choroby zakaźne II

background image

Choroby zakaźne

Antybiogram

Oznaczanie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną Kirby – Bauera

Metoda krążkowo-dyfuzyjna Kirby-Bauera jest oparta na dyfuzji antybiotyku

zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście przez agar,
tworząc gradient stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach
krążka i spada wraz z odległością od krążka. Wielkość strefy zahamowania wzrostu
bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na antybiotyk - im

większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa.

W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe, średnio wrażliwe
lub oporne. Metoda krążkowo-dyfuzyjna jest najczęściej używaną metodą testowania
lekooporności. Jest ona dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania.

Posiada jednak ograniczenia. Nie jest wiarygodna w testowaniu wolno-rosnących
organizmów, bezwzględnych bakterii beztlenowych. Niektóre antybiotyki słabo
dyfundują w agarze, przez co różnica w strefach zahamowania dla bakterii

wrażliwych i opornych jest niewielka, co może prowadzić do nieprawidłowego
określenia lekooporności (antybiotyki glikopeptydowe, polimyksyna B).

background image

Choroby zakaźne

Antybiogram

Materiały:

podłoże agar Mulera- Hinton (MHA2)

1 ml jałowej 0,85% soli fizjologiczna (NaCl)

krążki bibułowe z antybiotykiem – np. firma Oxoid

zawiesina bakteryjna – w skali 0,5 McFarlanda

wzorzec – 0,5 McFarlanda

jałowe wymazówki

Inoculum przygotować ze świeżej, osiemnastogodzinnej hodowli bakterii na podłożu MHA2. Kilka

kolonii bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze 0,85% NaCl, celem uzyskania

zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1 - 10

8

do

2 - 10

8

 c.f.u./ml. Gęstość zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru

Gotową zawiesinę w ciągu 15 minut rozprowadzić na powierzchni podłoża MHA2 przy użyciu

jałowej wymazówki. Po 15 minutach na posiane podłoże nakłożyc krążki z antybiotykami i

chemioterapeutykami. Tak przygotowane płytki w ciągu następnych 15 minut wstawić do
cieplarki i inkubowć w warunkach tlenowych 16-18 godzin, w temperaturze 37ºC

.

background image

Choroby zakaźne

Antybiogram

background image

Choroby zakaźne

Wirusy

Metody izolacji i namnażania wirusów.

Wirusy nie replikują poza komórką żywą, zatem hodowla wirusów odbywa się in vivo
w komórkach organizmów żywych lub in vitro poprzez namnażanie cząstek wirusa w

hodowlach komórkowych albo tkankowych.

Metoda namnażania wirusa w zarodkach kurzych. Rozwijające się zarodki ptasie
zakażane są w różnych fazach rozwojowych. Dokonuje się zakażenia błony
kosmówkowo-omoczniowej, jamy owodni, omoczni lub woreczka żółtkowego. Po
określonym czasie inkubacji w odpowiednich warunkach z zakażonego jaja pobiera

się płyn lub tkankę i bada na obecność wirusów.

Metoda namnażania w hodowlach tkankowych, komórkowych- hodowle mogą
pochodzić z tkanek ludzkich lub zwierzęcych świeżo pobranych (hodowle pierwotne),
lub z tzw. heteroploidalnych, ustabilizowanych linii komórkowych- pasażowane in vitro

wielokrotnie. Komórki zmienione są nowotworowo i namnażają się nieograniczenie.
Półciągłe linie komórkowe, diploidalne- zawierają komórki wywodzące się z tkanki
płodowej ludzkiej lub zwierzęcej (fibroblasty), o ograniczonym czasie życia do ok. 30–

50 pasaży.

Komórka pozwalająca na namnożenie wirusa to komórka permisywna, zatem
hodowla komórkowa musi być permisywna dla danego wirusa.

background image

Choroby zakaźne

Wirusy

Metody wykrywania wirusów

Efekt cytopatyczny CPE – zmiany morfologiczne i degeneracyjne w komórkach, w
których zachodzi replikacja wirusa. Cykl ten jest skutkiem zahamowania replikacji

RNA i syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa.
Obserwowany może być jako: - zmiana kształtu, wielkości i typowego układu
komórek, zmiany wewnątrzkomórkowe (zmiany barwliwości i typowej morfologii
struktur komórkowych, wewnątrzjądrowe i wewnątrzplazmatyczne wtręty,

wakuolizacja jądra i cytoplazmy), powstanie zespólni komórkowych.

