Choroby zakaźne

Antybiogram

Oznaczanie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną Kirby – Bauera



Metoda krążkowo-dyfuzyjna Kirby-Bauera jest oparta na dyfuzji antybiotyku

zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście przez agar,
tworząc gradient stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach
krążka i spada wraz z odległością od krążka. Wielkość strefy zahamowania wzrostu
bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na antybiotyk - im

większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa.



W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe, średnio wrażliwe
lub oporne. Metoda krążkowo-dyfuzyjna jest najczęściej używaną metodą testowania
lekooporności. Jest ona dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania.

Posiada jednak ograniczenia. Nie jest wiarygodna w testowaniu wolno-rosnących
organizmów, bezwzględnych bakterii beztlenowych. Niektóre antybiotyki słabo
dyfundują w agarze, przez co różnica w strefach zahamowania dla bakterii

wrażliwych i opornych jest niewielka, co może prowadzić do nieprawidłowego
określenia lekooporności (antybiotyki glikopeptydowe, polimyksyna B).

Choroby zakaźne

Antybiogram

Materiały:



podłoże agar Mulera- Hinton (MHA2)



1 ml jałowej 0,85% soli fizjologiczna (NaCl)



krążki bibułowe z antybiotykiem – np. firma Oxoid



zawiesina bakteryjna – w skali 0,5 McFarlanda



wzorzec – 0,5 McFarlanda



jałowe wymazówki

Inoculum przygotować ze świeżej, osiemnastogodzinnej hodowli bakterii na podłożu MHA2. Kilka

kolonii bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze 0,85% NaCl, celem uzyskania

zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1 - 10

8

do

2 - 10

8

 c.f.u./ml. Gęstość zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru

Gotową zawiesinę w ciągu 15 minut rozprowadzić na powierzchni podłoża MHA2 przy użyciu

jałowej wymazówki. Po 15 minutach na posiane podłoże nakłożyc krążki z antybiotykami i

chemioterapeutykami. Tak przygotowane płytki w ciągu następnych 15 minut wstawić do
cieplarki i inkubowć w warunkach tlenowych 16-18 godzin, w temperaturze 37ºC

.

Choroby zakaźne

Antybiogram

Choroby zakaźne

Wirusy

Metody izolacji i namnażania wirusów.



Wirusy nie replikują poza komórką żywą, zatem hodowla wirusów odbywa się in vivo
w komórkach organizmów żywych lub in vitro poprzez namnażanie cząstek wirusa w

hodowlach komórkowych albo tkankowych.



Metoda namnażania wirusa w zarodkach kurzych. Rozwijające się zarodki ptasie
zakażane są w różnych fazach rozwojowych. Dokonuje się zakażenia błony
kosmówkowo-omoczniowej, jamy owodni, omoczni lub woreczka żółtkowego. Po
określonym czasie inkubacji w odpowiednich warunkach z zakażonego jaja pobiera

się płyn lub tkankę i bada na obecność wirusów.



Metoda namnażania w hodowlach tkankowych, komórkowych- hodowle mogą
pochodzić z tkanek ludzkich lub zwierzęcych świeżo pobranych (hodowle pierwotne),
lub z tzw. heteroploidalnych, ustabilizowanych linii komórkowych- pasażowane in vitro

wielokrotnie. Komórki zmienione są nowotworowo i namnażają się nieograniczenie.
Półciągłe linie komórkowe, diploidalne- zawierają komórki wywodzące się z tkanki
płodowej ludzkiej lub zwierzęcej (fibroblasty), o ograniczonym czasie życia do ok. 30–

50 pasaży.



Komórka pozwalająca na namnożenie wirusa to komórka permisywna, zatem
hodowla komórkowa musi być permisywna dla danego wirusa.

Choroby zakaźne

Wirusy

Metody wykrywania wirusów



Efekt cytopatyczny CPE – zmiany morfologiczne i degeneracyjne w komórkach, w
których zachodzi replikacja wirusa. Cykl ten jest skutkiem zahamowania replikacji

RNA i syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa.
Obserwowany może być jako: - zmiana kształtu, wielkości i typowego układu
komórek, zmiany wewnątrzkomórkowe (zmiany barwliwości i typowej morfologii
struktur komórkowych, wewnątrzjądrowe i wewnątrzplazmatyczne wtręty,

wakuolizacja jądra i cytoplazmy), powstanie zespólni komórkowych.



Metoda łysinkowa. Łysinka jest to obszar przejaśnienia w hodowli komórkowej
(eukariotycznej) lub bakteryjnej, powstający w wyniku lizy komórek jako skutek
działania pojedynczego, wyjściowego wirionu („negatywna kolonia wirusa”).

