1
Badanie składników kwasów nukleinowych
Cel ćwiczenia
Ćwiczenie ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla
kwasów nukleinowych. Nukleotydy budujące kwasy nukleinowe zbudowane są z: pentozy –
deoksyrybozy lub rybozy, zasady azotowej purynowej: guaniny i cytozyny lub
pirymidynowej: adeniny, tyminy i uracylu. Trzecim elementem wchodzącym w skład
nukleotydu jest reszta kwasu ortofosforanowego. Na ćwiczeniu zostaną wykonane reakcje
pozwalające na wykrycie: rybozy (reakcja Biala), deoksyrybozy (reakcja Dischego), tyminy i
reszty kwasu ortofosforowego.
Wprowadzenie
Kwasy nukleinowe są obok białek podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych,
roślinnych i drobnoustrojów. Występują one w jądrze komórkowym, chloroplastach,
mitochondriach, jak i w cytoplazmie. Wśród związków tych wyróżnia się: kwas
deoksyrybonukleinowy (DNA), który stanowi informację genetyczną we wszystkich
organizmach żywych (wyjątek wirusy RNA) oraz kwasy rybonukleinowe (RNA), które
realizują informację genetyczną, uczestniczą między innymi w biosyntezie białka.
Kwasy nukleinowe są biopolimerami składającymi się z monomerów, zwanych
nukleotydami. Nukleotyd, składa się z: cząsteczki cukru – pentozy, zasady azotowej, oraz
reszty kwasu fosforowego.
Cukier wchodzący w skład nukleotydu to: rybozy (β-D-ryboza), charakterystyczna dla
nukleotydów budujących kwasy rybonukleotydowe (RNA) lub deoksyryboza (2-deoksy-D-
ryboza) występująca w cząsteczkach DNA. Obie cząsteczki cukru występują w formie
hemiacetalowego pierścienia. Deoksyryboza różni się od rybozy tylko brakiem grupy
hydroksylowej przy drugim atomie węgla w pierścieniu (rys 1).
ryboza
2-deoksy-ryboza
Rys 1. Wzory cukrów występujących w kwasach nukleinowych.
Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych są związkami organicznymi,
heterocyklicznymi o charakterze aromatycznym. Zasady te to pochodne purynowe: adenina i
guanina lub pirymidynowe: cytozyna, tymina i uracyl. Zarówno w DNA, jak i RNA
występują zasady purynowe – adenina (6-aminopuryna) i guanina (2-amino-6-
hydroksypuryna) oraz pochodna pirymidynowa – cytozyna (2-hydroksy-4-aminopirymidyna).
Poza tym w RNA występuje pochodna pirymidynowa – uracyl (2,4-dihydroksypirymidyna),
a w DNA pochodna pirymidynowa – tymina (2,4-dihydroksy-5-metylopirymidyna). Wzory
tych zasad są podane na rysunku 2. Zasada azotowa połączona z pentozą wiązaniem N-
glikozydowym tworzy nukleozyd. Wyróżniamy następujące nukleozydy: adenozyna,
guanozyna, cytydyna, tymidyna i urydyna.
2
Rys 2. Wzory zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych.
Nukleotydy należą do grupy estrów fosforanowych. Są to estry nukleozydów i kwasu
ortofosforowego. Typowym miejscem estryfikacji jest grupa hydroksylowa przy atomie
węgla C-5 pentozy. Ze względu na rodzaj pentozy wyróżniamy dwa typy nukleotydów:
rybonukleotydy zawierają rybozę, a deoksyrybonukleotydy - deoksyrybozę. Natomiast w
zależności od rodzaju zasady azotowej istnieje 5 typów nukleotydów: adenozyno-5'-
monofosforan,
guanozyno-5'-monofosforan,
cytydyno-5'-monofosforan,
tymidyno-5'-
monofosforan, urydyno-5'monofosforan. Na rysunku 3 pokazano przykładowe nukleotydy.
Rys 3. Wzory nukleotydów występujących w kwasach nukleinowych.
