plik

UNIWERSYTET ŚLĄSKI

WYDZIAŁ BIOLOGII I OCHRONY ŚRODOWISKA

KATEDRA ANATOMII I CYTOLOGII ROŚLIN

Agnieszka BRĄSZEWSKA-ZALEWSKA

Promotor:

Prof. dr hab. Jolanta Małuszyńska

Praca doktorska wykonana w ramach

grantu promotorskiego Nr. N302 002 32/0402

Katowice 2008

Składam serdeczne podziękowania

Pani Prof. dr hab. Jolancie Małuszyńskiej

Za przekazaną wiedzę, poświęcony czas, wszechstronną pomoc oraz cenne uwagi

w trakcie prowadzenia badań i pisania pracy.

Wszystkim Pracownikom Katedry Anatomii i Cytologii Roślin UŚ

Za okazaną pomoc, a w szczególności mgr Marcie Hosiawie - Barańskiej za

konsultacje oraz za to, że zawsze mogłam na nią liczyć.

Panu dr Tytusowi Bernasiowi

Za pomoc w analizie z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego i cytometru

obrazowego.

Mojej Rodzinie

Za wsparcie i cierpliwość, a szczególnie mojemu mężowi za nieocenioną pomoc

w redagowaniu pracy oraz zrozumienie i dużą dawkę optymizmu.

Spis treści

PIS

REŚCI

1. WSTĘP .......................................................................................................................... 3

1.1. C

HARAKTERYSTYKA GATUNKÓW

RASSICA

................................................................ 3

1.2. P

OCHODZENIE I EWOLUCJA GATUNKÓW

RASSICA

...................................................... 4

1.3. C

YTOGENETYCZNE BADANIA GENOMÓW

RASSICA

..................................................... 7

1.3.1. Lokalizacja sekwencji powtarzalnych z zastosowaniem metody FISH ................... 8

1.3.2. Lokalizacja genów rRNA ...................................................................................... 9

1.4. E

PIGENETYCZNE MODYFIKACJE CHROMATYNY

......................................................... 10

1.4.1. Metylacja DNA ................................................................................................... 11

1.4.1.1. Technika MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) ............ 13

1.4.2. Modyfikacje histonów ......................................................................................... 16

1.4.2.1. Metylacja histonów ........................................................................................ 17

1.4.2.2. Acetylacja histonów ....................................................................................... 18

1.4.2.3. Fosforylacja histonów .................................................................................... 19

1.4.3. Metylacja DNA i modyfikacje histonów – “remodeling chromatyny” .................. 20

1.4.4. Rola modyfikacji epigenetycznych w organizmach roślinnych ............................. 21

1.4.4.1. Regulacja procesów związanych z rozwojem u roślin ..................................... 21

1.4.4.2. Wpływ czynników stresowych na modyfikacje chromatyny ............................ 22

1.5. G

ENETYCZNE I EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE U ROŚLIN ALLOPOLIPLOIDALNYCH

... 24

1.5.1. Powstawanie i rodzaje allopoliploidów ................................................................ 24

1.5.2. Genetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych .................................. 26

1.5.3. Epigenetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych .............................. 28

1.5.4. Rearanżacje chromosomowe w genomach poliploidalnych .................................. 31

2. CEL PRACY ............................................................................................................... 33

3. MATERIAŁ I METODY ............................................................................................ 35

3.1. M

ATERIAŁ ROŚLINNY

............................................................................................... 35

3.2. T

RAKTOWANIE I UTRWALANIE MATERIAŁU

.............................................................. 36

3.3. W

YKONYWANIE PREPARATÓW

................................................................................. 37

3.3.1. Przygotowanie preparatów do immunobarwień – modyfikacje histonów .............. 37

3.3.2. Przygotowanie preparatów do FISH i immunobarwień - metylacja DNA ............. 37

3.4. I

MMUNOBARWIENIA

................................................................................................. 38

3.4.1. Analiza wzoru modyfikacji histonów i metylacji DNA ........................................ 38

3.5. F

LUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU

(FISH) ................................................. 40

3.5.1. Znakowanie DNA metodą PCR ........................................................................... 40

Spis treści

3.5.2. Znakowanie DNA metodą nick-translacji ............................................................ 41

3.5.3. Procedura FISH ................................................................................................... 41

3.5.4. Płukania pohybrydyzacyjne ................................................................................. 42

3.5.5. Detekcja i amplifikacja sygnałów ........................................................................ 43

3.6. I

ZOLACJA CAŁKOWITEGO GENOMOWEGO DNA METODĄ

„

MIKRO

-CTAB” .................. 43

3.6.1. Pomiar koncentracji i czystości wyizolowanego DNA ......................................... 44

3.7. A

NALIZA POZIOMU METYLACJI DNA Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI

MSAP

ETHYLATION

ENSITIVE

MPLIFICATION

OLYMORPHISM

) .................................. 44

3.7.1. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów metylowrażliwych .................................. 45

3.7.2. Reakcje ligacji adaptorów do miejsc restrykcyjnych ............................................ 46

3.7.3. Preamplifikacja i amplifikacja selektywna fragmentów DNA ............................. 46

3.7.4. Wizualizacja produktów amplifikacji selektywnej ............................................... 47

3.8. I

ZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

ENT

Z KULTUR BAKTERYJNYCH

. 48

3.9. R

EJESTRACJA OBRAZÓW W MIKROSKOPIE FLUORESCENCYJNYM

KONFOKALNYM I

CYTOMETRZE OBRAZOWYM

...................................................................................... 49

3.10. S

KŁAD ROZTWORÓW WYKORZYSTYWANYCH W BADANIACH

.................................. 50

4. WYNIKI ...................................................................................................................... 53

4.1. T

YPY JĄDER INTERFAZOWYCH OBSERWOWANYCH U GATUNKÓW

RASSICA

.............. 53

4.2. L

OKALIZACJA SEKWENCJI

25S,

rDNA

ORAZ SEKWENCJI CENTROMEROWYCH

ENT

2. .............................................................................................. 54

4.2.1. Lokalizacja sekwencji 5S i 25S rDNA w chromosomach metafazowych u form

uprawnych i RC gatunków Brassica .................................................................... 54

4.2.2. Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 w chromosomach metafazowych i

jądrach interfazowych ......................................................................................... 55

4.3. A

NALIZA POZIOMU METYLACJI

DNA

Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI

MSAP ............ 57

4.3.1. Kontrola jakości i koncentracji wyizolowanego DNA .......................................... 58

4.3.2. Reakcje restrykcji z użyciem enzymów MspI i HpaII........................................... 59

4.3.3. Reakcje amplifikacji selektywnej oraz analiza wzoru prążkowego ....................... 61

4.4. W

ZÓR METYLACJI

DNA ........................................................................................... 65

4.4.1. Wzór metylacji DNA w chromosomach metafazowych ....................................... 65

4.4.2. Wzór metylacji DNA w jądrach interfazowych .................................................... 66

4.4.3. Wzór metylacji DNA w chromosomach pachytenowych ...................................... 67

4.5. W

ZÓR METYLACJI HISTONU

H3 ................................................................................ 68

4.5.1. Dimetylacja H3K4............................................................................................... 68

4.5.2. Dimetylacja H3K9............................................................................................... 69

4.5.3. Trimetylacja H3K9 .............................................................................................. 69

4.6. W

ZÓR ACETYLACJI HISTONÓW

H3 ..................................................................... 70

Spis treści

4.6.1. Acetylacja H4K5 ................................................................................................. 70

4.6.2. Acetylacja H4K16 ............................................................................................... 71

4.6.3. Acetylacja H3K18 ............................................................................................... 71

4.7. A

NALIZA WZORU ACETYLACJI HISTONÓW

W CYTOMETRII OBRAZOWEJ

........ 72

4.7.1. Acetylacja H4K5 ................................................................................................. 72

4.7.2. Acetylacja H4K16 ............................................................................................... 74

4.7.3. Acetylacja H3K18 ............................................................................................... 75

4.8.

ODSUMOWANIE

…………………………………………………………………… ... 76

5. DYSKUSJA ................................................................................................................. 78

5.1. G

ENY

rRNA

JAKO MARKER CHROMOSOMÓW

............................................................ 78

5.2. S

EKWENCJE CENTROMEROWE

................................................................................... 80

5.3. R

EMODELING CHROMATYNY

.................................................................................... 82

5.3.1.Metylacja DNA .................................................................................................... 83

5.3.2.Modyfikacje histonów .......................................................................................... 86

6. WNIOSKI .................................................................................................................... 91

7. STRESZCZENIE ........................................................................................................ 93

8. LITERATURA ............................................................................................................ 95

Wykaz skrótów stosowanych w pracy

YKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY

- akrylamid/bisakrylamid

- utrwalacz (kwas octowy z alkoholem metylowym 1:3)

ABA

- kwas abscysynowy

APS

- nadsiarczyn amonu

BAC

- (ang. bacterial artificial chromosome) sztuczny chromosom

bakteryjny

BSA

- bovine albumin serum

CLF

- (ang. Curly Leaf), gen regulujący zakwitnienie

CMT3 - chromometylotransferaza histonów

C-TAB - N-cetylo-N,N,N-trimetyloaminowy bromek

DDM1 - (ang. Decrease in DNA Methylation), białko ATP - zależne

DAPI - 4`-6-diamidyno-2-fenyloindol

dNTP - deoksyrybonukleotyd (5`-trifosforan)

- siarczan dekstranu

EDTA - (ang. ethylenediaminetetraacetic acid) kwas wersenowy (kwas

etylenodiaminoczterooctowy)

FISH

- (ang. fluorescence in situ hybridization) fluorescencyjna hybrydyzacja

in situ

FITC

- (ang. fluorescein isothiocyanate) izotiocyjanian fluoresceiny

FLC

- (ang. Flowering Locus C), gen kontrolujący zakwitanie – represor

kwitnienia

HDAC - deacetylaza histonów

HAT

- acetylotransferaza histonów

H3K4me2 - Anti-dimetyl-histone H3 (Lys4), dimetylacja lizyny 4. histonu H3

H3K9me2 - Anti-dimetyl-histone H3 (Lys9), dimetylacja lizyny 9. histonu H3

H3K9me3 - Anti-trimetyl-histone H3 (Lys9), trimetylacja lizyny 9. histonu H3

H4K5ac

- Anti-acetyl-histone H4 (Lys5), acetylacja lizyny 5. histonu H4

H3K18ac - Anti-acetyl-histone H3 (Lys18), acetylacja lizyny 18. histonu H3

H4K16ac - Anti-acetyl-histone H4 (Lys16), acetylacja lizyny 16. histonu H4

Wykaz skrótów stosowanych w pracy

MBD

- (ang. Methyl-Binding Protein), białko wiążące się z zmetylownym

DNA

MET1 - metylotransferaza histonów

MSAP - Methylation Sensitive Amplification Polymorphism

PBS

- bufor fosforanowy

PCR

- (ang. polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy

RC-PCR - ang. Real-Time PCR

- Rapid Cycling Brassica

rDNA - (ang. ribosomal DNA) rybosomowy DNA (45S rDNA kodujące geny

18-5,8-26S rRNA)

RFP

- (ang Ring Finger Protein), czynnik transkrypcyjny

RNaza - rybonukleaza

rpm

- (ang. revolutions per minute) obroty na minutę

SDS

- dodecylosiarczan sodu

SSC

- bufor solankowy

SSS DNA - (ang. sheared salmon sperm DNA), blokujące DNA

SWI/SNF - (ang. SWItch/Sucrose NonFermentable), ATP – zależny kompleks

remodelujący chromatynę

TBE

- bufor do elektroforezy: tris, kwas borowy, EDTA

- bufor TE (tris-HCl, EDTA)

VRN

- (ang. Vernalization), gen regulujący proces wernalizacji

5’mC - 5-metylocytozyna

Wstęp

STĘP

1.1.

HARAKTERYSTYKA GATUNKÓW

RASSICA

Gatunki z rodzaju Brassica znajdują szerokie zastosowanie w przemyśle

spożywczym jako rośliny oleiste, warzywa oraz przyprawy. Rodzaj Brassica

obejmuje ok. 100 gatunków pochodzących z obszaru śródziemnomorskiego oraz

z Eurazji (P

OLAKOWSKI

1995). Analizowane w pracy uprawne formy B. oleracea,

B. rapa i B. napus stanowią ważną grupę roślin o bardzo dużym znaczeniu

ekonomicznym i agronomicznym na całym świecie. Jednym z najczęściej

uprawianych gatunków w klimacie umiarkowanym jest kapusta warzywna -

B. oleracea. Wytworzyła ona bardzo dużą liczbę różniących się między sobą

form, np.: kalafior, brokuł, czy kalarepa. Analizowana w pracy odmiana – kapusta

głowiasta (B. oleracea var. capitata) charakteryzuje się gładkimi liśćmi

i twardymi główkami. Może występować jako kapusta biała lub czerwona.

Kolejnym badanym w pracy gatunkiem jest rzepa jadalna – B. rapa (syn.

campestris, var. rapa). Posiada ona korzeń zgrubiały, łodygę wzniesioną, ku

górze rozgałęziającą się i pierzastodzielne liście. Kapusta rzepak – B. napus (var.

biennis, rzepak ozimy) jest gatunkiem szeroko uprawianym w strefie klimatu

umiarkowanego i stanowi jedną z najważniejszych roślin oleistych w Polsce.

Charakteryzuje się łodygą wzniesioną i gałęzistą, natomiast liście mają

sinozielony kolor i są pierzastosieczne lub ząbkowane. Owocem

charakterystycznym dla kapustowatych jest łuszczyna. Rośliny z rodzaju Brassica

mają kwiaty żółte lub białe (P

OLAKOWSKI

1995) oraz charakterystyczne małe,

koliste i ciemno-brunatne nasiona (T

ACIK

1985).

W badaniach wykorzystywano również formy „rapid cycling” – RC wyżej

opisanych gatunków Brassica. Pierwsze rośliny RC uzyskano w latach

sześćdziesiątych, natomiast w 1970 roku Paul Williams z Uniwersytetu Wisconsin

- Madison rozpoczął tworzenie kolekcji nasion sześciu gatunków Brassica:

Wstęp

B. oleracea, B. nigra, B. rapa, B. juncea, B. carinata i B. napus. Na drodze

selektywnej uprawy udało się wyodrębnić spośród każdego gatunku, osobniki

charakteryzujące się krótkim cyklem życiowym - od 35 (B. rapa) do 60 dni

(B. oleracea), małymi rozmiarami oraz wysoką liczbą nasion w każdym

pokoleniu. Obecnie, formy RC stanowią cenny materiał w badaniach biologii

molekularnej, ze względu na krótki cykl życiowy, ale również dlatego, że formy

RC posiadają swoje odpowiedniki w komercyjnie dostępnych formach uprawnych

IMELBLAU I IN

2004).