Policzenie łysinek umożliwia wyliczenie stężenia wirusów w roztworze (PFU – plaque
forming unit, jednostka tworząca łysinkę).



Hemaglutynacja wirusowa - zachodzi wskutek działania niektórych wirusów na
receptory powierzchni krwinki czerwonej. Enzymatyczna aktywność hemaglutyniny i

neuraminidazy wirusowej wywołuje zjawisko polegające na łączeniu się krwinek
czerwonych za pomocą mostków w większe skupienia. Jest to reakcja odwracalna.

Choroby zakaźne

Wirusy



Hemadsorpcja- wykorzystuje zjawisko przylegania erytrocytów (różnych gatunków

zwierząt lub ludzkich) do powierzchni komórek zakażonych wirusem produkującym
hemaglutyninę. Efekt ten wyprzedza w hodowli komórkowej efekt cytopatyczny.
Podczas namnażania wirusa z osłonką i po wbudowaniu jego hemaglutynin w błonę
komórkową komórki gospodarza metoda hemadsorpcji pozwala na pośrednie

wykrycie wirusa. Po dodaniu do hodowli zawiesiny krwinek czerwonych nastąpi w
przypadku obecności wirusa hemaglutynującego adsorpcja erytrocytów do
powierzchni komórek widoczna w postaci „kiści winogron”. Swoiste przeciwciała

hamujące ten proces pozwalają na identyfikację gatunkową danego wirusa.



Hybrydyzacja in situ- metoda wykrywania wirusa w materiale biologicznym. Metoda
cytogenetyczna polegajaca na wykryciu w danym materiale specyficznej sekwencji
DNA za pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Odpowiednio

przygotowane komórki lub tkanki do badania umieszcza się szkiełku podstawowym.
Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całość poddawana jest
denaturacji (wysoka temperatura), a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Po

przepłukaniu preparatu w celu usunięcia niezhybrydyzowanych cząstek sondy
preparat wybarwia się i analizuje pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Choroby zakaźne

Wirusy

Izolacja i identyfikacja wirusa



Techniki i metody serologiczne

−

zahamowanie hemaglutynacji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi

przeciwciałami i z tą mieszaniną wykonuje odczyn hemaglutynacji wirusowej;

−

zahamowanie hemadsorpcji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi

przeciwciałami i tą mieszaniną zakaża się nową hodowlę. Brak zjawiska hemadsorpcji

takiej hodowli świadczy o neutralizacji przez dodane przeciwciała i pozwoli na identyfikację
wirusa.

−

neutralizacja- dodanie znanych przeciwciał do nieznanego wirusa. Taką mieszaniną

zakaża się nową linię komórkową, gdy nie wystąpią zmiany cytopatyczne świadczy to o

neutralizacji przeciwciałami nieznanego wirusa i umożliwia identyfikację.

−

zahamowanie interferencji wirusowej- dodanie przeciwciał do pożywki hodowli zawierającej

wirus interferujący i zakażenie taką mieszaniną nowej hodowli. Po 2 dniach do hodowli

dodany zostaje wirus cytopatyczny. Efekt cytopatyczny to wynik świadczący o związaniu

pierwszego wirusa przez dodane przeciwciała.

−

odczyn immunofluorescencji bezpośredniej - do rozmazu komórek z zakażonej hodowli

komórkowej dodaje się przeciwciała wzorcowe znakowane fluorochromem. Zakażenie

komórki wirusem stwierdza się na podstawie obserwacji fluorescencji komórek w

mikroskopie fluorescencyjnym.

Choroby zakaźne

Wirusy

−

odczyn immnoenzymatyczny ELISA- (ang. Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay) jest testem immunologicznym; reakcją barwną enzymu sprzężonego z

przeciwciałami do jakościowego i ilościowego wykrycia przeciwciał, jak i
antygenów. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z
użyciem przeciwciał skoniugowanych z odpowiednim enzymem. Po utworzeniu
kompleksu immunologicznego-, czyli unieruchomieniu przeciwciała i dodaniu

substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem wytworzy się produkt, którego
obecność świadczy o obecności określonego białka- np. wirusowego. Antygen
wirusowy nakłada się na podłoże, dodaje się badana surowicę i swoiste

przeciwciało- jeśli jest w niej obecne to wiąże się z antygenem, następnie dodaje
sie antyglobulinę znakowana enzymem wiążącym się ze związanym
przeciwciałem badanej surowicy. W ostatnim etapie dodaje się substrat enzymu i

mierzy kolorymetrycznie zmianę barwy.