Sąsiednie nukleotydy w łańcuchach kwasów nukleinowych połączone są ze sobą
wiązaniem 3’5’fosfodiestrowym. Jest to kowalencyjne wiązanie reszt fosforanowych między
grupą 5’-hydroksylową jednej rybozy i 3’ hydroksylową następnej. W wiązaniu tym reszta
fosforanowa występuje w formie diestru.
Wyróżnia się dwa sposoby badania składników kwasów nukleinowych. Pierwszy z
nich wymaga uprzedniej hydrolizy tych związków do składników podstawowych, tj. do
kwasu fosforowego, pentozy oraz zasady azotowej. Hydrolizę przeprowadza się chemicznie
lub enzymatycznie. Degradacja chemiczna zachodzi pod wpływem kwasów i zasad. DNA i
oligodeoksyrybonukleotydy ulegają degradacji tylko w środowisku kwaśnym, RNA i
oligorybonukleotydy ulegają degradacji zarówno w środowisku kwaśnym i zasadowym. W
przypadku środowiska alkalicznego, hydrolizie ulega jedynie wiązanie 3’,5’-fosfodiestrowe
między fosforanem a pozycją 5’ cukru. Ponieważ hydroliza ta wymaga wytworzenia wiązania
estrowego między fosforanem a grupą OH w pozycji 2’ cukru, ulega jej tylko RNA i
oligorybonukleotydy. Chemicznie najczęściej wykonuje się hydrolizę traktując kwasy
nukleinowe mocnymi kwasami mineralnymi np. 12 molowym kwasem nadchlorowym w
temp. 100°C przez 1 godzinę.
Całkowitą hydrolizę można też przeprowadzić stosując specyficzne enzymy. Nukleazy
hydrolizują wiązanie 3’5’-fosfodiestrowe uwalniając pojedyncze nukleotydy, natomiast
glikozydazy hydrolizują wiązania N-glikozydowe, prowadząc do odłączenia zasad azotowych
3
od szkieletu cukrowo-fosforanowego. Fosforan może być uwolniony od reszty cukru przez
fosfatazy, które hydrolizują wiązania estrowe.
Reakcje barwne, charakterystycznych dla hydrolizowanych preparatów kwasów
nukleinowych to reakcja na obecność: fosforanów oraz tyminy.
Drugi sposób badania składników kwasów nukleinowych związany jest z
wywoływaniem reakcji barwnych w preparatach niehydrolizowanych. Niehydrolizowany
preparat kwasów nukleinowych wykazuje reakcję na obecność pentozy, tzw. reakcję Biala
oraz reakcję na obecność deoksyrybozy tzw. reakcja Dischego.
Odczynniki
Preparat kwasów nukleinowych wykorzystany w tym ćwiczeniu został wyizolowany z grasicy cielęcej metodą
Marmura
Do wykonania reakcji charakterystycznych niezbędne są następujące odczynniki:
1. Roztwór kwasów nukleinowych
2. 0,1-molowy wodorotlenek sodowy.
3. 60% kwas nadchlorowy.
4. Odczynnik Biala
5. 1% roztwór difenyloaminy: 1 g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml kwasu octowego lodowatego i dodać 2,75
ml stężonego kwasu siarkowego.
6. Roztwór molibdenianu amonowego: 10 g molibdenianu sodowego rozpuścić w mieszaninie: 14,4 ml 25%
roztworu amoniaku i 27,1 ml wody; otrzymany roztwór wlać powoli (mieszając) do mieszaniny: 48,9 ml
stężonego kwasu azotowego i 114,8 ml wody.
7. 5-molowy wodorotlenek sodowy.
8. 1,1% roztwór węglanu sodowego.
9. Odczynnik diazowy: roztwór a – 4,5 g kwasu sulfanilowego rozpuścić w 45 ml stężonego kwasu solnego i
rozcieńczyć do 500 ml wodą, roztwór b – 23 g azotynu sodowego rozpuścić w 500 ml wody; do 15 ml roztworu
a dodać 15 ml roztworu b, wlać do kolby miarowej na 500 ml i schłodzić w ciągu 5 minut w wodzie z lodem; po
tym czasie dodać 60 ml roztworu b i trzymać w łaźni z lodem przez 5 min, po czym uzupełnić do kreski wodą;
odczynnik nadaje się do użycia w ciągu 24 godz. od momentu przygotowania.
