Diagnostyka chorób genetycznych

Wykorzystanie:

1. wykrywanie chorób przed objawami
2. możliwość wykrywania nosicielstwa
3. diagnostyka prenatalna
4. rozróżnianie chorób objawiających się kliniczne tak samo

Pozyskiwanie materiału do badań (ilość zależy od techniki)z :
krew obwodowa (limfocyty), fibroblasty skóry, płyn owodniowy, komórki kosmówki, mocz, kał, nasienie, fragmenty włosów,
wycinki tkankowe, szpik kostny, materiały z biopsji

Izolacja DNA:

1.

Metoda fenolowa daje preparaty DNA o wysokiej wydajności oraz dużą czystość; można stosować z krwi zamrożonej i
długo przechowywanej. Potrzeba dużo (10ml) krwi, stosuje się toksyczne odczynniki.

Przebieg izolacji:

a) Wstępna obróbka – izolacja z np. limfocytów, rozwarstwianie w fenolu oraz wirowanie z dodatkiem

substancji powodujących lizę erytrocytów

b) Liza erytrocytów
c) Trawienie białek (proteinaza K) (24-48h) w temp 37*C
d) Oczyszczanie preparatu (fenol + chloroform) – denaturacja białek i lipidów
e) Wytrącanie (precipitacja DNA)
f)

Zawieszenie DNA w odpowiednim buforze – zabezpieczenie przed działaniem odpowiednich
endonukleaz

2.

Metoda wysalania białek trwa 2dni, brak tox odczynników, ilość krwi – 5ml

a) Jw. pkt a i b
b) Trawienie białek przez 12-24h w temp 50*C
c) Oczyszczanie roztworem NaCl powodującym odsolenie białek
d) Reszta jw.

3.

Metoda Grindberga ilość krwi 1ml, czas 6h, max przechowywanie krwi 1miesiąc.

Po przeprowadzeniu w/w procesów należy sprawdzić czystość i ilość DNA w preparacie przy pomocy badania
spektrofotometrycznego dla długości fali 260,260 i 280nm.
Ilość wyraża się w

µ

g/ml i oblicza z wzoru

R

A

Z

×

×

=

50

260

gdzie: 50 – stały współczynnik R- rozcieńczenie
Czystość jest podawania w % i jest wyliczana ze stosunku wartości absorbancji dla wartości dla 260/280nm (1,8 dla 100% czystości
DNA) – wartości 1,8-1,6 uznaje się za poprawne.
Przy A

260

/A

230

< 2 w roztworze mukopolisacharydy; A

260

/ A

280

> 2 białko.

1

Metoda PCR

Polega na powielaniu (amplifikacji) in vitro fragmentu genomowego DNA o wielkości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy

par zasad.
Etapy PCR

1.

Denaturacja dwuniciowego DNA w temp 93-95*C

2. Przyłączenie starterów (primerów) – temperatura zależy od sekwencji (50-60*C)
3. Polimeryzacja DNA w temp 72*C

W/w etapy powtarza się ok. 20-30 razy. Dzięki temu zwiększamy ile chcemy ilość DNA potrzebnego do dalszych badań.
Skład mieszaniny DNA matrycowy, primery (startery), wolne nukleotydy (dNTP: dATP, dGTP, dTTP, dCTP), Mg

2+

, polimeraza

Taq

Startery – syntetycznie uzyskane zawierają 20PZ, przyłączają się do 3`. Ograniczają zasięg syntezy.
Polimeraza Taq- wyizolowana z Thermus aquatiqus jest aktywa w temp 95*C, w przeciwieństwie do polimerazy z E. Coli.
Reakcja PCR przebiega w bloku grzejnym pozwalającym na szybkie zmiany temperatury – termocykler

Reakcja PCR „multiplex” – w mieszaninie reakcyjnej znajduję się kilka par starterów dla różnych genów lub dla odmiennych
fragmentów tego samego genu.
Reakcja RT-PCR (technika izolacji RNA) proces PCR jest poprzedzony przepisaniem mRNA na komplementarne DNA (cDNA)
w reakcji odwrotnej transkrypcji w obecności startera, najczęściej uniwersalnego oligo dT lub oligonukleotydu swoistego dla
mRNA.
Stosuje się gdy nie wiadomo gdzie szukać.

Zastosowanie PCR:

•

Biologia molekularna

•

Medycyna (choroby genetyczne, zakaźne, diagnostyka prenatalna), medycyna sądowa (kryminalistyka, ustalanie ojcostwa)

•

Antropologia

ANALIZA PRODUKTÓW PCR

Enzymy restrykcyjne
Są izolowane z bakterii (np. Eco I – E. Coli restryktaza I), mają zdolność rozpoznania specyficznych miejsc w DNA- dając
fragmenty o określonych końcach.
Enzymy restrykcyjne :

•

Miejsca rozpoznania i nacięcia są oddalone do 1000 par zasad

•

Nacięcie występuje w miejscu rozpoznania

•

Nacięcie oddalone od miejsca rozpoznania o 25 – 100 par zasad

Rodzaje generowanych końców:

•

Nacięcie o 1 osi symetrii daje tępe końce

•

Przecięcie wzdłuż różnych osi symetrii co daje tzw lepkie końce

Hybrydyzacja z sondą molekularną:

2