Strategia diagnostyki cytogenetycznej – konspekt do

ćwiczeń

Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
dr Anna Skorczyk

Cytogenetyka – dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów

Cytogenetyka kliniczna - zajmuje się badaniem chromosomów w komórkach organizmu
ludzkiego, ich nieprawidłowości i związku z obrazem klinicznym

Cytogenetyka:

cytogenetyka klasyczna:

o

badanie kariotypu za pomocą technik prążkowania chromosomów

cytogenetyka molekularna:

o

technika FISH

o

inne techniki z wykorzystaniem sond molekularnych

Budowa morfologiczna chromosomu w stadium metafazy:


Typy chromosomów człowieka
(na podstawie położenia centromeru):

-

Metacentryczne

-

Submetacentryczne

-

Akrocentryczne

U człowieka nie występują chromosomy telocentryczne!


Grupy chromosomów - pary
A

1-3

duże chromosomy metacentryczne

B

4-5

duże chromosomy submetacentryczne

C

6-12 i X

średnie chromosomy submetacentryczne

D

13-15

duże chromosomy akrocentryczne

E

16-18

małe chromosomy submetacentryczne

F

19-20

małe chromosomy metacentryczne

G

21-22 i Y

małe chromosomy akrocentryczne

Aberracje chromosomów:

-

aberracje liczby chromosomów

-

aberracje struktury chromosomów

Aberracje mogą dotyczyć zarówno chromosomów płci, jak i autosomów

Aberracje liczby chromosomów
- ogólna liczba chromosomów jest różna od prawidłowej liczby 46 chromosomów.
- zmiany liczbowe mogą dotyczyć zarówno całego zestawu chromosomów (poliploidie),
jak i pojedynczego chromosomu (aneuploidie).

Poliploidia

- Triploidia (69,XXX,XXY lub XYY)

-3% wszystkich poczęć,
w większości przypadków poronienia samoistne

Aneuploidia (autosomy)

- Nullisomia (utrata pary chromosomów homologicznych)

- letalne przed implantacją

- Monosomia (utrata jednego chromosomu)

- letalne w stadium embrionalnym

- Trisomia (jeden chromosom dodatkowy)

- zwykle letalne, z wyjątkiem

trisomii chromosomów 13, 18, 21

Aneuploidia (chromosomy płci)

- Dodatkowy chromosom płci

- normalna długość życia

- Utrata chromosomu płci (45,X)

- 99% przypadków-poronienia

samoistne, normalna inteligencja,

bezpłodność

Poliploidie

Triploidia - obecność dodatkowego haploidalnego zestawu chromosomów w wyniku czego
w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 69 chromosomów.
Triploidia powstaje w wyniku:

-

Zapłodnienia komórki jajowej przez dwa plemniki, czyli tak zwanej dispermii.

-

Połączenia się nieprawidłowej diploidalnej gamety żeńskiej z prawidłowym plemnikiem,
czyli tak zwanej dygynii.

-

Połączenia się nieprawidłowego diploidalnego plemnika z prawidłową gametą żeńską,
czyli tzw. diandrii (najrzadsze).

Triploidia – obraz kliniczny

-

Jeśli dodatkowy zestaw chromosomów pochodzi od matki charakterystyczne cechy
fenotypowe płodu to: wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, bardzo małe łożysko
(niski poziom βhCG) i hipoplazja nadnerczy.

-

Jeśli dodatkowy zestaw chromosomów pochodzi od ojca mamy do czynienia z bardzo
dużym łożyskiem i zaśniadem groniastym, przy często normalnych rozmiarach płodu.

-

Cechy fenotypowe to także: syndaktylia 3. i 4. palca, wady układu płciowego
i moczowego, wady rozwojowe mózgu, wady serca.

-

Triploidia jest aberracj

ą letalną, czyli prowadzi do obumarcia płodu (najczęściej) lub

śmierci noworodka.

Tetraploidia - obecność dwóch dodatkowych haploidalnych zestawów chromosomów
w wyniku czego w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 92 chromosomów.
Tetraploidia powstaje w wyniku:

-

Nieprawidłowego pierwszego podziału zygoty.

-

Tetraploidia jest aberracja letalną, prowadzącą do obumarcia zarodka/płodu.

Aneuploidie

Trisomia - występowanie dodatkowego chromosomu homologicznego danej pary.

-

Trisomia jest wynikiem zjawiska nondysjunkcji, czyli nierozdzielenia się chromosomów
homologicznych lub chromatyd w trakcie podziału mejotycznego lub mitotycznego.