1.2.

OCHODZENIE I EWOLUCJA GATUNKÓW

RASSICA

Gatunki Brassica ze względu na wzajemne pokrewieństwa między

gatunkami diploidalnymi i allotetraploidalnymi, stanowią interesujący obiekt

badawczy do analiz genetycznych, cytogenetycznych czy też porównawczych

analiz genomów. U

(1935) ustalił, iż w wyniku krzyżowania dwóch odpowiednich

gatunków o diploidalnej liczbie chromosomów (B. oleracea, B. rapa, B. nigra),

powstały trzy gatunki allotetraploidalne: B. juncea (2n=4x=36; genom AB),

B. carinata (2n=4x=34; genom BC) oraz B. napus (2n=4x=38; genom AC).

Zależności filogenetyczne między tymi gatunkami U przedstawił w postaci

trójkąta. Trójkąt ten został opracowany na podstawie analiz cytologicznych,

uwzględniających zachowanie się chromosomów w mejozie. Późniejsze badania

potwierdziły poprawność teorii pochodzenia gatunków allotetraploidalnych,

przedstawionej przez U

ONG I IN

1991;

HENG I IN

1994;

ARKIN I IN

1995;

RUCO I IN

1996).

Istnieje

kilka

teorii

wyjaśniających ewolucję i pokrewieństwo

filogenetyczne między gatunkami Brassica. C

HEN I

ENEEN

(1991) założyli, że

podstawową liczbą chromosomów u diploidalnych gatunków Brassica jest x=3.

Hipotezę tę sformułowano, w oparciu o badania przeprowadzone na B. oleracea

o n=9. Założono, że genom ten powstał przez potrojenie podstawowej liczby

chromosomów u diploidalnych gatunków Brassica o x=3. Inną teorię

o pochodzeniu i liczbie chromosomów u gatunków Brassica przedstawił

AGERCRANTZ

(1998). Założył on, że diploidalne gatunki z rodzaju Brassica

wyewoluowały od wspólnego, heksaploidalnego przodka. Arabidopsis posiada

Wstęp

strukturę genomu, odpowiadającą hipotetycznemu genomowi diploidalnemu,

który mógł tworzyć owego przodka. Model zaproponowany przez Lagercrantza

zakłada, że linie ewolucyjne diploidalnych Brassica oddzieliły się od linii

Arabidopsis i przeszły triplikację genomu.

Ostatnie badania molekularne sugerują pojawienie się w trakcie ewolucji

współczesnych gatunków Brassica dwóch linii rozwojowych: linii

„oleracea/rapa” i linii „nigra”, dowodów na to dostarczają badania Y

ANG

‟

A I

INNYCH

(2002), prowadzone z wykorzystaniem niekodujących sekwencji DNA

chloroplastowego.

Od momentu zsekwencjonowania genomu Arabidopsis thaliana w 2000

roku rozpoczął się nowy etap badań, polegający na identyfikacji i badaniu funkcji

genów, analizie porównawczej genomów różnych gatunków, zwłaszcza tych

blisko spokrewnionych z Arabidopsis. Gatunek ten ma szczególne znaczenie

w badaniach genomów gatunków Brassica, należących do tej samej rodziny, co

Arabidopsis. L

YSAK I INNI

(2006) na podstawie porównania map genetycznych

między A. thaliana (n=5) i A. lyrata (n=8) jak również między A. thaliana

i Capsella rubella (n=8) zasugerowali, iż ancestralny kariotyp Arabidopsis

posiadał 8 chromosomów i strukturę genomu prawie identyczną, jaką posiadają

dwa współczesne gatunki A. lyrata i C. rubella. Na podstawie porównawczego

malowania chromosomów z wykorzystaniem kontigów klonów BAC

wywnioskowano, że kariotyp A. thaliana powstał z kariotypu ancestralnego przez

dwie wzajemne translokacje, trzy fuzje chromosomów i przynajmniej trzy

inwersje. W tym samym roku S

CHRANZ I INNI

(2006), na podstawie mapowania

porównawczego między A. thaliana oraz B. rapa, zidentyfikowali 24

konserwatywne, genomowe bloki, których porządek i orientacja były oparte na

ich pozycji w kariotypie ancestralnym Arabidopsis. W genomie B. rapa część

bloków zostało ztriplikowanych i często występowały one w orientacji

odwróconej w porównaniu do kariotypu ancestralnego np.: blok R

w chromosomie N2, N3 i N10 lub blok U

w chromosomie N1, N3 i N8. Wyniki

tych badań potwierdzają teorię o triplikacji genomu ancestralnego gatunków

Brassica i pochodzeniu tych gatunków od heksaploidalnego ancestora

IOLKOWSKI I IN

2006). W wyniku heterologicznej hybrydyzacji z kontigami

klonów BAC, obejmujących miejsca rekombinacji, z chromosomu 2 A. thaliana

ujawniono w chromosomach B. oleracea 3 kopie tego regionu. Hybrydyzacja

Wstęp

wskazywała na to, że region z dwoma miejscami rekombinacji był

konserwatywny w genomie Arabidopsis i Brassica. Z

IÓŁKOWSKI I INNI

(2006), na

podstawie tych badań, zaproponowali schemat ewolucji genomów Arabidopsis

i Brassica. Najpierw, ze wspólnego pnia ewolucyjnego Arabidopsis/Brassica

wyodrębnił się diploidalny przodek I Brassica, który przeszedł poliploidyzację, co

doprowadziło do uformowania się tetraploida I. Następnie doszło do rozejścia się

linii ewolucyjnych prowadzących do przodka Arabidopsis oraz przodka II

Brassica. Ostatecznie synteza tetraploida I i diploida II doprowadziła do

uformowania heksaploida III, który na skutek wtórnej diploidyzacji przekształcił

się w diploidalny gatunek B. oleracea. Teorię triplikacji genomu Brassica

potwierdzają także badania przeprowadzone przez L

YSAKA I INNYCH

(2007).

Dowody na dynamiczny i trwający proces diploidyzacji u gatunków

allopoliploidalnych Brassica przedstawili Y

ANG I INNI

(2006). Opisali oni

konsekwencje procesu diploidyzacji, stosując do analizy porównawczej genomu

A. thaliana i B. rapa sekwencje BAC, zawierające lokus genu FLC (Flowering

Locus C). Cztery z tych klonów BAC były homeologiczne do regionu 3,0 - 3,35

Mpz chromosomu piątego u A. thaliana i zostały nazwane u Brassica paralogami:

A (BrA), B (BrB), C (BrC) i C‟ (BrC‟). Autorzy oszacowali czas od rozejścia się

paralogicznych grup sprzężeń poprzez obliczenie tempa synonimicznych

substytucji nukleotydów – Ks. Czas rozejścia się gatunków Brassica-Arabidopsis

określono na 17 - 18 milionów lat temu, natomiast triplikacja w genomie Brassica

miała miejsce 13 - 17 milionów lat temu. Wartość Ks między BrC i BrC‟ była

bardzo niska i wynosiła 0,02 wskazując, że geny te były duplikowane niedawno –

0,8 miliona lat temu.

Rok później, Y

ANG

INNI

(2007)

zidentyfikowali

rodzin

retrotranspozonów TRIM – (Terminal Repeat retrotranspozon In Miniature),

cztery u gatunków Brassica i jedną u Arabidopsis. Badano polimorfizm miejsc

insercji tych elementów w obrębie gatunków z rodziny Brassiceae, określono

także czas ich insercji. Autorzy sugerują, że elementy TRIM odgrywają aktywną

rolę w rearanżacjach zduplikowanych genów w genomie Brassica, a elementy

transpozonowe aktywowane po rozejściu się Arabidopsis - Brassica mogły pełnić

ważną rolę w ewolucji zduplikowanych genów.

Wstęp

1.3.

YTOGENETYCZNE BADANIA GENOMÓW

RASSICA

Cechą charakterystyczną wszystkich omawianych w pracy gatunków są

niewielkie rozmiary genomu jądrowego, wynoszące dla 1C DNA od 0,54 pg

u B. rapa i 0,71 pg u B. oleracea do 1,15 pg u B. napus (J

OHNSTON I IN

2005).

Mitotyczne chromosomy metafazowe gatunków Brassica są liczne i małe: 1,5 –

3,5 µm (H

ASTEROK I

AŁUSZYŃSKA

1997) oraz charakteryzują się bardzo małym

zróżnicowaniem morfologicznym, co znacznie utrudnia badania cytogenetyczne.

Zastosowanie w badaniach tak małych chromosomów metod prążkowych

LSZEWSKA

1981), nie ujawnia specyficznego wzoru prążkowego, gdyż często

wybarwieniu ulega tylko heterochromatyna przycentromerowa, jak to ma miejsce

w przypadku zastosowania techniki C - prążków u gatunków Brassica. Natomiast

wykorzystanie fluorescencyjnych barwień różnicowych, np.: CMA3/DAPI do

małych chromosomów, daje możliwość zidentyfikowania między innymi

rybosomalnego DNA, co wykazano dla B. napus (H

ASTEROK I

AŁUSZYŃSKA

1997). Prawdziwy przełom w technikach cytogenetyki molekularnej stanowiło

wprowadzenie do badań nad strukturą genomu fluorescencyjnej hybrydyzacji

in situ (FISH).

Hybrydyzacja in situ jest metodą, która pozwala na fizyczną lokalizację

genów i różnych sekwencji DNA w chromosomach i jądrach interfazowych.

Technika ta polega na łączeniu wyznakowanego DNA – sondy, z sekwencjami

komplementarnymi w chromosomie (M

AŁUSZYŃSKA

1995). W zależności od

rodzaju sondy i preparatu chromosomowego, można wyróżnić następujące typy

hybrydyzacji: FISH z jedną lub wieloma (mFISH) różnie wyznakowanymi

sondami; PRINS (Primed in situ hybridization) z wykorzystaniem termostabilnej

polimerazy do wydłużenia DNA w miejscu hybrydyzacji; GISH (Genomic in situ

hybridization) z wykorzystaniem sondy w postaci całkowitego, genomowego

DNA; oraz EDF-FISH (z ang. Extended DNA Fibers, rozciągnięte włókna

chromatynowe) (P

ARRA I

INDLE

1993).

Wstęp

1.3.1.

Lokalizacja sekwencji powtarzalnych z zastosowaniem metody FISH

Wykorzystując technikę FISH, zlokalizowano wiele niekodujących

sekwencji tandemowo powtórzonych. Jedną z nich jest telomerowe DNA,

wyizolowane z A. thaliana, które hybrydyzuje z telomerami chromosomów

różnych gatunków (S

CHWARZACHER I

ESLOP

-H

ARRISON

1991;

CHUBERT

1992;

AJDERA I IN

2003). FISH stosowana jest także, w badaniach nad lokalizacją

DNA centromerowego u roślin. Badania molekularne DNA centromerowego

u roślin wyższych zostały zapoczątkowane w latach osiemdziesiątych na

modelowej roślinie Arabidopsis thaliana. Centromerową lokalizację sekwencji

180 pz (klon pAL1) metodą FISH u roślin, po raz pierwszy wykazali

ALUSZYNSKA I

ELSOP

-H

ARRISON

(1991). W późniejszych badaniach F

RANSZ I

INNI

(2000) wskazali, że centralną domenę w centromerach u Arabidopsis

stanowią tandemowe układy monomerów 180 pz, między którymi znajdują się

kopie retrotranspozonu Athila (grupa Ty3-gypsy). Sekwencje centromerowo -

specyficzne zidentyfikowano także u gatunków Brassica (H

ARRISON I

ESLOP

ARRISON

1995). Z tandemowych sekwencji centromerowych o długości 360 pz

uzyskano dwa klony: pBoKB1 u B. oleracea i pBcKB4 u B. rapa. U B. oleracea

klon pBoKB1 hybrydyzował z 7 parami chromosomów homologicznych,

podobnie jak klon pBcKB4. Natomiast, u B. rapa klon pBcKB4 dawał sygnały

w 7 (wysoka siła płukań) lub 9 parach chromosomów (niska siła płukań), a z

klonem pBoKB1 uzyskano tylko 6 sześć sygnałów. U B. napus liczba sygnałów

obu sekwencji była równa liczbie chromosomów, przy czym obserwowano mniej

sygnałów dla sondy pBoKB1. Wyniki tych badań wskazują, że sekwencje

centromerowe mogą być genomowo - specyficzne (O

LSZEWSKA

2003).

Dystrybucję centromerowych sekwencji powtarzalnych - CentBr1

i CentBr2 w chromosomach B. rapa, określili L

IM I INNI

(2005). Użyli oni dwóch

klonów BAC z B. rapa: KBrH001B09 zawierający sekwencję CentBr1

i KBrH001E07 zawierający sekwencję CentBr2, do lokalizacji powtórzeń

centromerowych w jądrach interfazowych, chromosomach mitotycznych

i mejotycznych. Natomiast, w roku 2007 do wyników badań nad centromerami

u gatunków Brassica dołączono także lokalizację centromerowo - specyficznych

Wstęp

retrotranspozonów (CRB) i przycentromerowo - specyficznych retrotranspozonów

(PCRBr) (L

IM I IN

2007).

1.3.2.

Lokalizacja genów rRNA

Geny rRNA występują tandemowo w wielu powtórzeniach, co umożliwia

ich stosunkowo łatwą lokalizację w chromosomach przy wykorzystaniu techniki

FISH. W genomach obecne są dwa rodzaje rDNA: 45S (18S-5,8S-26S) i 5S

rDNA. Sekwencje te mogą być zlokalizowane w genomie niezależnie od siebie,

na różnych chromosomach, w jednym locus lub w wielu loci (M

ALUSZYNSKA I

1998), bądź mogą występować wspólnie na jednym chromosomie, jak

u A. thaliana (M

URATA I IN

1997), czy B. rapa (H

ASTEROK I IN

2001).

Występowanie genów 45S rRNA jest na ogół związane z przewężeniem wtórnym

i obszarem satelity, natomiast sekwencja 5S rDNA może występować w różnych

miejscach na chromosomie.