Metoda łysinkowa. Łysinka jest to obszar przejaśnienia w hodowli komórkowej
(eukariotycznej) lub bakteryjnej, powstający w wyniku lizy komórek jako skutek
działania pojedynczego, wyjściowego wirionu („negatywna kolonia wirusa”).

Policzenie łysinek umożliwia wyliczenie stężenia wirusów w roztworze (PFU – plaque
forming unit, jednostka tworząca łysinkę).

Hemaglutynacja wirusowa - zachodzi wskutek działania niektórych wirusów na
receptory powierzchni krwinki czerwonej. Enzymatyczna aktywność hemaglutyniny i

neuraminidazy wirusowej wywołuje zjawisko polegające na łączeniu się krwinek
czerwonych za pomocą mostków w większe skupienia. Jest to reakcja odwracalna.

background image

Choroby zakaźne

Wirusy

Hemadsorpcja- wykorzystuje zjawisko przylegania erytrocytów (różnych gatunków

zwierząt lub ludzkich) do powierzchni komórek zakażonych wirusem produkującym
hemaglutyninę. Efekt ten wyprzedza w hodowli komórkowej efekt cytopatyczny.
Podczas namnażania wirusa z osłonką i po wbudowaniu jego hemaglutynin w błonę
komórkową komórki gospodarza metoda hemadsorpcji pozwala na pośrednie

wykrycie wirusa. Po dodaniu do hodowli zawiesiny krwinek czerwonych nastąpi w
przypadku obecności wirusa hemaglutynującego adsorpcja erytrocytów do
powierzchni komórek widoczna w postaci „kiści winogron”. Swoiste przeciwciała

hamujące ten proces pozwalają na identyfikację gatunkową danego wirusa.

Hybrydyzacja in situ- metoda wykrywania wirusa w materiale biologicznym. Metoda
cytogenetyczna polegajaca na wykryciu w danym materiale specyficznej sekwencji
DNA za pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Odpowiednio

przygotowane komórki lub tkanki do badania umieszcza się szkiełku podstawowym.
Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całość poddawana jest
denaturacji (wysoka temperatura), a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Po

przepłukaniu preparatu w celu usunięcia niezhybrydyzowanych cząstek sondy
preparat wybarwia się i analizuje pod mikroskopem fluorescencyjnym.

background image

Choroby zakaźne

Wirusy

Izolacja i identyfikacja wirusa

Techniki i metody serologiczne

zahamowanie hemaglutynacji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi

przeciwciałami i z tą mieszaniną wykonuje odczyn hemaglutynacji wirusowej;

zahamowanie hemadsorpcji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi

przeciwciałami i tą mieszaniną zakaża się nową hodowlę. Brak zjawiska hemadsorpcji

takiej hodowli świadczy o neutralizacji przez dodane przeciwciała i pozwoli na identyfikację
wirusa.

neutralizacja- dodanie znanych przeciwciał do nieznanego wirusa. Taką mieszaniną

zakaża się nową linię komórkową, gdy nie wystąpią zmiany cytopatyczne świadczy to o

neutralizacji przeciwciałami nieznanego wirusa i umożliwia identyfikację.

zahamowanie interferencji wirusowej- dodanie przeciwciał do pożywki hodowli zawierającej

wirus interferujący i zakażenie taką mieszaniną nowej hodowli. Po 2 dniach do hodowli

dodany zostaje wirus cytopatyczny. Efekt cytopatyczny to wynik świadczący o związaniu

pierwszego wirusa przez dodane przeciwciała.

odczyn immunofluorescencji bezpośredniej - do rozmazu komórek z zakażonej hodowli

komórkowej dodaje się przeciwciała wzorcowe znakowane fluorochromem. Zakażenie

komórki wirusem stwierdza się na podstawie obserwacji fluorescencji komórek w

mikroskopie fluorescencyjnym.

background image

Choroby zakaźne

Wirusy

odczyn immnoenzymatyczny ELISA- (ang. Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay) jest testem immunologicznym; reakcją barwną enzymu sprzężonego z

przeciwciałami do jakościowego i ilościowego wykrycia przeciwciał, jak i
antygenów. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z
użyciem przeciwciał skoniugowanych z odpowiednim enzymem. Po utworzeniu
kompleksu immunologicznego-, czyli unieruchomieniu przeciwciała i dodaniu

substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem wytworzy się produkt, którego
obecność świadczy o obecności określonego białka- np. wirusowego. Antygen
wirusowy nakłada się na podłoże, dodaje się badana surowicę i swoiste

przeciwciało- jeśli jest w niej obecne to wiąże się z antygenem, następnie dodaje
sie antyglobulinę znakowana enzymem wiążącym się ze związanym
przeciwciałem badanej surowicy. W ostatnim etapie dodaje się substrat enzymu i

mierzy kolorymetrycznie zmianę barwy.