-

Wynikiem nondysjunkcji jest powstanie z jednej strony gamet disomicznych (z dwoma
chromosomami) lub z drugiej strony nullisomicznych (bez chromosomu).

-

Połączenie gamety disomicznej z prawidłową prowadzi do powstania trisomii określonej
pary chromosomów.

-

Połączenie gamety nullisomicznej z gametą prawidłową prowadzi do powstania
monosomii określonej pary chromosomów.

Monosomia - brak jednego chromosomu homologicznego w danej parze.

-

Monosomia powstaje w wyniku nondysjunkcji.

-

Efektem nondysjunkcji jest powstanie gamety nullisomicznej pozbawionej chromosomu
danej pary.

-

Po połączeniu nullisomicznej gamety z gametą prawidłową powstaje monosomia
okre

ślonej pary chromosomów.

-

W przypadku zespołu Turnera (45,X) monosomia może być wynikiem opóźnionego
ruchu chromosomu Y w stadium anafazy.

Aneuploidie – skutki:

-

Wi

ększość trisomii i monosomii jest letalna – prowadzi do obumarcia zarodka/płodu

we wczesnym okresie ciąży, najczęściej w pierwszym trymestrze ciąży.
Wyjątek stanowią trisomie chromosomów pary: 13, 18 i 21 oraz monosomia
chromosomu X, które spotyka się u żywo urodzonych noworodków.

-

Także aberracje liczbowe chromosomów płci, takie jak: 47,XXY; 47,XXX; 47,XYY
zwi

ązane są z łagodniejszymi skutkami klinicznymi.

-

Monosomie są letalne w bardzo wczesnym stadium rozwojowym (embrionu), prowadząc
do bardzo wczesnej utraty ciąży, która nie jest klinicznie rozpoznawalna w tym czasie
(najczęściej kobieta jeszcze nie wie, że jest w ciąży).

-

Do nondysjunkcji najczęściej dochodzi w gamecie matczynej, podczas oogenezy (90%
przypadków), rzadko nondysjunkcja występuje w trakcie spermatogenezy.

-

Zjawisko nondysjunkcji jest zwi

ązane z wiekiem matki (efekt wieku).

-

U kobiet między 20-29 rokiem

życia ryzyko jest stałe, natomiast po ukończeniu 30

roku

życia ryzyko nondysjunkcji sukcesywnie rośnie wraz z wiekiem matki.

-

Ryzyko związane z wiekiem jest takie same dla kobiet, które wcześniej urodziły dziecko,
jak i dla kobiet, dla których jest to pierwsza ciąża.

Aberracje liczbowe:

-

powstają najczęściej de novo, a nie w wyniku odziedziczenia od rodziców.

-

Aberracje liczbowe, poza kilkoma wyjątkami prowadzą do obumarcia zarodka/płodu,
martwego porodu lub zgonu okołoporodowego

-

Aberracje liczbowe chromosomów stanowią około 50% przyczyn poronie

ń

samoistnych w pierwszym trymestrze ci

ąży.

Mozaikowo

ść - występowanie w jednym organizmie dwóch lub więcej linii komórkowych

o różnym kariotypie, pochodzących z tej samej zygoty.
Pochodzenie mozaikowości:

-

Aberracja chromosomowa powstała po zapłodnieniu, podczas pierwszych podziałów
zygoty, w wyniku nieprawidłowego podziału mitotycznego.

-

Aberracja jest wynikiem ratowania embrionu z aberracją chromosomową, kiedy z tylko
z części komórek nadmierny materiał zostaje usunięty.

Aberracje struktury chromosomów
Zrównowa

żone

•Translokacje zrównoważone
•Inwersje

Niezrównowa

żone

•Duplikacje
•Delecje
•Chromosomy pierścieniowe
•Izochromosomy
•Fragmenty centryczne

Aberracje zrównowa

żone

Translokacje
Przemieszczenie się materiału genetycznego pomiędzy chromosomami

Typy translokacji:

-

Wzajemne

-

Robertsonowskie

-

Insercyjne

Translokacja wazjemna zrownowa

żona

-

Fragmenty chromosomów oderwały się i zamieniły się miejscami.