10. 3-molowy wodorotlenek sodowy.
11. 20%. roztwór hydroksyloaminy.
12. 96%. alkohol etylowy.
Wykonanie
Wszystkie barwne reakcje studenci wykonują indywidualnie, natomiast wytrącanie
kwasów nukleinowych z roztworu wodnego oraz ich hydrolizę w grupach czteroosobowych.
1. Wytrącanie kwasów nukleinowych z roztworu wodnego.
Do cylindra o objętości 100 ml zawierającego 20 ml wodnego roztworu kwasów
nukleinowych (1) wlać po bagietce 40 ml alkoholu etylowego (12). Wytrącony w tych
warunkach osad kwasów nukleinowych nawinąć na bagietkę, nadmiar alkoholu usunąć,
przyciskając bagietkę z nawiniętą osadem do ścianki cylindra. Delikatnie obracając bagietkę
rozpuścić preparat kwasów nukleinowych w 3 ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego (2).
Tak otrzymany preparat kwasów nukleinowych podzielić na dwie części. Do szklanej
probówki odpipetować 2 ml w celu przeprowadzenia hydrolizy kwasów nukleinowych. Do
pozostałego w probówce 1 ml roztworu dodać 8 ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego
(2) w celu przygotowania roztworu do przeprowadzenia reakcji Biala na wykrywanie pentoz i
reakcji Dischego na obecność deoksyrybozy.
2. Hydroliza kwasów nukleinowych.
Hydroliza kwasów nukleinowych zostanie przeprowadzona w środowisku kwaśnym. W
takich warunkach w pierwszej kolejności hydrolizie ulega wiązanie N-glikozydowe miedzy
puryną a pentozą. Uwalniane są wolne puryny i tzw. kwas apurynowy. Dalsza hydroliza
prowadzi do rozpadu wiązania estrowego między pentozą a resztą kwasu ortofosforowego w
efekcie, czego uwalniany jest cukier i fosforan. Następnie hydrolizie ulegają wiązania
4
fosfodiestrowe między nukleotydami zawierającymi zasady pirymidynowe. Pełna hydroliza
prowadzi do rozpadu wiązania N-glikozydowego miedzy zasadami pirymidynowymi a
pentozą i wiązania estrowego między tym cukrem a fosforanem.
Do probówki zawierającej 2 ml roztworu kwasu nukleinowego w 0,1-molowym
wodorotlenku sodowym dodać 2 ml kwasu nadchlorowego (3) (hydrolizat). Do drugiej,
równoległej probówki odpipetować 2 ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego (2) i 2 ml
kwasu nadchlorowego (3) (próba kontrolna). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać.
Następnie obie probówki inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę, do probówek
włożyć chłodniczki, która zapobiegają parowaniu zawartości probówek. Po zakończonej
hydrolizie do jednej probówki odpipetować 2 ml hydrolizatu, a do drugiej probówki 2 ml
roztworu próby kontrolnej, obie próby zobojętnić dodając 1,5 ml 5 molowego wodorotlenku
sodowego (7). Zobojętniony roztwór powinien wykazywać pH 7–8. Otrzymane zobojętnione
roztwory wykorzystać do wykonywania reakcji na obecność tyminy. Do pozostałych
niezobojętnionych 2 ml hydrolizatu i 2 ml próby kontrolnej dodać po 4 ml wody; otrzymane
zhydrolizowane, kwaśne roztwory wykorzystać do wykonania reakcji na obecność kwasu
ortofosforowego.
3. Reakcje wykonywane na preparacie DNA niehydrolizowanym.
3a. Reakcja na wykrywanie rybozy – reakcja Biala.
W reakcji Biala pentozy występujące w nukleotydach purynowych (lecz nie
pirymidynowych) podczas ogrzewania z odczynnikiem Biala przekształcają się w furfural.
Powstały furfural tworzy z orcyną w obecności jonów Fe
3+
kompleks o trwałej barwie
zielonej. W tych warunkach deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy.