Wykorzystanie odwrotnej transkrypcji w metodzie PCR Enzym odwrotna

transkryptaza - występuje u wirusów RNA np. retrowirusów. Umożliwia ona
przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, który następnie integruje do
genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA
(hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji. Metoda ta

umożliwia: utworzenie DNA na matrycy RNA, ampifikację DNA za pomocą metody
PCR.

background image

Choroby zakaźne

Grzyby

Pożywka Sabourauda – jest to
pożywka używana w mikrobiologii do

hodowli grzybów. Składnikiem jest
agar, woda destylowana, czynniki
potrzebne do wzrostu (glukoza,
pepton) oraz antybiotyki. Spośród

ostatnich najczęściej dodawana jest
penicylina, streptomycyna lub
chloramfenikol - służą one do

zahamowania wzrostu bakterii,
podobnie jak kwaśne pH]. Przed
posianiem drobnoustrojów podłoże

musi być wyjałowione w autoklawie.

Zazwyczaj ustala się dwie hodowle - w
temperaturze 25° i 37°, ponieważ
grzyby wzrastają w różnych zakresach

temperatur.

background image

Choroby zakaźne

Badanie krwi w kierunku Brucelozy

W Polsce obecnie program kontroli brucelozy bydła prowadzony jest zgodnie z

przepisami rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 17 grudnia 2004
r. w sprawie określenia jednostek chorobowych, sposobu prowadzenia kontroli oraz
zakresu badań kontrolnych zakażeń zwierząt (Dz. U. Nr 282, poz. 2813).

W celu kontroli występowania brucelozy bydła:

corocznie pobiera się próbki krwi od 1/3 stad bydła znajdującego się na obszarze
powiatu, tak aby w okresie 3 lat poddać badaniu wszystkie stada bydła

znajdujące się na obszarze powiatu,

badaniu, o którym mowa powyżej, poddaje się bydło płci żeńskiej oraz

przeznaczone do rozrodu buhaje powyżej 12. miesiąca życia,

opuszcza się badanie pulowanych prób mleka od krów pochodzących z jednego

gospodarstwa.

Badaniami objęte jest terytorium Rzeczypospolitej Polskiej. Badania są prowadzone

w celu kontroli występowania brucelozy i eliminacji, za odszkodowaniem sztuk
zakażonych.

background image

Choroby zakaźne

Badanie krwi w kierunku białaczki

W celu kontroli występowania enzootycznej białaczki bydła corocznie bada się 1/3

stad bydła w powiecie, na obszarze którego co najmniej w 99,8 % stad nie
stwierdzono przypadków enzootycznej białaczki bydła w okresie ostatnich 2 lat.

Badaniu, o którym mowa w ust. 1, poddaje się bydło powyżej drugiego roku życia.

W celu kontroli występowania enzootycznej białaczki bydła u krów mlecznych,
dopuszcza się badanie pulowanych prób mleka od krów pochodzących z jednego
gospodarstwa.

background image

Choroby zakaźne

Próby biologiczne

Próby na zwierzetach laboratoryjnych (świnki morskie, króliki, myszy, szczury), mają na celu

ułatwienie diagnozy chorób zakaźnych przez wywołanie objawów i zmian chorobowych. Do prób

biologicznych używane są zarodki kurze i hodowle tkankowe pochodzące od różnych gatunków

z różnych tkanek

Przykłady

Diagnostyka wścieklizny (myszy) - Myszy białe zakaża się domózgowo zawiesiną

badanego mózgowia, a następnie obserwuje przez 30 dni. Zwierzęta, u których wystąpiły

objawy choroby usypia się a ich mózgowia sprawdza w teście FAT na obecność antygenu

wirusowego.

Diagnostyka wąglika

Diagnostyka pałeczki jadu kiełbasianego (myszy, świnki morskie)

Diagnostyka gruźlicy (świnki morskie)

Diagnostyka niedokrwistości zakaźnej (źrebięta)

Wirusowa krwotoczna choroba królików (króliki)

Sposoby wykonania prób biologicznych, gatunek zwierzęcia na którym powinna być ona

wykonana, rodzaj materiału określają przepisy dotyczące rozpoznawania i zwalczania chorób

zakaźnych. Materiał badany wciera się w skaryfikowaną skórę, wkrapla do worka

spojówkowego, podaje w iniekcjach domózgowych, domięśniowych, podskórnych, doustnie lub

do jamy otrzewnej.


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:

więcej podobnych podstron