1

ZAKŁAD BIOCHEMII

ENZYMOLOGIA

Biochemia i Biotechnologia

UMCS

(KP/KR)

2012

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH - I

Ćwicz. 1-2

Podstawy kinetyki reakcji enzymatycznych zostały stworzone dzięki modelowi

kinetycznemu, jaki w 1913 r. zaproponował Leonor Michaelis i Maud Menten do ilościowego
opisu reakcji enzymatycznej w oparciu o prowadzone przez nich badania aktywności
inwertazy.

Zastosowanie tego właśnie enzymu do badań praktycznych na ćwiczeniach zostało

dodatkowo podyktowane zarówno dostępnością enzymu i substratu, jak też stosunkowo
niskimi kosztami odczynników.

Inwertaza (sacharaza) według obowiązującej nomenklatury enzymów jest



-D-

fruktozydazą (EC 3.2.1.26), należy do klasy hydrolaz rozszczepiających wiązanie



-

glikozydowe (glikozydaz – 3.2) w związkach O-glikozylowych (3.2.1). Działanie enzymu
polega na hydrolizie końcowych nieredukujących reszt



-D-fruktofuranozydowych.

W przypadku sacharozy (



-D-glukopiranozylo-



-D-fruktofuranozy) produktem hydrolizy jest

D-glukoza i D-fruktoza (cukier inwertowany). Hydrolizę sacharozy nazywa się inwersją ze
względu na towarzyszącą temu zjawisku zmianę skręcalności właściwej z [



]

D

= 66,6

o

na

[



]

D

=



20

o

.

Inwertaza jest enzymem rozpowszechnionym w roślinach, jednak najlepszym

źródłem otrzymywania jej preparatów są drożdże piwne lub piekarskie, w których występuje
ona w najwyższym stężeniu. Inwertaza jest enzymem wewnątrzkomórkowym i do jego
ekstrakcji konieczne jest rozbicie błon komórkowych. Istnieje szereg metod otrzymywania i
oczyszczania preparatów inwertazy. Do izolacji enzymu można stosować np. autolizę (przez
kilka godzin w 0,1M NaHCO

3

, w temp. 40

o

C), rozbicie komórek za pomocą homogenizatora

ostrzowego lub przez ucieranie drożdży z piaskiem w obecności eteru i ekstrakcję białek
wodą.

Do oczyszczania inwertazy można wykorzystywać jej małą podatność na strącanie

kwasem pikrynowym. Wytrącanie enzymu przeprowadza się też acetonem w niskiej
temperaturze (ochrona przed denaturacją).

Zasada oznaczania aktywności inwertazy opiera się na pomiarze stężenia

cukrów redukujących (glukozy i fruktozy) pojawiających się w miarę postępowania
enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Roztwór, w którym znajdują się uwolnione podczas
hydrolizy monosacharydy gotuje się z odczynnikiem zawierającym miedź
dwuwartościową (mieszanina odczynników Somogyi I i II, w stosunku 4:1). Powstający
w wyniku redukcji ceglasty osad Cu

2

O rozpuszcza się następnie w odczynniku Nelsona

(arsenomolibdenowym) i uzyskuje roztwór o niebiesko-zielonym zabarwieniu, którego
absorbancję odczytuje się przy długości fali 520 nm. Natężenie barwy jest wprost
proporcjonalne do stężenia powstałego produktu.

2

Otrzymywanie preparatu inwertazy (Ćwicz. 1A)

Do izolacji inwertazy zastosowano homogenizację drożdży ze względu na

wystarczająco wysoką do dalszych badań aktywność otrzymanego preparatu i krótki czas
trwania procedury.

Wykonanie:

10 g świeżych drożdży piekarskich zhomogenizować w 50 ml zimnej wody
destylowanej za pomocą homogenizatora ostrzowego (5 tys. obrotów/min.,
przez 2 min.). Podczas homogenizacji należy utrzymywać niską temperaturę
za pomocą mieszaniny wody z lodem. Homogenat odwirować (w wirówce
K



23 po wyważeniu gilz parami) przy 3 tys. obrotów/min., przez 15 min.

Uzyskany supernatant, zawierający surowy enzym, zlać do dwóch
podpisanych naczynek i jedno z nich przechowywać w lodówce (+4



C),

a drugie w temp.



20



C (po zamrożeniu). W razie potrzeby supernatant

należy przesączyć przez Miracloth.

Do dalszych badań będzie używany otrzymany preparat inwertazy, po odpowiednim

rozcieńczeniu - bezpośrednio przed oznaczeniami.

Wyznaczanie optymalnego stężenia preparatu enzymatycznego (Ćwicz.2)

Przygotować dwa różne rozcieńczenia (w zimnej H

2

O dest.) preparatu inwertazy

otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach (ćwicz. 1A) – np.50- i 100-krotne.

Do probówki zawierającej 3 ml roztworu enzymu o odpowiednim rozcieńczeniu

dodać 3 ml 0,2 M roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7.

Natychmiast po wymieszaniu (próba odczynnikowa), a następnie dokładnie po 5, 10,

15, i 30 min. pobierać po 1 ml mieszaniny inkubacyjnej do probówek zawierających po 4 ml
buforu glicynowego o pH 10 (w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej).