Wykorzystując technikę FISH określono liczbę i położenie genów rRNA

u różnych gatunków roślin: Hordeum vulgare (L

EITCH I

ESLOP

-H

ARRISON

1993), Beta vulgaris (S

CHMIDT I IN

1994), Secale cereale (C

UADRADO I IN

1995), Amaranthus (K

OLANO I IN

2001) oraz u gatunków Brassica (H

ASTEROK I

ALUSZYNSKA

2000

;

ASTEROK I IN

2001;

ASTEROK I IN

2006). Z badań nad

tymi ostatnimi wynika, że liczba loci rDNA u gatunków allotetraploidalnych jest

zwykle mniejsza, niż suma liczby loci u odpowiednich diploidalnych gatunków

ancestralnych. Może to świadczyć o zajściu licznych przemian chromosomowych

podczas ewolucji tych gatunków, które doprowadziły do redukcji liczby loci

genów rRNA u poliploidów (M

ALUSZYNSKA I

ESLOP

-H

ARRISON

1993).

Geny rRNA cechują się konserwatywnym charakterem sekwencji

kodujących, dlatego wykazują wysoki stopień homologii między różnymi

gatunkami (M

AŁUSZYŃSKA

1999). Jednakże długość przerywnikowych jednostek

nietranskrybowanych rDNA i liczba kopii nawet w obrębie danego locus może

być zróżnicowana (S

CHUBERT

1984;

ASTEROK I

ALUSZYNSKA

1998).

W wyniku różnych rearanżacji chromosomowych mających miejsce w toku

ewolucji, może dochodzić do polimorfizmu liczby i występowania loci genów

rRNA. Taki polimorfizm obserwowany był u wielu gatunków roślin: żyta

Wstęp

UADRADO I

OUVE

1997), ryżu (S

HISHIDO I IN

2000), a także u gatunków

Brassica (H

ASTEROK I IN

2001;

ASTEROK I IN

2006).

Geny rRNA nie są jednak wystarczającymi markerami dla identyfikacji

wszystkich chromosomów u gatunków Brassica. W tym celu coraz częściej

wykorzystywane są klony BAC, które użyte, jako sonda we fluorescencyjnej

hybrydyzacji in situ, umożliwiają fizyczne mapowanie zawartych w nich

sekwencji unikatowych. Klony BAC wykorzystywane są, jako chromosomowo -

specyficzne markery cytogenetyczne oraz służą do konstruowania bibliotek DNA

u różnych gatunków: A. thaliana (C

HOI I IN

2000), Hordeum vulgare (Y

U I IN

2000), B. rapa (P

ARK I IN

2005), czy Brachypodium (H

ASTEROK I IN

2006

Kilkanaście klonów BAC niosących sekwencję tego samego chromosomu

zastosowano do tworzenia chromosomowo - specyficznych sond DNA

i malowania chromosomów u A. thaliana (L

YSAK I IN

2001;

2003;

2006).

Badania struktury i ewolucji genomów gatunków Brassica, w których

wykorzystywane są klony BAC, w dużej mierze oparte są na porównawczym

mapowaniu fizycznym pomiędzy Arabidopsis i Brassica (patrz podrozdział 1.2).

1.4.

PIGENETYCZNE MODYFIKACJE CHROMATYNY

Prawidłowe funkcjonowanie genomu kontrolowane jest na kilku poziomach:

genetycznym, związanym z DNA, poprzez wiązanie czynników

transkrypcyjnych do promotorów genów, które ulegają transkrypcji,

epigenetycznym, czyli tzw. dziedzicznym wpływie na aktywność

określonych genów bez zmiany w sekwencji nukleotydów w łańcuchu

DNA. Epigenetyczna kontrola aktywności lub wyciszania genów odbywa

się między innymi poprzez mechanizmy metylacji DNA i modyfikacji

histonów korowych.

na poziomie struktury chromatyny, której stopień upakowania wpływa na

dostępność czynników transkrypcyjnych do promotorów genów, a co za

tym idzie na aktywność tychże genów (J

ASENCAKOVA I IN

2003).

DNA w komórce występuje w postaci związanej z białkami histonowymi

i niehistonowymi (głównie enzymatycznymi) oraz niewielką ilością RNA,

tworząc chromatynę. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest

Wstęp

nukleosom. Składa się on z rdzenia histonowego o średnicy 10 nm, w skład

którego wchodzą po dwie kopie każdego z białek histonowych: H2A, H2B, H3,

H4. Na trzon histonowy nawinięte jest DNA o długości około 150 pz. Pomiędzy

nukleosomami występuje tzw. DNA łącznikowy o długości od 10 do 95 pz.

Struktura nukleosomowa jest stabilizowana przez łącznikowy histon H1 (L

UGER

2003). Modyfikacje epigenetyczne chromatyny związane są z metylacją DNA

oraz z różnymi modyfikacjami potranslacyjnymi histonów. Opisane zmiany

epigenetyczne wpływają na stopień kondensacji chromatyny. Euchromatyna

stanowi dominujący składnik chromatyny, cechuje się luźną strukturą, jej DNA

replikuje we wczesnej i środkowej fazie S cyklu komórkowego, charakteryzuje

się brakiem lub niskim poziomem metylacji DNA oraz nadwrażliwością na

działanie DNaz-y (O

LSZEWSKA

2007). Euchromatyna obejmuje sekwencje

kodujące, jest aktywna transkrypcyjnie, w przeciwieństwie do wysoce

zkondensowanej heterochromatyny, która zawiera głównie sekwencje

powtarzalne i jest zazwyczaj nie aktywna transkrypcyjnie (V

OLKOV I IN

2006).

Heterochromatynę dzieli się na dwie frakcje:

konstytutywną, której DNA obejmuje sekwencje wysoko powtarzalne,

retroelementy i transpozony DNA. Jej dekondensacja następuje tylko

podczas replikacji DNA, podczas późnej fazy S cyklu komórkowego.

Heterochromatynę

konstytutywną

stanowią

głównie

regiony

przycentromerowe. W jądrze interfazowym gatunków, o stosunkowo

małej zawartości DNA, heterochromatyna konstytutywna widoczna jest

w postaci chromocentrów (Olszewska, 2007).

fakultatywną, nazywaną także skondensowaną euchromatyną, która

powstaje

euchromatyny

wyniku

procesu

zwanego

„heterochromatynizacją” (O

LSZEWSKA

2007).

1.4.1.

Metylacja DNA

Metylacja DNA to przykład najczęściej występującej u roślin wyższych

modyfikacji epigenetycznej. Polega ona na kowalencyjnym przyłączeniu grupy

metylowej do węgla w pozycji 5‟ reszty cytozynowej (B

ENDER

2004). Proces ten

katalizowany jest przez enzymy z grupy metylotransferaz. Metylacja DNA

u roślin może zachodzić w sekwencjach symetrycznych CG i CNG (gdzie N to

Wstęp

dowolny nukleotyd), bądź asymetrycznych CHH (gdzie H = A, C, T). Zawartość

metylowanej cytozyny u roślin stanowi od 5 do 25% całkowitej ilości cytozyny,

jest ona znacznie wyższa niż u zwierząt (V

OLKOV I IN

2006).

Metylacja DNA ma miejsce po procesie replikacji i jest przekazywana na

potomną nić przez metylotransferazy rozpoznające hemimetylowane DNA.

U Arabidopsis zidentyfikowano 10 genów kodujących metylotransferazy.

U gatunku tego wyróżnia się 3 klasy metylotransferaz: MET1, CMT i DRM.

MET1

homologiczna

metylotransferazy

ssaków - DNMT1, jest

odpowiedzialna za metylację zachowawczą w czasie podziałów komórek.

W wyniku mutacji w genie kodującym MET1 następuje utrata metylacji w obrębie

sekwencji CG i ma ona skutki letalne dla komórki (F

UCHS I IN

2006). Geny

MET1 ulegają ekspresji w tkankach merystematycznych, wegetatywnych oraz

generatywnych (V

OLKOV I IN

2006). Zidentyfikowano kilka homologów MET1,

między innymi u: marchwi, grochu, tytoniu, pomidora, kukurydzy czy też ryżu

INNEGAN I

OVAC

2000;

AKANO I IN

2000;

EERAWANICHPAN I IN

2004).

Za metylację zachowawczą sekwencji CNG i CHH odpowiedzialna jest

metylotransferaza CMT3. Klasa tych enzymów charakteryzuje się obecnością

chromodomeny, zlokalizowanej wewnątrz konserwatywnej katalitycznej domeny

metylotransferazy. U mutantów cmt3 kukurydzy obserwowano znaczne obniżenie

poziomu metylacji w sekwencjach CNG, podczas gdy nie obserwowano redukcji

poziomu metylacji DNA w układzie CG (F

INNEGAN I

OVAC

2000).

Białka DRM są analogami metylotransferaz ssaków - DNMT3

i odpowiadają za metylację de novo (C

AO I

ACOBSEN

2002).

Zawierają one

domeny ubikwitynowe, które mogą brać udział w interakcjach białko-białko.

W procesie metylacji DNA aktywnie uczestniczą także ATP – zależne

kompleksy remodelujące chromatynę, które są homologami SWI2/SNF2

EDDELOH I IN

1999). U Arabidopsis wykryto ponad 40 takich kompleksów

SIEH I

ISCHER

2005). Wśród nich znajduje się białko DDM1, które jest

zaangażowane między innymi w utrzymanie metylacji DNA.

Liczne badania w kontekście zmian poziomu metylacji DNA prowadzone

są z wykorzystaniem mutantów Arabidopsis, które charakteryzują się mutacjami

w genach kodujących wymienione metylotransferazy. U tych mutantów obniżenie

poziomu metylacji DNA często wiąże się z aktywacją różnych elementów

ruchomych. L

IPPMAN I INNI

(2003) analizowali aktywację 6 elementów

Wstęp

ruchomych u mutantów ddm1, met1 i cmt3. Okazało się, że u ddm1 i met1

aktywacja wszystkich 6 elementów, związana była z utratą metylacji DNA

i metylacji lizyny 9. histonu H3 oraz metylacją lizyny 4. histonu H3. Badano

także, czy aktywność transkrypcyjna tych elementów zostanie utrzymana

w pokoleniu F1, powstałym ze skrzyżowania wstecznego mutanta i formy dzikiej.

U wymienionych powyżej mutantów wszystkie analizowane elementy ruchome

pozostały aktywne w pokoleniu F1. Odmiennie sytuacja kształtowała się

w przypadku mutanta cmt3, u którego aktywacji podlegał tylko retrotranspozon

ATLINE1-4 i ten sam był także aktywny w pokoleniu F1. Podobne badania

u mutantów Arabidopsis przeprowadził K

ATO I INNI

(2003). Analizowali oni

aktywność transkrypcyjną i transpozycyjną elementów CACTA1. Okazało się, że

redukcja w metylacji DNA jest wystarczająca do mobilizacji tych transpozonów.

Transkrypty CACTA wykryto u mutantów met1 i ddm1, jednakże tylko u ddm1

obserwowano wysoką częstotliwość transpozycji tego elementu. U cmt3

stwierdzono natomiast, niską częstotliwość transpozycji.

Mutanty ddm1 i met1 cechują się mniejszymi chromocentrami, co

świadczy o częściowej eliminacji heterochromatyny z tych struktur (F

RANSZ I IN

2003).

OPPE I INNI

(2002), udowodnili, że sekwencje wysoce powtarzalne, np.:

pAL1, 45S i 5S rDNA u tych mutantów kolokalizują z chromocentami, natomiast

eliminacji z chromocentrów ulegają przede wszystkim elementy ruchome, takie

jak

Emi12

czy

AthE1.4,

które znajdują się w heterochromatynie

przycentromerowej.

1.4.1.1. Technika MSAP (Methylation Sensitive Amplification

Polymorphism)

W badaniach poziomu metylacji DNA u różnych gatunków roślin bardzo

często wykorzystywana jest technika MSAP, będąca modyfikacją metody AFLP

(Amplified Fragment Length Polymorphism). Techniki te, łączą wykorzystanie

enzymów restrykcyjnych i reakcji PCR. Standardowy protokół AFLP opiera się

na selektywnej amplifikacji części fragmentów restrykcyjnych, otrzymanych po

cięciu DNA odpowiednimi enzymami. Technika ta, obecnie jest szeroko

stosowana do tworzenia map genetycznych, a przede wszystkim do wysycania już

istniejących (N

EGI I IN

2000;

OMBARD I

ELOURME

2001;

RADHAN I IN

2004).

W metodzie AFLP można wyróżnić cztery główne etapy: restrykcję DNA, ligację

Wstęp

adaptorów, preamplifikację oraz amplifikację selektywną (V

OS I IN

1995).

W pierwszym etapie przeprowadza się cięcie totalnego DNA dwoma enzymami

restrykcyjnymi: częstotnącym (najczęściej MseI) i rzadkotnącym (najczęściej

EcoRI). W technice MSAP stosuje się parę enzymów metylowrażliwych, np.:

MspI i HpaII, zamiast MseI. Enzym rzadkotnący pozostaje niezmieniony. Kolejny

etap reakcji AFLP obejmuje ligację adaptorów do powstałych po restrykcji

fragmentów DNA. Adaptorami są oligonukleotydowe odcinki DNA o arbitralnej

sekwencji, w oparciu o które konstruuje się startery do reakcji amplifikacji.

Ligacja adaptorów powoduje zanik miejsca restrykcyjnego i zabezpiecza

połączone sekwencje przed ponownym przecięciem. Wykorzystuje się dwa

rodzaje adaptorów: jeden komplementarny do miejsca cięcia dla enzymu

częstotnącego, a drugi dla enzymu rzadkotnącego (Ryc. 1). W reakcji

preamplifikacji wykorzystuje się startery komplementarne do sekwencji

adaptorów, z których przynajmniej jeden posiada dodatkowy, selektywny

nukleotyd na końcu 3‟. Reakcja ta pozwala na ograniczenie liczby

amplifikowanych fragmentów DNA. Natomiast, w amplifikacji selektywnej

stosuje się startery z dwoma lub trzema selektywnymi nukleotydami, co

dodatkowo zmniejsza liczbę fragmentów amplifikowanych tak, że mogą one być

rozdzielone w żelu poliakrylamidowym. Starter komplementarny do miejsca

cięcia dla enzymu rzadkotnącego jest znakowany fluorescencyjnie (np.: IRD 800)

lub radioaktywnie, co pozwala zwizualizować część produktów amplifikacji.

W technice MSAP opisane wyżej reakcje ligacji, preamplifikacji oraz amplifikacji

selektywnej przeprowadza się według tego samego protokołu, dokonując jedynie

modyfikacji poszczególnych warunków temperaturowych w kolejnych reakcjach

amplifikacji.

Wstęp

GACTGCGTACCAATTC

CAC

GAGCATCATCATCTGACGCATGGTTAAGGTC

Starter

EcoR

5’

TCGTTACTCAGGACTCAT
AGC

AATGAGTCCTGAGTAG

CAG

AGCAATGAGTCCTGAGTAGCAG

AATTCCAC

TCGT

GGTG

AGCAAT

Fragment restrykcyjny

Ligacja adaptorów

CTCGTA

GACTGCGTACCAATTC

CAC

CATCTGACGCATGGTTAAGGTC

CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCAC

amplifikacja

Nukleotydy

selektywne

Starter

Mse

TCGTTACTCAGGACTCATCGTC
AGC

AATGAGTCCTGAGTAG

5’

Adaptor

Mse

Adaptor

EcoR

GAATTC

TTAA

Miejsce cięcia

EcoR

Miejsce cięcia

Mse

Nukleotydy

selektywne

Ryc. 1 Schemat reakcji AFLP (wg V

OS I IN

1995, zmienione)

Zastosowanie pary enzymów restrykcyjnych umożliwia wykrycie

metylacji obu cytozyn w sekwencji CCGG. Enzym MspI przecina tą sekwencję

w przypadku wystąpienia metylacji cytozyny wewnętrznej, natomiast enzym

HpaII dokonuje cięcia, gdy hemimetylowana jest cytozyna zewnętrzna.

Dodatkowo oba enzymy przecinają tę sekwencję w przypadku braku metylacji

obu cytozyn. W rezultacie można otrzymać następujący wzór prążkowy (Ryc. 2).

Ryc. 2 Wzór metylacji po cięciu enzymami MspI i HpaII (elipsy oznaczają
brak prążka w danym locus).

Technika MSAP jest z powodzeniem stosowana w wykrywaniu metylacji

DNA, u wielu gatunków roślin (X

IONG I IN

1999;

U I IN

2000;

HERMAN I

ALBERT

2002). Badania te mają głównie na celu porównanie poziomu metylacji

w pokoleniach krzyżówek dwóch form rodzicielskich, czego przykładem mogą

Wstęp

być badania przeprowadzone u ryżu (X

IONG I IN

1999), czy też u pszenicy

HERMAN I

ALBERT

2002).

Często technikę tę wykorzystuje się, jako jedno

z narzędzi w badaniach procesu allopoliploidyzacji. Takie analizy

przeprowadzono u resyntetyzowanych gatunków allotetraploidalnych z rodzaju

Arabidopsis (M

ADLUNG I IN

2002)

i Brassica (L

UKENS I IN

2006;

AETA I IN

2007). Badania te wskazują na istnienie zmian w poziomie metylacji DNA

u gatunków poliploidalnych (M

ADLUNG I IN

2002). U resyntetyzowanych

B. napus reakcje MSAP przeprowadzono na cDNA, wykorzystując między

innymi startery RFLP i SSR. Stwierdzono, że u B. napus część fragmentów

pochodzących od gatunków rodzicielskich uległa zanikowi, jednak utrata

fragmentu specyficznego dla jednego z rodziców u B. napus, nie była

równoważona pojawieniem się nowego fragmentu. W pracy tej pokazano

również, że metylacja „de novo” była charakterystyczna dla fragmentów

pochodzących z genomu B. rapa (L

UKENS I IN

2006). Podobne badania

przeprowadził G

AETA I INNI

(2007), analizie MSAP poddano ponad 50 linii

resytetyzowanych B. napus, a zmiany w poziomie metylacji porównywano

w przeciągu pięciu kolejnych pokoleń. Stwierdzono, iż wzór metylacji DNA

w pokoleniu S0 jest, z wyjątkiem niewielkich zmian, utrwalony w pokoleniu S5.

Technika

MSAP w połączeniu z analizą ChIP (Chromatin

Immunoprecipitation) oraz RT-PCR bardzo często jest wykorzystywana

w badaniach zmian poziomu ekspresji genów u poliploidów, które są związane

między innymi z modyfikcjami epigenetycznymi (C

OMAI I IN

2000;

EE I

HEN

2001).

1.4.2.

Modyfikacje histonów

Histony to małe, zasadowe białka, które są zasocjowane z jądrowym

DNA. Rdzeń każdego histonu ma postać globularnej domeny, tworzonej przez

trzy helisy, a motywy N - końcowe (ogony histonu) zawierają duże ilości

zasadowych aminokwasów, takich jak lizyna czy arginina oraz pośredniczą

w tworzeniu heterodimerów histonów w nukleosomie. Istnieje pięć klas histonów:

H1 - zwany histonem łącznikowym (bogaty w lizynę) oraz H3, H4 (bogate

w argininę), H2A, H2B - budujące rdzeń nukleosomu. N – końcowe ogony

histonów są poddawane różnego rodzaju modyfikacjom potranslacyjnym:

Wstęp

metylacji, acetylacji, fosforylacji, a także w domenach globularnych -

ubikwitynacji. Modyfikacje te mogą dotyczyć reszt argininowych, lizynowych

oraz serynowych poszczególnych histonów (Tab. 1).

Tab. 1 Najczęściej modyfikowane aminokwasy histonów korowych

Histon

Modyfikacja

metylacja

acetylacja

fosforylacja

ubikwitynacja

*K4, K9, K27,

*R2, R17, R26

K9, K18, K18,

K23,

*S10, S28, *Tr3,

Tr11

K20, R3

K5, K8, K12,

K16, K20

H2A

K5, K9

K119

H2B

K5, K12, K15,

K20

K120

* K – lizyna, R – arginina, S – seryna, Tr - treonina

Histony to ewolucyjnie wysoko konserwatywne białka, dotyczy to

zarówno aminokwasów jak i ich kowalencyjnych modyfikacji. Mimo, iż

modyfikacjom podlegają, w większości te same aminokwasy u różnych grup

organizmów, to efekt tych zmian może mieć różny wpływ na strukturę

chromatyny. Wszystkie opisane modyfikacje zmieniają właściwości chemiczne

białek histonowych, co prowadzi do rearanżacji struktury chromatyny i wpływa

na dostępność do DNA różnego rodzaju czynników transkrypcyjnych, regulując

w ten sposób aktywność poszczególnych genów (J

ASENCAKOVA

2003).

1.4.2.1. Metylacja histonów

Metylacja histonów zachodzi po ich biosyntezie i jest katalizowana przez

metylotransferazy histonów – HMT, z rodziny białek SU(VAR)3-9. Dołączenie

grupy metylowej do aminokwasów wywołuje zmianę w architekturze chromatyny

i w zdolności do wiązania białek. Aminokwasy argininowe mogą podlegać mono-

lub dimetylacji, natomiast reszty lizynowe są mono-, di- i trimetylowane

OLKOV I INNI

2006).

Wstęp

Metylacja poszczególnych aminokwasów w danym histonie związana jest

z różnym stanem chromatyny (J

ACKSON I IN

2004).

Dla euchromatyny

charakterystyczne jest występowanie mono-, di- i trimetylowanego histonu H3

w lizynie w pozycji 4. (J

ASENCAKOVA I IN

2003;

UCHS I IN

2006), natomiast

metylowane lizyny 9. i 27. histonu H3 oraz 20. histonu H4, na ogół związane są

z heterochromatyną (F

UCHS I INNI

2006). Modyfikacje te są konserwatywnymi

wyznacznikami heterochromatyny konstytutywnej, choć obecne są również

w wyciszonej transkrypcyjnie euchromatynie (O

LSZEWSKA

2007).

Również ilość przyłączonych grup metylowych do konkretnych

aminokwasów, decyduje o stanie chromatyny. U Arabidopsis trimetylacja lizyny

9. i 27. histonu H3 oraz di- i trimetylacja lizyny 20. histonu H4 są typowe dla

euchromatyny, natomiast chromocentra są bogate w mono- i dimetylowane lizyny

9. i 27. histonu H3 oraz monometylowaną lizynę 20. w histonie H4 (F

UCHS I IN

2006). Ostatnie badania wskazują, iż H3K27me3 u Arabidopsis związana jest

z sekwencjami regulatorowymi DNA i różnymi czynnikami transkrypcyjnymi

HANG I IN

2007). Modyfikacja ta u Arabidopsis została również wykryta

w miejscu wiązania białka LHP1, pełniącego rolę w represji transkrypcji genów

z obszaru euchromatyny (T

URCK I IN

2007).

Różnice we wzorze metylacji H3K9 u różnych gatunków mogą zależeć od

różnej zawartości jądrowego DNA, czyli jak proponuje H

OUBEN I INNI

(2003), są

skorelowane z wielkością genomu.

1.4.2.2. Acetylacja histonów

Modyfikacja ta powoduje rozluźnienie chromatyny, wpływa na wzrost

aktywności transkrypcyjnej, przez neutralizowanie ładunku dodatniego ogonów

histonu i zmniejszanie ich powinowactwa do DNA. Enzymy katalizujące reakcję

przeniesienia grup acetylowych z acetylo-CoA, na wolne grupy aminowe lizyn

w ogonach histonów, to acetylotransferazy (HAT) (V

OLKOV I INNI

2006).

Wyróżniamy dwie grupy HAT: A – jądrowe oraz B – cytoplazmatyczne. Typ A

obejmuje cztery odmienne klasy HAT: rodzinę białek MIST, p300/CBP,

TAF

250 i GCN5 (C

HEN I

IAN

2007). W komórkach roślin występują również

enzymy HDAC – katalizujące proces deacetylacji histonów. Możemy wyróżnić

trzy główne klasy tych enzymów: RPD3/HDA1, SIR2 i HD2 (P

ANDEY I IN

2002;

Wstęp

OLKOV I IN

2006). Histony deacetylowane są charakterystyczne dla

heterochromatyny.

I I INNI

(2005) badali zmiany acetylacji histonów H3 i H4 u Nicotina

tabacum, podczas cyklu komórkowego. Okazało się, że poziom acetylacji

zmniejsza się w trakcie mitozy. Deacetylacja histonu H4 zaczyna się w profazie

i trwa do telofazy, wpływając na kondensację chromosomów, natomiast

deacetylacja histonu H3 zachodzi pomiędzy metafazą, a anafazą i utrzymuje się

do telofazy. U bobu stwierdzono hypoacetylację w obrębie lizyny 18. i 14. histonu

H3 w rejonach heterochromatyny, zbudowanej z tandemowych powtórzeń

sekwencji Fok-I. Natomiast hyperacetylację tych aminokwasów obserwowano

w obrębie NOR (B

ELYAEV I IN

1998). W jądrach interfazowych bobu

i jęczmienia najwyższy poziom acetylacji H4K5 ma miejsce w trakcie fazy S.

Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko acetylowanym lizynom 5.

i 12. histonu H4 u bobu ujawniło zróżnicowany wzór acetylacji w eu-

i heterochromatynie podczas faz G1, S i G2 cyklu komórkowego. Może to

wskazywać, że acetylacja tego histonu jest związana z procesem replikacji DNA,

gdzie do nowozreplikowanej chromatyny włączane są acetylowane izoformy

histonu H4 (J

ASENCAKOVA I IN

2000).

1.4.2.3. Fosforylacja histonów

U roślin fosforylacja histonu H3 jest związana z regulacją cyklu

komórkowego (H

OUBEN I IN

2007). Zależna od cyklu komórkowego zamiana

zdekondensowanej chromatyny interfazowej w skondensowaną chromatynę

chromosomów metafazowych jest najbardziej dynamiczną modyfikacją struktury

chromatyny. Fosforylacja H3S10 i H3S28 rozpoczyna się zwykle od regionu

centromerowego podczas mitozy (G

ERNAND I IN

2003), również podczas mejozy

we wczesnej profazie I od regionu centromerowego, a następnie rozprzestrzenia

się wzdłuż ramion chromosomów. U roślin monocentrycznych np.: (Secale

cereale) rozmieszczenie fosforylowanych seryn 10. i 28. różni się pomiędzy

dwoma podziałami mejotycznymi. Podczas pierwszego podziału chromosomy

posiadają ufosforylowane histony na całej długości, natomiast w czasie drugiego

podziału fosforylacja jest ograniczona jedynie do regionów przycentromerowych

OUBEN I IN

2007).

Wstęp

Różnice we wzorze fosforylacji poszczególnych aminokwasów H3

w obrębie chromosomów występują między roślinami i ssakami. Histony

posiadające ufosforylowaną treoninę w pozycji 3. i 11. u roślin występują wzdłuż

ramion chromosomów, co jest związane z kondensacją chromosomów podczas

mitozy i mejozy (F

UCHS I IN

2006). Inna sytuacja jest obserwowana u ssaków,

gdzie fosforylacja seryny 10. i 28. wzdłuż ramion chromosomów jest związana

z kondensacją chromosomów, a fosforylacja treoniny 11. w centromerach wpływa

na kohezję centromerów (F

UCHS I IN

2006).

1.4.3.

Metylacja DNA i modyfikacje histonów – “remodeling chromatyny”

Ekspresja genów u organizmów eukariotycznych zależy w głównej mierze

od dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych. Decydują o tym dwa

główne mechanizmy, powodujące wyciszanie genów: metylacja DNA

i modyfikacje histonów (S

TAWSKI I IN

2005). Wyciszanie genów w wyniku

metylacji DNA jest powiązane z deacetylacją histonów poprzez białka – MBD,

które wiążą się z metylowanym DNA, powodując z kolei wiązanie deacetylaz

histonów - HDAC (B

ERG I IN

2003;

EMACH I IN

2005). Istnieje także

niezaprzeczalny związek między metylacją DNA, a metylacją histonów.

U mutantów Arabidopsis kyp (mutacja w genie kodującym metylotransferazę

histonów KYP=SUVH4) i cmt3 następuje znaczna utrata metylacji DNA

w sekwencjach CNG, spada także poziom metylacji H3K9, natomiast nie zmienia

się poziom metylacji DNA w sekwencjach CG. Wniosek stąd taki, iż metylacja,

a dokładniej H3K9me2, jest krytyczną modyfikacją powodującą wyciszanie

genów oraz metylację DNA, przynajmniej w sekwencjach CNG (J

ACKSON I IN

2004).

OPPE I INNI

(2002) oraz następnie T

ARIQ I INNI

(2003) na podstawie badań

mutantów ddm1 i met1, zaproponowali nieco odmienny model współzależności

między modyfikacjami histonów, a metylacją DNA w wyciszaniu genów -

mianowicie, iż metylacja H3K9 jest powodowana metylacją DNA w sekwencjach

CG. S

OPPE I INNI

(2003) w swoim modelu zaznaczyli również, że w powstawaniu

heterochromatyny u Arabidopsis, prócz metylacji DNA i histonu H3, ważną rolę

pełnią deacetylacja H4K16 oraz wiązanie białka LHP1.

Modyfikacje chromatyny zależą w dużej mierze od tzw. wariantów

histonów. Wariant histonu H3.3 jest włączany do aktywnej chromatyny, gdzie

Wstęp

charakteryzuje się modyfikacjami specyficznymi dla aktywności transkrypcyjnej,

jak dimetylacja H3K4 (M

ITTRICK I IN

2004).

Na stan chromatyny istotny wpływ mają także mechanizmy

potranskrypcyjnego wyciszania genów – PTGS oraz metylacji DNA za

pośrednictwem RNA – RdDM (A

UFSATZ I IN

2002;

TAWSKI I IN

2005).

U roślin wykryto obecność małych cząsteczek RNA: małe wyciszające RNA

(siRNA) oraz mikro RNA (miRNA). miRNA to 20-22 nukleotydowe

jednoniciowe fragmenty RNA, natomiast siRNA to 21-26 nukleotydowe,

dwuniciowe cząsteczki RNA, posiadające wolne niesparowane dwunukleotydowe

końce 3‟ i ufosforylowane końce 5‟. siRNA powstają w wyniku degradacji

dwuniciowego RNA (dsRNA), które może powstać w komórce wskutek replikacji

wirusa, lub transkrypcji transgenu mającego postać odwróconych powtórzeń.

U Arabidopsis thaliana kluczowymi białkami zaangażowanymi w formowanie

heterochromatyny przy udziale siRNA są: DICER-LIKE 3 (DCL 3),

ARGONAUTE 4 (AGO 4), Polimeraza RNA zależna od RNA 2 (RDR 2) i dwie

formy jądrowej polimerazy RNA IV (Pol IV a i Pol IV b) (P

ONTES I IN

2006).

1.4.4.

Rola modyfikacji epigenetycznych w organizmach roślinnych

1.4.4.1. Regulacja procesów związanych z rozwojem u roślin

W ostatnich latach zidentyfikowano u roślin wiele mutantów

charakteryzujących się zaburzeniami w rozwoju, u których nie ulegały ekspresji

geny kodujące czynniki związane z modyfikacjami chromatyny (R

EYES I IN

2002). Okazało się, że modyfikacje epigenetyczne pełnią ważną rolę w regulacji

rozwoju u roślin. Ekspresja wielu genów i czynników transkrypcyjnych,

związanych z rozwojem, jest regulowana poprzez zmiany w poziomie metylacji

DNA oraz modyfikacje histonów.

Metylacja DNA pełni ważną rolę w regulacji procesów związanych

z rozwojem u roślin. Przykładem może być powstawanie endospermu, które jest

regulowane przez geny FIE-1, FIS i MEA – represory autonomicznych podziałów

komórki centralnej przed zapłodnieniem (L

I I IN

2002). U hypometylowanych

mutantów fie-1 dochodzi do autonomicznego rozwoju endospermu (K

IYSUE I IN

1999;

UO I IN

1999;

HAD I IN

1999;

INKENOOG I IN

2000;

ROSSNIKLAUS I

2001). Bardzo istotną rolę regulacyjną w genomach roślinnych spełniają

Wstęp

kompleksy aktywnie remodelujące chromatynę. Ostatnie badania S

ARNOWSKIEGO

I INNYCH

(2005) wskazują, iż u Arabidopsis mutacje w genach AtSWI3a

i AtSWI3b, należących do rodziny SWI-SNF, powodują defekty w rozwoju

zarodka w stadium globularnym, natomiast w genie AtSWI3c prowadzą do

półkarłowatości roślin, zaburzeń w rozwoju korzeni i kwiatów.

Procesem ściśle kontrolowanym przez czynniki remodelujące chromatynę

jest zakwitanie roślin. Obniżonie poziomu deacetylaz histonów: HDAC i HDA1,

oraz mutacje w genach z rodziny polycomb: VRN, CLF, czy w genie kodującym

białko LHP1, powodują zaburzenia w zakwitaniu u Arabidopsis (G

AUDIN I IN

2001;

ENDALL I IN

2001;

IAN I

HEN

2001).

Modyfikacje histonów uczestniczą również w regulacji rozwoju u roślin.

OSTA I

HAW

(2006) badali zależność między modyfikacjami epigenetycznymi,

a powstawaniem różnego typu komórek w epidermie korzenia Arabidopsis.

Wykazali oni, iż ekspresja genu GL2 jest zależna od typu komórek i ma miejsce

w atrichoblastach, komórkach, które nie wytwarzają włośników, natomiast nie

ulega ekspresji w komórkach trichoblastów. Brak ekspresji genu GL2 związany

był z modyfikacjami epigenetycznymi w chromatynie GL2, a dokładnie

z metylacją H3K9 oraz niskim poziomem acetylacji H3 (C

ARO I IN

2007).

Z kolei P

RYMAKOWSKA

-B

OSAK I INNI

(1999) wykazali, że transgeniczne

rośliny tytoniu, u których zawartość wariantów histonów H1: H1A i H1B,

zredukowano do 25%, charakteryzowały się występowaniem znacznie słabiej

skondensowanej chromatyny w chromosomach metafazowych, rośliny te miały

defekty w budowie kwiatów, co skutkowało męską sterylnością.

1.4.4.2. Wpływ czynników stresowych na modyfikacje chromatyny

Potranslacyjne modyfikacje histonów u roślin, regulują ekspresję genów

w odpowiedzi na różne czynniki zewnętrzne, takie jak: atak patogenów, zmiany

temperatury, czy zasolenia oraz fotoperiod (M

ADLUNG I

OMAI

2004;

FLUGER I

AGNER

2007).

Roślinne GCN5 acetylotransferazy są włączane w odpowiedzi na stres

termiczny,

np.

oddziałują

czynnikami

transkrypcyjnymi

(CBF1)

odpowiedzialnym za ekspresję genów odpowiedzi na zimno. Acetylotransferaza

HAC1 jest niezbędna do ekspresji genu odpowiedzi na szok temperaturowy –

HSP17 (B

HARTI I IN

2004). Mutacje w genach kodujących acetylotransferazy

Wstęp

GCN powodują zaburzenia w ekspresji genów WUS i AG, odpowiedzialnych za

prawidłowy rozwój części podziemnej i nadziemnej pędu (mutanty topless)

RIDHA I

2006;

HEN I

IAN

2007).

W odpowiedź na czynniki stresowe u roślin zaangażowane są także

deacetylazy histonów. Obniżenie poziomu ekspresji genów kodujących AtHD1

przez insercję T-DNA, powodują u Arabidopsis defekty rozwojowe, w tym późne

zakwitanie. Ekspresja genów kodujących AtHD1 wzrasta po zranieniu, infekcji

patogenami, lub działaniu egzogennych hormonów roślinnych, jak etylen czy

ABA. Deacetylaza HDA19 i HDA6 jest zaangażowana w odpowiedź na

traktowanie etylenem i kwasem jasmonowym u Arabidopsis (Z

HOU I IN

2005).

Najnowsze wyniki badań Z

HU I INNYCH

(2008) wskazują, iż białko HOS15 jest

zaangażowane w deacetylację histonu H4 w odpowiedzi na zimno u Arabidopsis.

U mutantów hos15 obserwowano podwyższony poziom acetylacji H4, mutanty te

były ponadto bardziej wrażliwe na działanie niskich temperatur, w porównaniu

z roślinami typu dzikiego.

Traktowanie hormonami, zmiany poziomu zasolenia, czy temperatury

powodują zmiany w poziomie acetylacji i fosforylacji poszczególnych histonów.

Zaobserwowano wzrost poziomu fosforylacji H3S10 i acetylacji H3K14 u tytoniu

pod wpływem NaCl, ABA i chłodu. Podobne wyniki uzyskano dla Arabidopsis,

gdzie stwierdzono wzrost acetylacji i fosforylacji histonu H3, jednakże tylko po

działaniu NaCl. Nastomist pod wpływem ABA i temperatury obserwowano

wzrost jedynie poziomu fosforylacji H3. U obu gatunków nastąpiło także

podwyższenie poziomu ekspresji genów odpowiedzi na stres (tytoń - Tsi1, NtC7,

osm; Arabidopsis - DREB2A, RD29A, COR15A) (S

OKOL I IN

2007).

Wernalizacja, czyli indukowanie kwitnienia przez działanie niskich

temperatur, jest również procesem regulowanym epigenetycznie. W procesie tym

główna rolę odgrywa gen FLC (Flowering Locus C), który jest represorem

zakwitania. Represja FLC jest powiązana z kowalencyjnymi modyfikacjami

histonów w chromatynie tego genu. U roślin niewernalizowanych chromatyna

FLC jest w stanie aktywnym, czyli występują w niej modyfikacje histonów,

charakterystyczne dla euchromatyny, takie jak: acetylacja H3K9, H3K14 oraz

metylacja H3K4, natomiast po wernalizacji modyfikacje histonów zmieniają się

na charakterystyczne dla nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny: metylacja

H3K27 i H3K9. Ostatnio zidentyfikowano w aktywnej chromatynie genu FLC,

Wstęp

wariant histonu – H2A.Z, którego obecność jest związana z aktywnością

transkrypcyjną (B

ASTOW I IN

2004;

INNEGAN I IN

2005;

OOD I IN

2006;

CHMITZ I

MASINO

2007).

Temperatura może również wpływać na proces wyciszania przez siRNA

i miRNA. S

ZITTYA I INNI

(2003) prowadzili badania na Nicotiana benthamina

transfekowanym wirusem CYMRSV (Cymbidium ring spot virus) oraz na

N. benthamina transformowanym Agrobacetrium z transgenem 35S - GFP.

Wyciszanie przez siRNA na skutek wprowadzenia wirusa i transformacji okazało

się być zależne od temperatury (15-27°C) i przy niskich temperaturach było

hamowane. Nie stwierdzono takiej zależności dla miRNA u Arabidopsis

(miR157, miR169, miR171), gdzie akumulację miRNA obserwowano we

wszystkich badanych przedziałach temperatury. Z badań tych autorzy

wnioskowali, iż generowanie siRNA i miRNA u roślin jest kontrolowane przez

dwa typy enzymów DICER, jeden - temperaturo-zależny i drugi - niezależny od

temperatury. Natomiast, S

UNKAR I

(2004) stwierdzili, iż traktowanie roślin

Arabidopsis przez 24 h temperaturą 0°C powodowało podwyższenie poziomu

ekspresji dwóch mikro RNA: miR393, miR319. Różnice w akumulacji miRNA

w zależności od zmian temperatury, w tych dwóch eksperymentach mogą

wypływać z zastosowania innych zakresów temperatur.

1.5.

GENETYCZNE I EPIGENETYCZNE MODYFIKACJE

U ROŚLIN ALLOPOLIPLOIDALNYCH

1.5.1.

Powstawanie i rodzaje allopoliploidów

Gatunki poliploidalne to takie, w komórkach których występują więcej niż

dwa haploidalne zespoły chromosomów (M

AŁUSZYŃSKA

2001). Jeżeli genomy

w komórce poliploidalnej pochodzą od więcej niż jednego gatunku ancestralnego,

to mówimy o allopoliploidach, natomiast, jeżeli zawierają więcej niż dwa

identyczne genomy, to wówczas mówimy o autopoliploidach. Analizowany

w pracy Brassica napus to gatunek allotetraploidalny, dla którego znane są

diploidalne gatunki ancestralne. Możemy wyróżnić kilka mechanizmów

powstawania naturalnych gatunków allopoliploidalnych. Jednym z najbardziej

Wstęp

prawdopodobnych

jest

proces

wytwarzania

przez

roślinę

gamet

o niezredukowanej liczbie chromosomów, pochodzących od gatunków

diploidalnych, co daje początek płodnym mieszańcom międzygatunkowym

i prowadzi do powstania nowego gatunku allotetraploidalnego. Przykładem

kolejnego mechanizmu może być zwielokrotnienie liczby chromosomów

w komórkach somatycznych, które stają się następnie komórkami macierzystymi

mikro- lub megaspor (R

AMSEY I

CHEMSKE

1998;

AŁUSZYŃSKA

2001).

U gatunków allopolipolidalnych podczas mejozy chromosomy tworzą

biwalenty między chromosomami homologicznymi jednego genomu, stąd

zachowany jest u nich disomiczny charakter dziedziczenia. Zdarza się jednak, że

u allopoliploidów powstałych w wyniku krzyżowania gatunków blisko

spokrewnionych, ze względu na niewielkie zróżnicowanie w strukturze

chromosomów, podczas mejozy może dochodzić do koniugacji homeologicznej.

U niektórych gatunków znane są mechanizmy hamujące koniugację

chromosomów homeologiczych, dlatego tworzą one prawidłowe biwalenty

mejozie.

Przykładem

wykształcenia

takiego

mechanizmu

jest

alloheksaploidalna pszenica T. aestivum (AABBDD), u której każdy chromosom

może koniugować z chromosomem homologicznym, ale także z dwiema parami

chromosomów homeologicznych. W rzeczywistości jednak, koniugują ze sobą

tylko chromosomy homologiczne, za co odpowiedzialny jest dominujący gen

Ph1, który znajduje się na długim ramieniu chromosomu 5B i nie dopuszcza do

koniugacji chromosomów homeologicznych (S

EARS

1976;

AŁUSZYŃSKA

2001).

Ostatnio zidentyfikowano także podobny gen u B. napus (PrBn) (J

ENCZEWSKI I

2003).

Obecnie szacuje się, że około 80% roślin okrytonasiennych to poliploidy,

a ponad połowa wszystkich naturalnie występujących poliploidów to gatunki

allopoliploidalne (S

OLTIS I

OLTIS

1999). Do tej obszernej grupy należą ważne

rośliny uprawne, takie jak: rzepak, pszenica, bawełna (L

EITCH I

ENNETT

1997;

AŁUSZYŃSKA

2001). Istnieją także przykłady poliploidów powstałych całkiem

niedawno, bo w okresie ostatnich 150 lat (S

OLTIS I IN

2003): Tragopogon mirus,

T. miscellus (S

OLTIS I IN

2004), Spartina anglica, (A

INOUCHE I IN

2004)

i Senecio cambresis (A

BBOTT I

OWE

2004).

Wiele gatunków uważanych za diploidalne ma w swojej historii nawet po

kilka rund poliploidyzacji, dlatego są one współcześnie nazywane

Wstęp

paleopoliploidami (M

A I

USTAFSON

2005). Do tej grupy roślin możemy

zaliczyć: kukurydzę (G

AUT I

OEBLEY

1997), soję (S

HOEMAKER I IN

1996),

Arabidopsis (G

RANT I IN

2000), czy też gatunki z rodzaju Brassica – B. rapa,

B. oleracea oraz B. nigra (L

AGERCRANTZ I

YDIATE

1996).

Bardzo istotną rolę w poznaniu ewolucji genomów, odgrywają badania

prowadzone na resyntetyzowanych (analogiczne do naturalnie występujących)

i syntetycznych (nieposiadających analogów w przyrodzie) (O

SBORN I IN

2003)

gatunkach poliploidalnych, które dostarczają cennej wiedzy o procesach

zachodzących po allopoliploidyzacji oraz ewolucji roślin poliploidalnych

ADLUNG I IN

2002;

UKENS I IN

2006).

Genom

jądrowy gatunków poliploidalnych charakteryzuje się

intensywnymi przemianami na różnych stopniach organizacji DNA. Jego

struktura jest wypadkową wielu procesów, które zachodzą w niedługim czasie, po

procesie poliploidyzacji. W genomach poliploidalnych często obserwowane są

liczne delecje, związane z eliminacją sekwencji, rearanżacje chromosomowe oraz

zmiany wzoru ekspresji wielu genów. Wszystkie wymienione procesy mają

podłoże genetyczne bądź epigenetyczne, a często są wypadkową tych dwóch

procesów. Genomy poliploidalne w trakcie ewolucji podlegają procesom

diploidyzacji. Wszystkie opisane zmiany prowadzą do znacznego zróżnicowania

genomów ancestralnych u gatunków poliploidalnych, a w efekcie ich wtórną

diploidyzację (M

A I

USTAFSON

2005), która jest gwarancją zachowania

dziedziczenia o charakterze disomicznym.

1.5.2.

Genetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych

Genomy poliploidalne charakteryzują się dynamicznymi zmianami

w organizacji sekwencji DNA, a także zmianami w poziomie ekspresji licznych

genów. Modyfikacje te są odpowiedzią na tzw. „szok genomowy”(M

LINTOCK

1984), który ma miejsce po procesie poliploidyzacji.

ONG I INNI

(1995), jako

pierwsi pokazali, iż rzeczywiście zmiany takie zachodzą u roślin poliploidalnych.

Badania na resyntetyzowanych B. napus potwierdziły liczne rearanżacje

w genomie allotetraploida, które były związane z utratą, bądź pojawieniem się

nowych fragmentów RFLP. Zmiany te najprawdopodobniej powodowane były

niewzajemną transpozycją pomiędzy chromosomami homeologicznymi.

Wstęp

Najwięcej zmian w genomie B. napus wykryto w pokoleniu F5 i miały one

charakter przypadkowy. W przeciwieństwie do B. napus u allotetraploidalnej

pszenicy obserwowano najczęściej utratę sekwencji już w pierwszym pokoleniu.

Eliminowane były sekwencje chromosomowo lub genomowo specyficzne.

Eliminacja ta była nieprzypadkowa i miała charakter konserwatywny

u naturalnych alloheksaploidów oraz resyntetyzowanych allotetraploidów, jak

również diploidalnych gatunków ancestralnych pszenicy (F

ELDMAN I IN

1997).

ZKAN

INNI

(2001)

badali

eliminację

sekwencji

genomowo

i chromosomowo specyficznych u poliploidów pszenicy. Okazało się, że

eliminacja sekwencji chromosomowo specyficznych zachodzi już w pokoleniu F1

u allopoliploidów. Zauważono także, iż eliminacja sekwencji zaczyna się

wcześniej u resyntetyzowanych gatunków allopoliploidalnych w porównaniu do

gatunków syntetycznych. Proces eliminacji sekwencji obserwowany był także

u allopoliploidów pszenżyta, którego genomy ancestralne charakteryzują się

mniejszym stopniem pokrewieństwa niż ma to miejsce u poliploidalnych

gatunków pszenicy. M

A I

USTAFSON

(2006) stwierdzili, iż ponad 40%

fragmentów AFLP pochodzących z genomu pszenicy i ponad 70% z genomu żyta

ulega eliminacji u pszenżyta.

U resyntetyzowanych gatunków allopoliploidalnych dochodzi do częstych

zmian we wzorze ekspresji genów. Przykładem mogą być badania prowadzone

u pszenicy (K

ASHKUSH I IN

2002). Autorzy w pracy tej analizowali fragmenty

cDNA-AFLP, stwierdzono iż 48 transkryptów zostało wyciszonych, a 12 uległo

aktywacji u allotetraploidalnej pszenicy. Wśród aktywowanych genów większość

stanowiły retroelementy. Zmiany w ekspresji genów analizowano także

u allotetraploidalnej bawełny (A

DAMS I IN

2004). Badania te wykazały, że 5%

genów zduplikowanych u bawełny (genom AG) ulega wyciszeniu. Dodatkowo

wyciszenie kopii genów pochodzących z jednego genomu rodzicielskiego było

tkankowo-specyficzne.

poliploidów

tych

obserwowano

proces

nonfunkcjionalizacji wśród genów zduplikowanych. Przykład może stanowić

wyciszenie matecznej kopii genu Em2025, we wszystkich analizowanych

organach z wyjątkiem liści i zalążków. U bawełny (genom AD) stwierdzono także

subfunkcjonalizację genów, gdzie jeden homeolog ulegał wyciszeniu w innych

organach niż druga kopia tego samego genu. Taki schemat wyciszania był

Wstęp

charakterystyczny dla wielu genów u analizowanej pszenicy, np.: adhD, A1520

DAMS I IN

2003).

Nie wszystkie, omówione wyżej zmiany genetyczne, zachodzą

u stosunkowo młodych gatunków poliploidalnych. Przykład może stanowić

Spartina anglica (B

AUMEL I IN

2001) gatunek, u którego nie wykazano

znaczących zmian genetycznych po procesie allopoliploidyzacji. Genomy

ancestralne charakteryzowały się wysokim stopniem konserwatywności

w genomie tego poliploida. Inaczej było w przypadku allotetraploidalnego

gatunku Tragopogon miscellus, którego powstanie datowane jest na około 80 lat

temu. W genomie tym stwierdzono eliminację fragmentów cDNA-AFLP

pochodzących od obu gatunków ancestralnych (T

ATE I IN

2006).

1.5.3.

Epigenetyczne modyfikacje w genomach allopoliploidalnych

Badania prowadzone w przeciągu ostatnich lat, wskazują na coraz większą

rolę modyfikacji epigenetycznych w procesie stabilizacji, jak również ewolucji

roślin allopoliploidalnych (F

INNEGAN

2002). U wielu resyntetyzowanych

allopoliploidów obserwowano zmiany w poziomie metylacji DNA, które miały

miejsce bardzo często już w pierwszych pokoleniach po procesie

allopoliploidyzacji. S

ONG I INNI

(1995) wykorzystując analizę typu Southern

wskazali na zachodzące w sposób przypadkowy zmiany w poziomie metylacji

(zrówno hypermetylację jak i hypometylację) w sekwencjach CpG i CpNpG

u resyntetyzowanych B. napus. W badaniach tych zastosowano parę enzymów

metylowrażliwych MspI i HpaII. Autorzy zaobserwowali zmiany w metylacji

DNA dla dwóch loci RFLP w pokoleniu F5, jednakże jako główny czynnik

wpływający na rearanżacje genomu u analizowanych alloteraploidów, wskazano

zmiany związane z utratą lub pojawieniem się nowych fragmentów RFLP.

Podobne badania przeprowadzono u resyntetyzowanych allotetraploidów

Arabidopsis (M

ADLUNG I IN

2002). Stosując technikę MSAP wykazano, iż

spośród 8,3% polimorficznych loci pod względem metylacji DNA, aż 62,5%

z nich było demetylowanych, a 37,5% charakteryzowało się podwyższonym

poziomem metylacji. C

OMAI I INNI

(2000)

wskazali, że głównym czynnikiem

wpływającym na zmiany w ekspresji genów u resynetyzowanych allopoliploidów

są zmiany w poziomie metylacji DNA. Z badań prowadzonych na

Wstęp

allotetraploidalnych Arabidopsis wynika, że ekspresja 1% genów kodujących

różnego rodzaju białka ulega zmianom w pokoleniu F2 u resyntetyzowanych

allotetraploidów. Analiza RT-PCR potwierdziła wyciszenie trzech genów.

Stosując natomiast cDNA-AFLP stwierdzono, że 20 z 700 analizowanych genów

podlegało supresji u poliploidów, w porównaniu z gatunkami rodzicielskimi.

Natomiast wyciszenie trzech analizowanych genów (K7, K9, L6) u Arabidopsis

suecica było związane z metylacją DNA w tych loci. Wykazane zmiany

w ekspresji genów u allopoliploidalnych Arabidopsis były związane ze zmianami

w morfologii, czasie zakwitania oraz płodności analizowanych roślin (C

OMAI I IN

2000). Podobne badania na resyntetyzowanych A. suecica przeprowadzili

EE I

HEN

(2001).

Stwierdzli oni, iż spośród 110 loci AFLP-cDNA, 2,5% genów

uległa wyciszeniu u allopoliploidów. Badano między innymi aktywność dwóch

genów: RFP i TCP3. Okazało się, że są one wyciszone u A. suecica i jest to

związane z metylacją DNA w obrębie promotorów tych genów.

IU I INNI

(1998

) analizowali zmiany w poziomie metylacji

u resyntetyzowanych i naturalnych allopoliploidów Aegilops-Triticum. Zmiany te

nie były przypadkowe i dotyczyły tych samych loci u różnych osobników, np.:

locus pWST. Autorzy porównali wzór metylacji w locus genu pWST dla

resyntetyzowanych poliploidów pszenicy z wzorem metylacji u naturalnej

alloheksaploidalnej T. aestivum. Wyniki potwierdziły konserwatywny charakter

wzoru metylacji w przypadku obu analizowanych poliploidów pszenicy.

Może to wskazywać na istnienie ”zaprogramowanych” zmian

epigenetycznych, które prowadzą do genetycznej diploidyzacji genomów

i wpływają na proces ewolucji roślin allopoliploidalnych (L

IU I

ENDEL

2003).

Zmiany w poziomie metylacji DNA u poliploidów mogą preferencyjnie dotyczyć

loci pochodzących od jednego z genomów rodzicielskich, jak ma to miejsce

u resyntetyzowanej allotetraploidalnej pszenicy (S

HAKED I IN

2001).

ASKUSH I INNI

(2002) prowadząc badania na resyntetyzowanej,

allotetraploidalnej pszenicy stwierdzili, iż zmianom genetycznym związanym

z utratą sekwencji, towarzyszą także zmiany epigenetyczne, związane

z wyciszaniem sekwencji DNA. Stosując analizę typu Southern wykazano, iż

wśród analizowanych sekwencji cDNA, osiem z nich nie charakteryzowało się

żadnymi zmianami genetycznymi, a w przypadku czterech genów (RAIF3,

RAIF30, RAIF34, RAIF40) stwierdzono metylację ”de novo”.

Wstęp

W przeciwieństwie do opisanych wyżej gatunków poliploidlanych

u syntetycznej alloheksaploidalnej bawełny, nie stwierdzono zmian w poziomie

metylacji DNA, co może wskazywać na inny rodzaj modyfikacji, możliwe, że

także epigenetycznych, które mają miejsce po procesie allopoliploidyzacji

u bawełny (L

IU I IN

2001).

Dominacja jąderkowa to kolejny przykład epigenetycznie kontrolowanego

procesu, który powszechnie występuje u allopoliploidów. C

HEN I

IKAARD

(1997

) badali ekspresję genów rRNA u B. napus. Okazało się, że u tego

alloteraploida wykrywano jedynie transkrypty rRNA pochodzące od jednego

gatunku ancestralnego – B. rapa. Po zastosowaniu inhibitora metylotransferazy –

aza-dC, stwierdzono, iż redukcja w metylacji cytozyny prowadzi do aktywacji

genów rRNA pochodzących od B. oleracea, podobny efekt otrzymano stosując

inhibitor deacetylazy histonów. Z kolei

RIEMAN I INNI

(1999), prowadząc badania

u B. napus, dowiedli, iż wiązanie czynnika transkrypcyjnego – Pol I do promotora

genów rRNA B. oleracea, nie jest związane bezpośrednio z metylacją cytozyny,

a na brak ekspresji tych genów mogą mieć wpływ białka wiążące się

z hypermetylowanym DNA, które działają jako represory transkrypcji. C

HEN I

INNI

(1998)

analizowali wyciszenie genów rRNA u alloteraploidalnych

A. suecica. Stwierdzono, iż u tego gatunku wyciszeniu podlegają geny rRNA

pochodzące od A. thaliana i jest to związane z metylacją DNA.

Dominacja jąderkowa jest procesem odwracalnym, a ekspresja wcześniej

wyciszonych genów rRNA może zależeć od procesów rozwojowych. Dowodów

na to stwierdzenie dostarczyły badania C

HEN I

IKAARD

(1997

). Geny rRNA

wyciszone w tkankach wegetatywnych, ulegały ekspresji we wszystkich organach

kwiatu, w tym także w płatkach i działkach kielicha, co dodatkowo wskazywało

na to, że mejoza nie jest konieczna, aby reaktywować wyciszone geny rRNA.

Stwierdzenie, iż dominacja jąderkowa może być tkankowo - specyficzna, znalazło

potwierdzenie w badaniach H

ASTEROKA I

ALUSZYNSKIEJ

(2000). Liczba

aktywnych loci rDNA u gatunków allotetraploidalnych Brassica była równa

sumie tych loci z odpowiednich gatunków ancestralnych, co świadczyło o braku

zjawiska dominacji jąderkowej, w analizowanej tkance merystematycznej

korzenia gatunków allotetraploidalnych.

Proces

epigenetycznych

modyfikacji

DNA

jest

odwracalny

w przeciwieństwie do utraty (delecji) określonych sekwencji i zachodzi zwykle

Wstęp

zaraz po procesie allopoliploidyzacji, o czym świadczą liczne zmiany w ekspresji

genów już w pierwszym pokoleniu u resyntetyzowanych poliploidów (K

ASHKUSH

I IN

2002). Wzór metylacji DNA w przeważającej liczbie sekwencji jest

zachowywany w następnych pokoleniach, czego dowodem są badania

prowadzone na resytetyzowanych gatunkach allopoliploidlnych (G

AETA I IN

2007). W przeciwieństwie do zmian epigenetycznych, genetyczne modyfikacje

w sekwencji DNA u gatunków allopoliploidalnych zachodzą z większą

częstotliwością w dalszych pokoleniach (S

ONG I INNI

1995, G

AETA I IN

2007). To

właśnie epigenetyczne modyfikacje mogą prowadzić w konsekwencji do zmian

genetycznych i powodować np.: utratę określonych loci. Utrata sekwencji bardzo

często spowodowana jest niewzajemną homeologiczną transpozycją między

chromosomami pochodzącymi z genomów ancestralnych. Prawdopodobnie sam

proces eliminacji sekwencji może być także sterowany epigenetycznie, o czym

świadczą ostatnie badania prowadzone u Tetrahymena. Dowodzą one, iż

eliminacja sekwencji jest nieprzypadkowa i kierowana epigenetycznie poprzez

metylację lizyny dziewiątej histonu H3 oraz poprzez małe interferencyjne RNA –

scnRNAs, których wzmożoną akumulację wykryto w eliminowanych

sekwencjach u tego gatunku (T

AVERNA I IN

2002).