Wykorzystanie odwrotnej transkrypcji w metodzie PCR Enzym odwrotna

transkryptaza - występuje u wirusów RNA np. retrowirusów. Umożliwia ona
przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, który następnie integruje do
genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA
(hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji. Metoda ta

umożliwia: utworzenie DNA na matrycy RNA, ampifikację DNA za pomocą metody
PCR.

Choroby zakaźne

Grzyby



Pożywka Sabourauda – jest to
pożywka używana w mikrobiologii do

hodowli grzybów. Składnikiem jest
agar, woda destylowana, czynniki
potrzebne do wzrostu (glukoza,
pepton) oraz antybiotyki. Spośród

ostatnich najczęściej dodawana jest
penicylina, streptomycyna lub
chloramfenikol - służą one do

zahamowania wzrostu bakterii,
podobnie jak kwaśne pH]. Przed
posianiem drobnoustrojów podłoże

musi być wyjałowione w autoklawie.



Zazwyczaj ustala się dwie hodowle - w
temperaturze 25° i 37°, ponieważ
grzyby wzrastają w różnych zakresach

temperatur.

Choroby zakaźne

Badanie krwi w kierunku Brucelozy



W Polsce obecnie program kontroli brucelozy bydła prowadzony jest zgodnie z

przepisami rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 17 grudnia 2004
r. w sprawie określenia jednostek chorobowych, sposobu prowadzenia kontroli oraz
zakresu badań kontrolnych zakażeń zwierząt (Dz. U. Nr 282, poz. 2813).



W celu kontroli występowania brucelozy bydła:

−

corocznie pobiera się próbki krwi od 1/3 stad bydła znajdującego się na obszarze
powiatu, tak aby w okresie 3 lat poddać badaniu wszystkie stada bydła

znajdujące się na obszarze powiatu,

−

badaniu, o którym mowa powyżej, poddaje się bydło płci żeńskiej oraz

przeznaczone do rozrodu buhaje powyżej 12. miesiąca życia,

−

opuszcza się badanie pulowanych prób mleka od krów pochodzących z jednego

gospodarstwa.



Badaniami objęte jest terytorium Rzeczypospolitej Polskiej. Badania są prowadzone

w celu kontroli występowania brucelozy i eliminacji, za odszkodowaniem sztuk
zakażonych.

Choroby zakaźne

Badanie krwi w kierunku białaczki



W celu kontroli występowania enzootycznej białaczki bydła corocznie bada się 1/3

stad bydła w powiecie, na obszarze którego co najmniej w 99,8 % stad nie
stwierdzono przypadków enzootycznej białaczki bydła w okresie ostatnich 2 lat.



Badaniu, o którym mowa w ust. 1, poddaje się bydło powyżej drugiego roku życia.



W celu kontroli występowania enzootycznej białaczki bydła u krów mlecznych,
dopuszcza się badanie pulowanych prób mleka od krów pochodzących z jednego
gospodarstwa.

Choroby zakaźne

Próby biologiczne



Próby na zwierzetach laboratoryjnych (świnki morskie, króliki, myszy, szczury), mają na celu

ułatwienie diagnozy chorób zakaźnych przez wywołanie objawów i zmian chorobowych. Do prób

biologicznych używane są zarodki kurze i hodowle tkankowe pochodzące od różnych gatunków

z różnych tkanek



Przykłady

−

Diagnostyka wścieklizny (myszy) - Myszy białe zakaża się domózgowo zawiesiną

badanego mózgowia, a następnie obserwuje przez 30 dni. Zwierzęta, u których wystąpiły

objawy choroby usypia się a ich mózgowia sprawdza w teście FAT na obecność antygenu

wirusowego.

−

Diagnostyka wąglika

−

Diagnostyka pałeczki jadu kiełbasianego (myszy, świnki morskie)

−

Diagnostyka gruźlicy (świnki morskie)

−

Diagnostyka niedokrwistości zakaźnej (źrebięta)

−

Wirusowa krwotoczna choroba królików (króliki)

•

Sposoby wykonania prób biologicznych, gatunek zwierzęcia na którym powinna być ona

wykonana, rodzaj materiału określają przepisy dotyczące rozpoznawania i zwalczania chorób

zakaźnych. Materiał badany wciera się w skaryfikowaną skórę, wkrapla do worka

spojówkowego, podaje w iniekcjach domózgowych, domięśniowych, podskórnych, doustnie lub

do jamy otrzewnej.