Po wymieszaniu, z każdej z tych probówek przenieść po 1 ml roztworu do

odpowiednio oznakowanych probówek (z korkiem) zawierających 1 ml świeżo
przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II. Probówki należy szczelnie zatkać
i ogrzewać przez 15 min. we wrzącej łaźni wodnej.

Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie

wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu

2

O rozpuści

się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H

2

O i wymieszać (przez odwracanie probówek

zatkanych korkami).

Po dokładnym wymieszaniu odczytać absorbancję dla poszczególnych wariantów

czasu (5, 10, 15, i 30 min.) przy długości fali 520 nm wobec próby odczynnikowej (t=0).

Z przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej (ćwicz. 1B) odczytać stężenie

(μg/ml) monosacharydów uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy. Przy
wyborze rozcieńczenia preparatu enzymatycznego do dalszych badań należy kierować się
tym, aby przewidywane wartości absorbancji mieściły się w wiarygodnym zakresie krzywej
kalibracyjnej.

3

Wyznaczanie krzywej kalibracyjnej

(Ćwicz. 1B)

1. Przygotować szereg probówek (z korkiem) zawierających po 1 ml odpowiednio
rozcieńczonego buforem glicynowym (pH 10) wzorcowego roztworu glukozy–fruktozy
(10 mg% ) według następującego schematu.

nr probówki

μl roztworu

wzorcowego

(10 mg%)

μl buforu

glicynowego

Końcowe

stężenie

(μg/ml)

1
(odczynnikowa)

0

1000

0

2

100

900

10

3

200

800

20

4

300

700

30

5

400

600

40

6

500

500

50

7

750

250

75

8

1000

0

100

Po dokładnym wymieszaniu zawartości probówek, do każdej z nich wlać po 1 ml

świeżo przygotowanej mieszaniny odczynników Somogyi I i II (w stosunku 4:1).

Probówki (szczelnie zatkane korkami) ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez

15 min. Po ostudzeniu pod bieżącą wodą dodać po 1 ml odczynnika Nelsona, intensywnie
wymieszać (micro-shaker) aż ustanie wydzielanie pęcherzyków gazu i cały Cu

2

O rozpuści

się, a następnie (po około 5 min.) dodać 2 ml H

2

O i dokładnie wymieszać (przez odwracanie

probówek zatkanych korkami).

Odczytać wartości absorbancji dla poszczególnych stężeń wobec próby

odczynnikowej (nr 1) przy długości fali 520 nm. Wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć
na jej podstawie współczynnik kalibracji f.

Współczynnik kalibracji f (μg/ml ) = c wzorca (μg/ml )/ A

520

wzorca

2. Wyznaczyć krzywą kalibracyjną dla mniejszych stężeń glukozy–fruktozy (dla zakresu
stężeń 0-10 μg/ml), stosując jako wyjściowy do rozcieńczania (analogicznie jak w tabeli
powyżej) roztwór o stężeniu 1 mg% (przygotowany z r-ru o stęż. 10 mg%).
Wszystkie pozostałe czynności wykonać zgodnie z procedurą podaną powyżej (w punkcie 1.)

4

Odczynniki

1. Świeże drożdże piekarskie
2. 0,1 M bufor octanowy (octan sodu – kwas octowy) o pH 4,7
3. 0,2 M roztwór sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7
4. 0,1 M bufor glicynowy (glicyna – NaOH) o pH 10
5. 10 mg% roztwór wzorcowy glukozy-fruktozy w buforze glicynowym o pH 10
6. Odczynnik Somogyi I

288 g Na

2

SO

4

(bezw.) rozpuścić w 1 l H

2

O dest. Dodać 24 g soli Rochelle’a

(winian sodowo potasowy), 48 g Na

2

CO

3

, 32 g NaHCO

3

. Roztwór rozcieńczyć

do 1600 ml gotowaną H

2

O dest. i przechowywać w temp. 27

O

C.

7. Odczynnik Somogyi II

72 g Na

2

SO

4

(bezw.) rozpuścić w 300 ml wrzącej H

2

O dest. Dodać 8 g CuSO

4

x

H

2

O. Roztwór rozcieńczyć do 400 ml gotowaną H

2

O dest. i przechowywać

w temp. 27

O

C.

8. Mieszaninę odczynników Somogyi I i Somogyi II (stosunku 4:1) przygotowują

studenci bezpośrednio przed użyciem.

9. Odczynnik Nelsona

100 g molibdenianu amonu rozpuścić w 1,8 l H

2

O dest. Dodać 84 ml stęż.

H

2

SO

4

i roztwór arsenianu sodu ( 12 g Na

2

H-arsenian w 100 ml H

2

O).

Odczynnik przechowywać w ciemnej butelce szklanej przez 24-48 godz.
w temp. 37

O

C, potem w pokojowej.

10. Zimna woda destylowana
11. Lód

Sprzęt

1. waga techniczna
2. homogenizator ostrzowy
3. wirówka K-23
4. łaźnia wodna (100

o

C)

5. micro-shaker (wytrząsarka)
6. spektrofotometr
7. stoper
8. probówki ze szczelnymi korkami
9. probówki krótkie
10. pipety automatyczne
11. cylindry miarowe, zlewki, kolbki (poj. 50, 100, 250 ml)