-

Nie doszło do utraty materiału genetycznego

Translokacja robertsonowska (fuzja centryczna)

-

Dotyczy chromosomów akrocentrycznych

-

Dwa chromosomy akrocentryczne tracą ramiona krótkie i łączą się ze sobą – powstaje
jeden chromosom dwuramienny

Translokacja robertsonowska jest translokacj

ą zrównoważoną, ponieważ utrata ramion

krótkich chromosomów akrocentrycznych nie powoduje utraty genów

Inwersja

-

Chromosom ulega złamaniu w 2 miejscach, a fragment pomiędzy złamaniami ulega
odwróceniu o 180 stopni

-

Inwersja jest aberracją zrównoważoną

Inwersja paracentryczna – oba złamania są w obrębie jednego ramienia i odwrócony
fragment nie zawiera centromeru
Inwersja pericentryczna – złamania nastąpiły w obydwu ramionach chromosomu
i odwrócony fragment zawiera centromer

Aberracje niezrównowa

żone:

Delecja - utrata części chromosomu

Duplikacja - podwojenie części chromosomu
Delecje i duplikacje są aberracjami niezrównowa

żonymi – łączą się z utratą lub nadmiarem

materiału genetycznego

Chromosom pier

ścieniowy

-

Chromosom pęka w obu ramionach, dystalne części chromosomów ulegają utracie,
a pozostała część chromosomu tworzy pierścień

-

Aberracja chromosomowa niezrównowa

żona

Izochromosom

-

Nieprawidłowy chromosom, który ma delecję jednego, a duplikację drugiego ramienia

-

Może powstać wskutek poprzecznego podziału centromeru

-

Aberracja niezrównowa

żona

Chromosomy markerowe

-

Małe dodatkowe chromosomy niejasnego pochodzenia, stwierdzane w 1/2500 ciąż

-

W 90% przypadków pochodzą z krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych
(około połowa pochodzi z chromosomu 15)

-

Chromosomy markerowe wymagają identyfikacji metodami cytogenetyki molekularnej
(FISH – malowanie chromosomów)

Kliniczne skutki aberracji chromosomowych:

Niezrównowa

żonych:

U zarodka - obumarcie
U dzieci żywo urodzonych:

- Zespoły wad wrodzonych z upośledzeniem umysłowym

- Upośledzenie umysłowe z cechami dysmorfii

- Zaburzenia cielesno-płciowe

Zrównowa

żonych

nosiciel aberracji jest zdrowy, ale mo

że mieć niepowodzenia rozrodu (brak ciąży,

poronienia samoistne, porody martwe, dzieci z zespołem wad i upośledzeniem
umysłowym)

Fenotyp osoby z niezrównowa

żoną aberracją chromosomową w zakresie autosomów

-

Często dystrofia wewnątrzmaciczna

-

Często nieprawidłowy przebieg ciąży (krwawienie z dróg rodnych, nieprawidłowa ilość
płynu owodniowego, wady płodu w badaniu USG)

-

Wady wrodzone, w tym wady narządów wewnętrznych, często wada serca

-

Dysmorfia twarzy, dysplastyczne małżowiny uszne

-

Upo

śledzenie umysłowe – zawsze, nawet przy słabo wyrażonych pozostałych w/w

objawach

Zespoły mikrodelecji

-

Delecje chromosomów są bardzo małe, na granicy rozdzielczości metod klasycznej
cytogenetyki, a nawet submikroskopowe

-

Diagnostyka: analiza chromosomów prometafazowych (HRBT) i FISH

-

Fenotyp: dysmorfia, wady rozwojowe i upośledzenie umysłowe

Przykłady zespołów mikrodelecji:

Z. Pradera-Williego 15q11-12
Z. Angelmana 15q11-12

Z. Wolf-Hirschhorna 4p16.3

Z. Miller-Dieker 17q13

Wskazania do okre

ślenia kariotypu:

-

Zespół wad wrodzonych współistniejący z opóźnieniem rozwoju/upośledzeniem
umysłowym

-

Upośledzenie umysłowe

-

Podejrzenie zespolu mikrodelecji

-

Zaburzenia różnicowania płci

-

Niepowodzenia rozrodu (brak ciąży, poronienia samoistne, obumarcie ciąży, zgon
dziecka w okresie perinatalnym)

Badanie kariotypu:
-

można użyć każdej rosnącej tkanki, najczęściej wykorzystuje się limfocyty krwi
obwodowej, czasem także na komórki szpiku kostnego lub fibroblasty skóry

-

w diagnostyce prenatalnej - komórki płynu owodniowego lub kosmówki

Badanie kariotypu z limfocytów krwi obwodowej:

-

pobrać jałowo do probówki z heparyną ok. 2-5 ml krwi

żylnej (od noworodka 1 ml)

i dostarczyć do laboratorium cytogenetycznego

-

jeśli transport krwi jest następnego dnia, probówkę z krwią przechowywać w lodówce
(+4ºC). Można też probówkę z krwią przesyłać szybką pocztą

-

nie wolno mrozić probówki z krwią przeznaczoną do badania kariotypu

Uwaga: u noworodka z wadami wrodzonymi, który zmarł zanim zdążono pobrać krew na
badanie kariotypu, można jeszcze jak najwcześniej (ew. nawet do 1 godz. po zgonie) pobrać
krew bezpośrednio z serca

Hodowla limfocytów krwi obwodowej
•przygotowanie pożywki do hodowli i dodanie do niej krwi
•hodowla w cieplarce przez 72 h
•zatrzymanie podziałów komórkowych – kolcemid
•rozproszenie chromosomów - roztwór hipotoniczny
•utrwalanie zawiesiny – metanol+kwas octowy
•nałożenie na szkiełka mikroskopowe

Podstawow

ą metodą badania cytogenetycznego jest standardowa ocena kariotypu

(najczęściej metoda prążkowa GTG).
Jednak w przypadku bardziej złożonych problemów diagnostycznych lub małych zmian
w obrębie struktury chromosomów niezbędna jest analiza z zastosowaniem innych technik np.
cytogenetyki molekularnej.

Techniki pr

ążkowe:

- prążki G (barwienie GTG)

- prążki Q (barwienie

OFQ)

- prążki C (barwienie

CTG)

- barwienie AgNOR (barwienie srebrowe)

- prążki R (barwienie

RBA) (prążkowania odwrotnego, ang. reverse)

Kiedy wykonuje się standardową analizę kariotypu?
•Aberracje liczby: poliploidie, aneuploidie (trisomia, monosomia)
•Aberracje

struktury:

delecje,

insercje,

translokacje,

chromosomy

pierścieniowe,

izochromosomy

Postępowanie w przypadku trudności w wykazaniu aberracji chromosomowej przy
zastosowaniu standardowego badania kariotypu
•Analiza

większej

liczby

płytek

metafazowych

(poszukiwanie

mozaikowości)

•Analiza chromosomów prometafazowych (HRBT – high resolution banding technique)
•Badanie kariotypu na podstawie fibroblastów skóry
•Metody cytogenetyki molekularnej (FISH)

Wskazania do badania kariotypu na podstawie fibroblastów skóry:
• Kariotyp mozaikowy w badaniu limfocytów
•Brak aberracji chromosomowej w badaniu standardowym (limfocyty) przy fenotypie
wskazującym na aberrację
• Fenotyp zespołu Pallister-Killian



Zasady zapisu kariotypu:
1) Liczba określająca całkowitą ilość chromosomów w komórce
2 )Po przecinku wymienione chromosomy płciowe
3) Po przecinku ewentualny opis aberracji

np. 46,XY

47,XX,+21

45,X

47,XXY

46,XX,t(2;6)(p12;q21)

FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Sondy stosowane w FISH:

malujące (wcp. – ang. whole chromosome paint)- pokrywające cały chromosom lub
poszczególne ramiona

alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe)

specyficzne (unikalne) dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus

Materiał do badania FISH:
•fibroblasty
•limfocyty
•komórki szpiku kostnego
•komórki płynu owodniowego
•komórki trofoblastu
•komórki nabłonka jamy ustnej
•skrawki parafinowe

mozaikowata tetrasomia 12p (dwie normalne 12tki plus izochromosom 12p)

których tkanek

Genetyka kliniczna FISH
•diagnostyka submikroskopowych aberracji chromosomowych
•identyfikacja złożonych aberracji struktury chromosomów
•identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego
•identyfikacja chromosomów markerowych
•szybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych

FISH w diagnostyce nowotworów
•detekcja amplifikacji genu
•badanie materiału genetycznego w jądrach interfazowych
•identyfikacja komórek szpiku kostnego dawcy po przeszczepie
•detekcja wczesnego nawrotu choroby
•monitorowanie efektu terapii





Cytogenetyka molekularna – inne techniki

•M-FISH (ang. multicolour FISH)
•SKY (SKY-FISH) (ang. spectral karyotyping)
•CGH (ang. comparative genomic hybridization) - porównawcza hybrydyzacja genomowa

CGH - Porównawcza hybrydyzacja genomowa – zasada metody

arrayCGH
Porównawcza hybrydyzacja ge

ArrayCGH
Porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy