1
ZAKŁAD BIOCHEMII
ENZYMOLOGIA
Biochemia i Biotechnologia
UMCS
(KP/KR)
2012
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I
Ćwicz. 1-2
Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stworzone dzięki modelowi
kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leonor Michaelis i Maud Menten do ilościowego
opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzone przez nich badania aktywności
inwertazy.
Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało
dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo
niskimi kosztami odczynników.
Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest
-D-
fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie
-
glikozydowe (glikozydaz – 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu
polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt
-D-fruktofuranozydowych.
W przypadku sacharozy (
-D-glukopiranozylo-
-D-fruktofuranozy) produktem hydrolizy jest
D-glukoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze
względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcalności właściwej z [
]
D
= 66,6
o
na
[
]
D
=
20
o
.
Inwertaza jest enzymem rozpowszechnionym w roślinach, jednak najlepszym
źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje
ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego
ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i
oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez
kilka godzin w 0,1M NaHCO
3
, w temp. 40
o
C), rozbicie komórek za pomocą homogenizatora
ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek
wodą.
Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie
kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej
temperaturze (ochrona przed denaturacją).
Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia
cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania
enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas
hydrolizy monosacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź
dwuwartościową (mieszanina odczynników Somogyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający
w wyniku redukcji ceglasty osad Cu
2
O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona
(arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego
absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Natężenie barwy jest wprost
proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.
2
Otrzymywanie preparatu inwertazy (Ćwicz. 1A)
Do izolacji inwertazy zastosowano homogenizację drożdży ze względu na
wystarczająco wysoką do dalszych badań aktywność otrzymanego preparatu i krótki czas
trwania procedury.
Wykonanie:
10 g świeżych drożdży piekarskich zhomogenizować w 50 ml zimnej wody
destylowanej za pomocą homogenizatora ostrzowego (5 tys. obrotów/min.,
przez 2 min.). Podczas homogenizacji należy utrzymywać niską temperaturę
za pomocą mieszaniny wody z lodem. Homogenat odwirować (w wirówce
K
23 po wyważeniu gilz parami) przy 3 tys. obrotów/min., przez 15 min.
Uzyskany supernatant, zawierający surowy enzym, zlać do dwóch
podpisanych naczynek i jedno z nich przechowywać w lodówce (+4
C),
a drugie w temp.
20
C (po zamrożeniu). W razie potrzeby supernatant
należy przesączyć przez Miracloth.
Do dalszych badań będzie używany otrzymany preparat inwertazy, po odpowiednim
rozcieńczeniu - bezpośrednio przed oznaczeniami.
Wyznaczanie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (Ćwicz.2)
Przygotować dwa różne rozcieńczenia (w zimnej H
2
O dest.) preparatu inwertazy
otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach (ćwicz. 1A) – np.50- i 100-krotne.
Do probówki zawierającej 3 ml roztworu enzymu o odpowiednim rozcieńczeniu
dodać 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7.
Natychmiast po wymieszaniu (próba odczynnikowa), a następnie dokładnie po 5, 10,
15, i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówek zawierających po 4 ml
buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej).
Po wymieszaniu, z każdej z tych probówek przenieść po 1 ml roztworu do
odpowiednio oznakowanych probówek (z korkiem) zawierających 1 ml świeżo
przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II. Probówki należy szczelnie zatkać
i ogrzewać przez 15 min. we wrzącej łaźni wodnej.
Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie
wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu
2
O rozpuści
się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H
2
O i wymieszać (przez odwracanie probówek
zatkanych korkami).
Po dokładnym wymieszaniu odczytać absorbancję dla poszczególnych wariantów
czasu (5, 10, 15, i 30 min.) przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej (t=0).
Z przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej (ćwicz. 1B) odczytać stężenie
(μg/ml) monosacharydów uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Przy
wyborze rozcieńczenia preparatu enzymatycznego do dalszych badań należy kierować się
tym, aby przewidywane wartości absorbancji mieściły się w wiarygodnym zakresie krzywej
kalibracyjnej.
3
Wyznaczanie krzywej kalibracyjnej
(Ćwicz. 1B)
1. Przygotować szereg probówek (z korkiem) zawierających po 1 ml odpowiednio
rozcieńczonego buforem glicynowym (pH 10) wzorcowego roztworu glukozy–fruktozy
(10 mg% ) według następującego schematu.
nr probówki
μl roztworu
wzorcowego
(10 mg%)
μl buforu
glicynowego
Końcowe
stężenie
(μg/ml)
1
(odczynnikowa)
0
1000
0
2
100
900
10
3
200
800
20
4
300
700
30
5
400
600
40
6
500
500
50
7
750
250
75
8
1000
0
100
Po dokładnym wymieszaniu zawartości probówek, do każdej z nich wlać po 1 ml
świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II (w stosunku 4:1).
Probówki (szczelnie zatkane korkami) ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez
15 min. Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie
wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu
2
O rozpuści
się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H
2
O i dokładnie wymieszać (przez odwracanie
probówek zatkanych korkami).
Odczytać wartości absorbancji dla poszczególnych stężeń wobec próby
odczynnikowej (nr 1) przy długości fali 520 nm. Wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć
na jej podstawie współczynnik kalibracji f.
Współczynnik kalibracji f (μg/ml ) = c wzorca (μg/ml )/ A
520
wzorca
2. Wyznaczyć krzywą kalibracyjną dla mniejszych stężeń glukozy–fruktozy (dla zakresu
stężeń 0-10 μg/ml), stosując jako wyjściowy do rozcieńczania (analogicznie jak w tabeli
powyżej) roztwór o stężeniu 1 mg% (przygotowany z r-ru o stęż. 10 mg%).
Wszystkie pozostałe czynności wykonać zgodnie z procedurą podaną powyżej (w punkcie 1.)
4
Odczynniki
1. Świeże drożdże piekarskie
2. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu – kwas octowy) o pH 4,7
3. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
4. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna – NaOH) o pH 10
5. 10 mg% roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy w buforze glicynowym o pH 10
6. Odczynnik Somogyi I
288 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 1 l H
2
O dest. Dodać 24 g soli Rochelle’a
(winian sodowo potasowy), 48 g Na
2
CO
3
, 32 g NaHCO
3
. Roztwór rozcieńczyć
do 1600 ml gotowaną H
2
O dest. i przechowywać w temp. 27
O
C.
7. Odczynnik Somogyi II
72 g Na
2
SO
4
(bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H
2
O dest. Dodać 8 g CuSO
4
x
H
2
O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H
2
O dest. i przechowywać
w temp. 27
O
C.
8. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują
studenci bezpośrednio przed użyciem.
9. Odczynnik Nelsona
100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H
2
O dest. Dodać 84 ml stęż.
H
2
SO
4
i roztwór arsenianu sodu ( 12 g Na
2
H-arsenian w 100 ml H
2
O).
Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz.
w temp. 37
O
C, potem w pokojowej.
10. Zimna woda destylowana
11. Lód
Sprzęt
1. waga techniczna
2. homogenizator ostrzowy
3. wirówka K-23
4. łaźnia wodna (100
o
C)
5. micro-shaker (wytrząsarka)
6. spektrofotometr
7. stoper
8. probówki ze szczelnymi korkami
9. probówki krótkie
10. pipety automatyczne
11. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50, 100, 250 ml)