1.5.4.

Rearanżacje chromosomowe w genomach poliploidalnych

Do analizy rearanżacji chromosomowych, które zachodzą po procesie

poliploidyzacji,

najczęściej wykorzystuje się techniki fluorescencyjnej

i genomowej hybrydyzacji in situ (FISH, GISH). B

ELYAYEV I INNI

(2000) stosując

GISH u allotetrapliodalnej pszenicy (genom AB) wskazali na wystąpienie

przemian międzygenomowych, objawiających się znacznym wzbogaceniem

genomu A w sekwencje powtarzalne pochodzące z drugiego genomu

ancestralnego.

Podobne wyniki otrzymano dla allotetraploidalnej bawełny (Z

HAO I IN

1998). Analiza FISH wykazała, że część sekwencji powtarzalnego DNA (np.:

pXP224, pXP137) charakterystyczna dla genomu A, rozprzestrzeniła się

w chromosomach pochodzących z genomu D. Z kolei zastosowanie GISH,

pozwoliło uwidocznić przemiany chromosomowe zachodzące u Poa jemtlandica.

U gatunku tego wykazano, że 3 pary chromosomów homeologicznych

Wstęp

charakteryzują się międzygenomowymi translokacjami (B

RYSTING I IN

2000).

Translokacje międzygenomowe wykryto także u alloheksaploidlanego gatunku

owsa – Avena fatua, u którego obserwowano osiem par chromosomów

z translokacjami między genomami A, D i C

ANG I IN

1999). Natomiast

RIGOYEN I INNI

(2002) stosując FISH z sekwencjami powtarzalnymi wykazali

translokacje

między poszczególnymi trzema genomami ancestralnymi,

obserwowane w dziesięciu parach chromosomów u Avena sativa. L

IM I INNI

(2004) badali reranżacje genomowe u naturalnych i resyntetyzowanych

allotetraploidów Nicotiana tabacum. Okazało się, że poliploidy naturalne

charakteryzują się licznymi translokacjami międzygenomowymi. Podobne wyniki

dla tytoniu otrzymali L

EITCH I INNI

(2006).

Rearanżacje chromosomowe po procesie allopoliploidyzacji potwierdzono,

wykorzystując technikę FISH u pszenicy. We wszystkich analizowanych

poliploidach pszenicy obserwowano eliminację sekwencji pGc1R-1 (H

AN I IN

2005). S

ALINA I INNI

(2006) prowadzili badania na poliploidalnej pszenicy,

wykorzystując FISH z dwiema powtarzalnymi sekwencjami - Spelt1 i Spelt52.

Wyniki tych badań pokazują różną liczbę loci tych sekwencji u różnych

ancestorów i gatunków poliploidlanych pszenicy, co związane jest z amplifikacją

tych sekwencji podczas ewolucji, prowadzącej do powstania gatunku

alloheksaploidalnego.

Cel pracy

EL PRACY

Gatunki z rodzaju Brassica, należące do tzw. trójkąta U, stanowią bardzo

ważną ze względów gospodarczych grupę roślin. Duża różnorodność

morfologiczna oraz znajomość pokrewieństwa między tymi gatunkami sprawiają,

że są one interesującym materiałem do analiz genetycznych, cytogenetycznych

oraz ewolucyjnych.

W niniejszej pracy obiektem badań były dwa diploidalne gatunki: Brassica

oleracea (2n=2x=18, genom C) i Brassica rapa (2n=2x=20, genom A) oraz

gatunek allotetraploidalny Brassica napus (2n=4x=38, genom AC), który powstał

w wyniku krzyżownia wymienionych diploidów. Analizie cytogenetycznej

poddano dwie formy gatunków Brassica, uprawną i krótkiego cyklu – RC. Ta

ostatnia jest często wykorzystywana w badaniach genetycznych i molekularnych,

a ostatnio również cytogenetycznych. Zaistniała potrzeba porównawczej analizy

genomów tych form oraz sprwadzenie czy istnieje jakaś korelacja między krótkim

cyklem życiowym form RC i zmianami epigenetycznymi.

Cytogenetyka molekularna dostarcza cennych informacji na temat losu

chromosomów podczas mitozy, ale nadal niewiele wiadomo o losach

chromosomowego DNA w jądrze komórkowym, a przede wszystkim o jego

modyfikacjach epigenetycznych. Z tego względu większość badań, w niniejszej

pracy, prowadzona była na jądrach interfazowych w mikroskopie konfokalnym

i cytometrze obrazowym. Analizę modyfikacji chromatyny prowadzono

z wykorzystaniem technik immunobarwień z przeciwciałami skierowanymi,

przeciwko metylowanym i acetylowanym histonom oraz metylowanemu DNA.

W pracy stosowano także fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z rDNA

i sekwencjami centromerowymi, jako sondami oraz technikę MSAP z enzymami

metylowrażliwymi.

Celem pracy było porównanie modyfikacji chromatyny u ancestralnych

gatunków diploidalnych i gatunku allotetraploidalnego oraz charakterystyka

Materiał i metody

ATERIAŁ I METODY

3.1.

ATERIAŁ ROŚLINNY

Materiał roślinny do badań stanowiły formy uprawne trzech gatunków

z rodzaju Brassica: diploidalne Brassica rapa (L.) (syn. B. campestris)

(2n=2x=20, genom A) i Brassica oleracea (L.) (2n=2x=18, genom C) oraz

allotetraploidalny B. napus (L.) (2n=4x=38, genom AC). W badaniach

wykorzystano także formy krótkiego cyklu (Rapid Cycling - RC), wymienionych

wyżej gatunków Brassica. Szczegółowe dane dotyczące pochodzenia materiału

roślinnego przedstawiono w Tab. 2.

Tab. 2 Źródło pochodzenia badanych gatunków Brassica

Gatunek/forma

Odmiana/

nazwa hodowlana

Źródło

B. oleracea – kapusta
głowiasta

var. capitata
„Amager”

PNOS,
Ożarów Mazowiecki, Polska

B. rapa (syn. campestris)
– rzepa jadalna

var. rapa
„Goldball”

PNOS,
Ożarów Mazowiecki, Polska

B. napus - rzepak

var. annua/ biennis
”Kana”

ZDHiAR,
Małyszyn Polska

B. oleracea RC

3-1

020197

Crucifer Genetics Cooperative

Madison USA

B. rapa RC

1-1

102780

Crucifer Genetics Cooperative

Madison USA

B. napus RC

5-1

020197

Crucifer Genetics Cooperative

Madison USA

Materiał i metody

Hodowla roślin była prowadzona w szklarnii Katedry Anatomii i Cytologii

Roślin. Nasiona form uprawnych oraz RC wysiewano do doniczek wypełnionych

ziemią wymieszaną z wermikulitem w stosunku 4:1. Hodowlę prowadzono

w stałych warunkach temperatury: 19 ± 1°C i oświetlenia: 14h dnia i 10h nocy

(światło białe, jarzeniowe, neutralne, 10000 lux), przy wilgotności ≈50%. Po 7-10

dniach od wysiania nasion zbierano pierwsze liście osobno z każdej rośliny,

następnie umieszczano w silica żelu (Sigma), w celu wysuszenia tkanki. Materiał

ten wykorzystywano następnie do izolacji DNA. Rośliny form RC, przeznaczone

do badań mejozy, pozostawiano w szklarni do momentu zakwitania, tj. 4-6

tygodni i następnie zbierano pączki szczytowe. W celu uzyskania kolejnych

pokoleń Brassica RC rośliny pozostawiano w szklarni do czasu zawiązania nasion

(6-10 tygodni).

Do badań cytogenetycznych nasiona były wysiewane na szalki Petriego,

które wyłożono trzema warstwami bibuły filtracyjnej zwilżonej wodą kranową.

Nasiona pozostawiano w warunkach pełnego zaciemnienia w temperaturze ok.

20°C do momentu skiełkowania (3-4 dni), następnie siewki traktowano

i utrwalano według metody opisanej poniżej.

3.2.

RAKTOWANIE I UTRWALANIE MATERIAŁU

Siewki posiadające korzenie o długości 1,5 – 2 centymetrów, traktowano

0,002 M roztworem 8-hydroksychinoliny przez 4 godziny, na wytrząsarce

w ciemności. Traktowanie prowadzono w celu nagromadzenia komórek

w stadium metafazy. Następnie, materiał utrwalano przez 2 godziny w temp.

pokojowej w mieszaninie kwasu octowego i alkoholu metylowego - AA

(w stosunku 1:3), lub w roztworze 4% formaldehydu w 1×PBS przez 40 min.

w temperaturze pokojowej. Jeżeli jako utrwalacz stosowano formaldehyd,

materiał po jego usunięciu przenoszono natychmiast do roztworu 1×PBS

i przechowywano w temp. 4°C. Do analizy wzoru modyfikacji histonów materiał

utrwalano w formaldehydzie, natomiast do badań nad wzorem metylacji DNA,

oraz do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, siewki utrwalano w AA.

Materiał i metody

3.3.

YKONYWANIE PREPARATÓW

3.3.1.

Przygotowanie preparatów do immunobarwień – modyfikacje
histonów

Materiał przeznaczony do immunobarwień utrwalano w roztworze 4%

formaldehydu. Preparaty wykonywano z merystemów wierzchołkowych korzeni.

W tym celu materiał płukano w roztworze 1×PBS przez 5 - 10 minut, następnie

korzenie przenoszono do mieszaniny maceracyjnej (w 1×PBS), która zawierała

2.5% pektynazę (Sigma), 2.5% celulazę „Onozuka R-10‟ (Serva) i 2.5%

pektoliazę (Sigma). Macerację prowadzono w temperaturze 37°C przez 35 - 40

min. Następnie usuwano enzym i płukano materiał w buforze 1×PBS. Preparaty

wykonywano z jednego merystemu, umieszczając go w kropli 1×PBS na szkiełku

podstawowym. Po usunięciu czapeczki merystem rozdrabniano igłami

preparacyjnymi i nakładano szkiełko nakrywkowe. Po delikatnym przygnieceniu

preparaty zamrażano, a następnie usuwano szkiełka nakrywkowe. Tak

przygotowane preparaty natychmiast przenoszono do schłodzonego roztworu

1×PBS. W celu dłuższego przechowywania preparatów, umieszczano je

w bezwodnej glicerynie (POCH) i przechowywano w lodówce w temperaturze

4°C.

3.3.2.

Przygotowanie preparatów do FISH i immunobarwień - metylacja
DNA

Materiał wykorzystywany do FISH i badań wzoru metylacji DNA

utrwalano w AA. Preparaty wykonywano według zmodyfikowanej metody

podanej przez M

ALUSZYNSKA I

ELSOP

-H

ARRISON

(1991). Przeznaczone do

badania merystemy wierzchołkowe korzeni, w celu usunięcia utrwalacza, płukano

w dwóch zmianach buforu cytrynianowego. Następnie, materiał macerowano

w mieszaninie enzymów: 20% pektynaza (Sigma) i 2% celulaza „Onozuka R-10

(Serva), w temperaturze 37°C przez 1,5 – 2 h. Po maceracji merystemy płukano

w buforze cytrynianowym przez 20 min. W celu wykonania preparatu

przenoszono jeden merystem do szkiełka maceracyjnego, zawierającego 45%

Materiał i metody

kwas octowy, po czym odcinano czapeczkę. Wypreparowany merystem z kroplą

kwasu octowego umieszczano na szkiełku podstawowym, nakładano szkiełko

nakrywkowe i zgniatano. Po zamrożeniu usuwano szkiełko nakrywkowe,

preparaty suszono, a następnie przechowywano w temp. 4°C.

Preparaty mejotyczne wykonywano z utrwalonych w AA pączków

kwiatowych, które macerowano w mieszaninie enzymów: 1% pektynaza (w/w),

1% celulaza (w/w) i 1% cytohelikaza (Sigma). Do badań pobierano komórki

mejotyczne pochodzące z pylników. Procedurę przygotowania preparatów

prowadzono tak jak opisano powyżej.

3.4.

MMUNOBARWIENIA

3.4.1.

Analiza wzoru modyfikacji histonów i metylacji DNA

Do badań wzoru metylacji i acetylacji histonów stosowano przeciwciała

dostępne ze źródeł komercyjnych (Upstate, Invitrogen), natomiast do badań

wzoru metylacji DNA wykorzystano przeciwciała I-rzędowe przeciwko 5-

metylocytozynie, otrzymane przez P

ODESTA I IN

. (1993). Wśród stosowanych

przeciwciał były: królicze (rabbit) lub mysie (mouse) przeciwciała

pierwszorzędowe oraz kozie przeciwciała drugorzędowe (goat-anti-rabbit, goat-

anti-mouse), skoniugowane z fluorochromem – Alexa

488

. Szczegółowe dane

dotyczące stosowanych przeciwciał zestawiono w Tab. 3.

Tab. 3 Przeciwciała stosowane w immunobarwieniach

Nazwa/Rozcieńczenie

Skrót

Numer katalogowy/
Źródło

Przeciwciała pierwszorzędowe

Anti-dimetyl-histone H3 (Lys4)

Rabbit polyclonal IgG

1:300 w 1% BSA w 1×PBS

H3K4me2

07-030

Upstate

Anti-dimetyl-histone H3 (Lys9)

Rabbit monoclonal IgG
1:100 w 1% BSA w 1×PBS

H3K9me2

05-768, 07-212

Upstate

Materiał i metody

Nazwa/Rozcieńczenie

Skrót

Numer katalogowy/
Źródło

Anti-trimetyl-histone H3 (Lys9)

Rabbit polyclonal IgG
1:50 w 1% BSA w 1×PBS

H3K9me3

07-442

Upstate

Anti-acetyl-histone H4 (Lys5)

Rabbit monoclonal IgG
1:200 w 1% BSA w 1×PBS

H4K5ac

04-118

Upstate

Anti-acetyl-histone H3 (Lys18)

Rabbit polyclonal IgG

1:200 w 1% BSA w 1×PBS

H3K18ac

07-354

Upstate

Anti-acetyl-histone H4 (Lys16)

Rabbit polyclonal IgG
1:200 w 1% BSA w 1×PBS

H4K16ac

06-762

Upstate

Anti-metyl-cytosine

Mouse monoclonal IgG
1:300 w 1% BSA w 1×PBS

5‟mC

Podesta i in. (1993)

Przeciwciała drugorzędowe

Goat anti-rabbit Alexa

488

IgG (H+L)

1:100-1:300 w 1% BSA w 1×PBS

A-11008

Invitrogen

Goat-anti mouse Alexa

488

IgG (H+L)
1:300 w 1% BSA w 1×PBS

A-11001

Invitrogen

Immunobarwienia z zastosowaniem wyżej wymienionych przeciwciał

przeprowadzano według zmodyfikowanej metody opisanej przez J

ASENCAKOVA I

INNI

(2000;

2001). Na przygotowane preparaty nakrapiano roztwór 5% BSA

(Bovine Albumin Serum, Sigma) w 1×PBS i inkubowano w temperaturze

pokojowej przez godzinę. Następnie na preparat nakrapiano 40 µl przeciwciała

pierwszorzędowego w odpowiednim rozcieńczeniu (Tab. 3) i pozostawiano na

noc w 4°C. Następnego dnia przeprowadzano płukania w trzech zmianach 1×PBS,

nakrapiano 40 µl przeciwciała drugorzędowego w odpowiednim rozcieńczeniu

(Tab. 3) i inkubowano 1 h w temp. 37°C. Po trzykrotnym płukaniu w 1×PBS

preparaty zamykano „na mokro” w buforze Vectashield (Vector Labolatories)

z DAPI w stężeniu 4 µl/ml.

