpierw prowadzi si

inkubacj

nieznakowanym Ab pierwotnym

powstaje kompleks A-X-anty-A

nast

pnie z Ab wtórnym (wi

ążą

cym,

tzw. mostkiem)

nieznakowanym

Ab zwierz

cia Y skierowanym

przeciw Ab zwierz

cia X - tworzy

mostek immunoglobulinowy

do mostka przył

cza si

kompleks

enzym-antyenzym, w którym Ab
pochodzi od zwierz

cia X

Metoda o wysokiej swoisto

ci i

czuło

ci, poniewa

nie stosuje si

chemicznego sprz

gania, które mo

deformowa

steczki Ab, a jedno

miejsce antygenowe mo

e wi

kilka

steczek enzymu znacznikowego.

Wizualizacja odczynu PAP:

– dwuaminobenzydyna (DAB)

brunatny produkt obecny w

komórkach lub tkankach, nierozpuszczalny w alkoholu/ksylenie
wyznacza miejsce reakcji.

– inkubacja z ka

dym reagentem trwa ok. 30min. w temp. pokojowej

– zastosowanie temp. 37°C skraca czas reakcji

– w czasie wykonywania odczynu nie mo

na dopu

wyschni

cia skrawków

komora wilgotna

Metoda APAAP:

– stosowana przy tkankach zawieraj

cych du

o endogennej

peroksydazy (szpik, komórki limfoidalne)

– kompleks zawiera 2 cz

steczki fosfatazy zasadowej i 1 Ab

skierowanego przeciwko temu enzymowi

– wizualizacja odczynu: Nowa Fuksyna lub Fast Red

powstaje

czerwony lub ró

owo-czerwony precypitat rozpuszczalny w

alkoholu (dlatego preparat musi by

zamkni

ty w wodnym medium

– glicero-

elu)