Rys 4. Reakcja Biala
Do dwóch probówek odpipetować po 5 ml odczynnika Biala (4) i wstawić do wrzącej łaźni
wodnej na 5 min. Następnie do jednej probówki odpipetować 1 ml rozcieńczonego preparatu
kwasów nukleinowych (próba pełna), do drugiej probówki odpipetować 1 ml 0,1-molowego
wodorotlenku sodowego (2) (próba kontrolna). Zawartość obu probówek dokładnie
wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 minut.
3b. Reakcja na wykrywanie deoksyrybozy – reakcja Dischego.
Reakcja Dischego pozwala odróżnić dwa typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA). W
środowisku kwaśnym deoksyryboza (wolna lub w nukleotydach purynowych) tworzy z
difenyloaminą produkt kondensacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest
konsekwencją powstania aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem
działania kwasu siarkowego i octowego. Deoksyryboza związana z zasadami
pirymidynowymi i ryboza nie dają tego odczynu.
5
Rys 5. Reakcja Dischego.
Do jednej probówki odpipetować 1 ml rozcieńczonego preparatu kwasów nukleinowych
(próba pełna), do drugiej probówki 1 ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego (2) (próba
kontrolna). Następnie do obu probówek odpipetować po 2 ml roztworu difenyloaminy (5),
dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min.
4. Reakcje wykonywane na preparacie DNA hydrolizowanym.
4a. Reakcja na wykrywanie tyminy.
Reakcja na obecność tyminy, odróżniająca oba typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA),
polega na wytworzeniu przez tę zasadę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu
o barwie czerwonobrunatnej; a dodatek hydroksyloaminy, w środowisku zasadowym
wzmacnia barwę kompleksu.
Do dwóch probówek odpipetować po 2,5 ml roztworu węglanu sodowego (8) i po 1 ml
odczynnika diazowego (9), zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Następnie do
jednej z tych probówek dodać 0,5 ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych
(próba pełna), a do drugiej 0,5 ml zobojętnionego roztworu próby kontrolnej, zawartość obu
probówek dokładnie wymieszać. Po 5 minutach inkubacji temperaturze pokojowej do obu
probówek dodać po 1 ml 3-molowego wodorotlenku sodowego (10) i 2-3 krople
hydroksyloaminy (11), zawartość obu probówek dokładnie wymieszać i po 5 min
obserwować intensywność zabarwienia roztworu.
4b. Reakcja na wykrywanie kwasu fosforowego
Reakcja na obecność fosforanów polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem
fosforanowym, w wyniku, czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu, żółto
zabarwiony osad.
Do jednej probówki odmierzyć 1 ml kwaśnego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do
drugiej 1 ml kwaśnego roztworu próby kontrolnej. Następnie do obu probówek dodać po 2 ml
roztworu molidbenianu amonowego (6), zawartość obu probówek dokładnie wymieszać.
Opracowanie wyników
W sprawozdaniu należy podać otrzymane zabarwienie po przeprowadzeniu poszczególnych
reakcji. Opisać zasady metod wykorzystywanych w tych reakcjach. Wyjaśnić celowość
wykonywania prób kontrolnych.
Pytania
1.
Napisać i podać wzory zasad purynowych i pirymidynowych. Podać ich nazwy
systematyczne.
2.
Co to jest nukleozyd, a co nukleotyd? Jakie typy wiązań w nich występują? Nazwać i
przedstawić wzory nukleozydu i nukleotydu, zawierających odpowiednio β-D-rybozę
i 2-deoksy-D-rybozę.
6
3.
Z jakich jednostek strukturalnych zbudowany jest kwas deoksyrybonukleinowy, a z
jakich
kwas
rybonukleinowy?
Przedstawić
fragmenty
wzorów
struktury
pierwszorzędowej obu kwasów.
4.
Co to jest hydroliza kwasów nukleinowych i w jaki sposób była wykonana na
ćwiczeniach?
5.
Jakie składniki uwalniają się w wyniku całkowitej hydrolizy DNA i RNA?
6.
Jakie reakcje charakterystyczne są wspólne dla DNA i RNA, a jakie pozwalają
odróżnić te związki?