Materiał i metody

W celu detekcji metylacji cytozyny, preparaty przed nakropieniem BSA

denaturowano w 70% formamidzie w 2×SSC przez 2 minuty w temperaturze

65°C, a następnie odwadniano w szeregu alkoholowym (70 i 99%). Na wysuszone

preparaty nakrapiano blok BSA i w dalszej części procedury postępowano jak

opisano powyżej.

3.5.

LUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU

(FISH)

Procedurę FISH przeprowadzano według protokołu opracowanego przez

CHWARZACHER I

ESLOP

-H

ARRISON

(2000), a następnie zmodyfikowanego przez

ASTEROK I INNI

(2001). Do badań wykorzystywano preparaty wykonane metodą

maceracji enzymatycznej.

Pochodzenie sond do FISH (jako sondy stosowano następujące sekwencje DNA):

 5S rDNA – sekwencja pTa794 o długości 410 pz wyizolowana

z Triticum aestivum (G

ERLACH I

YER

1980),

 25S rDNA - odcinek kodujący geny 25S rRNA o długości 2,3 kpz,

otrzymany w wyniku trawienia fragmentu 18S-5,8S-26S rDNA

Arabidopsis thaliana (U

NFRIED

RUENDLER

1990) enzymem

restrykcyjnym ClaI,

 CentBr1 i CentBr2 – sekwencje centromerowe o długości 176 pz,

wyizolowane z B. rapa (L

IM I IN

2005), wklonowane w wektory

pBluscript. Otrzymane z Department of Horticulture, Chungnam National

University, Daejeon, Korea.

3.5.1.

Znakowanie DNA metodą PCR

Metodą PCR znakowano sondy 5S rDNA oraz CentBr1 i CentBr2. W celu

wyznakowania sond stosowano następującą mieszaninę reakcyjną: 10×bufor dla

polimerazy (Taq Polymerase Buffer, Promega); 0,1 mM nukleotydy - dNTP

(Promega);

0,04

znakowane

nukleotydy

(rodamina-5-dUTP

lub

digoksygenina-11-dUTP); 0,4 µM startery pUC M13 (5`-CAG GGT TTT CCC

AGT CAC GA-3`) (5`-CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG A-3`); 2 jednostki

Materiał i metody

polimerazy Taq (Promega) oraz matrycowe DNA. Reakcję amplifikacji

prowadzono w termocyklerze (PCR-Gene Amp PCR System 9700), według

programu: 94°C przez 1 min., następnie 35 cykli: 94°C × 40 sek., 55°C × 40 sek.,

72°C × 1,5 min., następnie 72°C przez 5 minut.

Wyznakowaną sondę następnie precypitowano, dodając 3 M CH

COONa

w ilości 1/10 objętości końcowej mieszaniny oraz 99% alkohol etylowy zmrożony

do -20°C w objętości 2,5 razy całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej. Sondę

pozostawiano w temp. -20°C na noc, następnego dnia wirowano przez 30 min.

w temp. 4°C, przy 14000 rpm (wirówka mikro 22R, Hettich). Zlewano

supernatant, a pelet przemywano 70% etanolem (-20°C). Osad suszono

w urządzeniu Speed Vac (Savant) przez 5 – 10 min., następnie rozpuszczano w 10

mM TE i przechowywano w temperaturze -20°C.

3.5.2.

Znakowanie DNA metodą nick-translacji

Metodą nick-translacji znakowano sondę 25S rDNA. Do znakowania

wykorzystano „Nick Translation Kit” (Roche). Skład mieszaniny reakcyjnej

stanowiły: dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP oraz znakowane digoksygenina-

11-dUTP lub rodamina-5-dUTP), 1,5-2 µg/µl DNA matrycowego, bufor

reakcyjny i mieszanina enzymów (DNA polimeraza I z E. coli i DNaza I z trzustki

ssaków). Reakcję amplifikacji prowadzono w termocyklerze, w temperaturze

15°C przez 95 minut, następnie inaktywowano enzymy w temperaturze 60°C

przez 12 - 16 minut. Po zakończeniu znakowania przeprowadzano precypitację

sondy.

3.5.3.

Procedura FISH

Na preparaty nakrapiano 150 µl RNaz‟y o koncentracji 100 µl/ml

i inkubowano w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37°C.

Następnie preparaty płukano dwukrotnie po 5 min. w 2×SSC. Kolejno

przenoszono do 1% formaldehydu w 1×PBS na 10 minut w temperaturze

pokojowej. Po płukaniu w 2×SSC (2 razy po 5 min.) preparaty odwadniano

w szeregu alkoholowym (70%, 90%, 99%) i

suszono. Następnie,

Materiał i metody

przygotowywano mieszaninę hybrydyzacyjną, której skład przedstawiono poniżej

(Tab. 4).

Tab. 4 Skład mieszaniny hybrydyzacyjnej

Składniki

Stężenie końcowe

100% formamid

50%

50% DS (siarczan dekstranu)

10%

20 x SSC

2 x SSC

10% SDS (dodecylosiarczan sodu)

0,25%

SSS DNA (blokujące DNA)

10 µg

Sonda

100 – 120 ng

Sterylna woda destylowana

do 40 µl

Mieszaninę hybrydyzacyjną denaturowano w temperaturze 75°C przez 10

min. Zdenaturowaną sondę umieszczano na lodzie w celu stabilizacji

jednoniciowej struktury DNA. Następnie nakrapiano na preparaty 38 µl

mieszaniny hybrydyzacyjnej, nakrywano termostabilną folią. Preparaty

umieszczano w temocyklerze (Omnislide Thermal Cycler) i przeprowadzano

denaturację w temperaturze 70°C przez 5 min. Po zakończonej denaturacji

preparaty przenoszono do wilgotnej komory i pozostawiano w temperaturze 37°C

przez 16 - 18 godzin.

3.5.4.

Płukania pohybrydyzacyjne

Dla sond CentBr stosowano siłę płukań wynoszącą 79% lub 85%,

natomiast dla sond 25S i 5S rDNA – 79%. Siłę tę uzyskiwano inkubując preparaty

w temperaturze 42°C w roztworze odpowiednio 10% lub 20% dejonizowanego

formamidu w 0,1×SSC, odpowiednio dla siły płukań 79% i 85%. Płukania

powtarzano dwukrotnie po 4 minuty. Następnie preparaty płukano w 2×SSC (2

razy w temp. 42°C oraz 2 razy w temp. pokojowej, każdorazowo po 3 min).

W przypadku stosowania sond znakowanych wyłącznie rodaminą, preparaty

odwadniano w szeregu alkoholowym (70%, 90%, 99%), następnie suszono

i zamykano w buforze Vectashield z DAPI.

Materiał i metody

3.5.5.

Detekcja i amplifikacja sygnałów

Sondy znakowane digoksygeniną, wykrywano z wykorzystaniem

przeciwciał pierwszorzędowych skoniugowanych z izotiocyjanianem fluoresceiny

– FITC (anty-dig-fluoresceine, Roche). W tym celu preparaty płukano w 4×SSC

z 0,2% Tween 20 przez 5 min. w temp. pokojowej. Następnie na preparaty

nakrapiano blok w postaci 5% odtłuszczonego mleka i inkubowano przez 30 min.

w temp. pokojowej. Następnie, na preparaty nakrapiano 40 µl I-rzędowego

przeciwciała, w rozcieńczeniu 1:11 w mleku (w/w) i inkubowano w temp. 37°C

przez godzinę. Kolejno przeprowadzano trzykrotne płukania w 4×SSC z 0,2%

Tween 20 w temp. 37°C. Odwadniano preparaty w szeregu alkoholowym,

suszono i zamykano w buforze Vectashield z DAPI.

3.6.

ZOLACJA CAŁKOWITEGO GENOMOWEGO

DNA

METODĄ

„

MIKRO

-CTAB”

Liście do izolacji DNA zbierano z 7 dniowych roślin. Zbierano zawsze

pierwsze pojawiające się liście, będące w porównywalnej dla analizowanych

gatunków wielkości. Liście suszono w woreczkach strunowych, wypełnionych

substancją o właściwościach higroskopijnych - silica gel (Sigma), przez co

najmniej tydzień. Dobrze wysuszone kawałki liści (ok. 0,03g) umieszczano

w probówkach typu eppendorf (2,2 ml), do których wsypywano po 5 - 6

szklanych kulek. Następnie eppendorfy umieszczano w młynie (Retsch MM 200)

i mielono tkankę przez 20 min. przy częstotliwości 30 drgań na sekundę. Dla

wszystkich gatunków, prócz przygotowania próbek indywidualnych z każdej

rośliny, stworzono także pulę tkanki, tzw. „bulk”, po 6 - 8 fragmentów liści

z różnych roślin danego gatunku. DNA ze wszystkich próbek izolowano

zmodyfikowaną metodą „mikro C-TAB” (D

OYLE I

OYLE

1987). Do

rozdrobnionej tkanki dodawano 1 ml podgrzanego buforu ekstrakcyjnego C-TAB,

następnie delikatnie mieszano i inkubowano próbki w temperaturze 60°C przez 30

min. w termomikserze (Eppendorf Thermomixer comfort). Po inkubacji

dodawano 800 µl roztworu chloroform – alkohol izoamylowy, w stosunku 24 : 1

Materiał i metody

i dokładnie mieszano zawartość eppendorfów przez kilkukrotne ich odwrócenie.

Następnie próbki wirowano przez 20 min. przy 14000 rpm, w temp. 4°C

(wirówka mikro 22R, Hettich). Supernatant przenoszono do nowej probówki

eppendorfa i dodawano po raz drugi 600 ml roztworu chloroform – alkohol

izoamylowy (24 : 1). Powtórnie wirowano przez 10 min. przy 14000 rpm,

w temp. 4°C. Po przeniesieniu supernatantu dodawano do niego 1 ml 95%

etanolu, w celu wytrącenia osadu kwasów nukleinowych, wirowano przez 20 min

przy 14000 rpm. Osad przemywano 1ml 70% etanolu i wirowano dwukrotnie

przez 5 min., następnie suszono w urządzeniu Speed Vac (Savant) przez 5 – 10

min. Do wysuszonego osadu dodawano 100 µl buforu TE i pozostawiano próbki

na noc w temp. 4°C, do całkowitego rozpuszczenia osadu. W celu usunięcia

komórkowego RNA próby inkubowano z roztworem RNazy o stężeniu 0,1 mg/ml

w temperaturze 37°C przez 60 minut. DNA przechowywano w temperaturze

-20°C.

3.6.1.

Pomiar koncentracji i czystości wyizolowanego DNA

Pomiar koncentracji i czystości DNA wykonano przy zastosowaniu

spektrofotometru (NanoDrop ND-1000). Koncentrację DNA mierzono przy

długości fali 260 nm, a czystość DNA oznaczano na podstawie stosunku

współczynnika absorbancji przy długości fali A260/A280 (ratio A

260/280

). W celu

sprawdzenia, czy wyizolowany DNA nie jest zdegradowany, wykonano

elektroforezę DNA w 1% żelu agarozowym, jako buforu elektrodowego użyto

0,5×TBE z bromkiem etydyny o stężeniu 0,5 µg/ml.

3.7.

NALIZA POZIOMU METYLACJI

DNA

Z WYKORZY

STANIEM TECHNIKI

MSAP

ETHYLATION

ENSITIVE

MPLIFICATION

OLYMORPHISM

)

W technice MSAP stosowano enzymy metylowrażliwe, częstotnące - MspI

i HpaII oraz rzadkotnący enzym EcoRI. Szczegółowe dane dotyczące

wykorzystywanych w reakcji MSAP enzymów, adaptorów i starterów

przedstawiono w Tab. 5.

Materiał i metody

Tab. 5 Odczynniki stosowane w reakcjach MSAP

Nazwa

Sekwencja

Źródło

ENZYMY

Enzym EcoRI

Rozpoznaje
sekw. 5‟GAATTC3‟

New England
BioLabs

Enzym MspI/HpaII

Rozpoznaje
sekw. 5‟CCGG3‟

New England

BioLabs

ADAPTORY

Adaptor EcoRI

5‟CTCGTAGACTGCGTACC3‟
5‟AATTGGTACGCAGTCTAC3‟

M. Huber

Adaptor MspI/HpaII

5‟GACGATGAGTCCTGAA3‟
5‟CGTTCAGGACTCAT3‟

MWG Biotech

STARTERY DO PREAMPLIFIKACJI

Starter EcoRI + A

5‟GACTGCGTACCAATTCA3‟

M. Huber

Starter MspI/HpaII + T

5‟GATGAGTCCTGAACGGT3‟

M. Huber

STARTERY DO AMPLIFIKACJI SELEKTYWNEJ

Startery EcoRI + ACT,
ACC, ATC, AGG
5‟ IRD800

5‟GACTGCGTACCAAT TCA (CCA, CTA)3‟

MWG Biotech

Startery MspI/HpaII +
AAC, TGC, AAG,
TAC

5‟GATGAGTCCTGAACGG AAC (TGC,
AAG)3‟

MWG Biotech

3.7.1.

Reakcje restrykcji z użyciem enzymów metylowrażliwych

Wyizolowany DNA rozcieńczano sterylną wodą dejonizowaną do

koncentracji 50 ng/µl. Następnie przygotowywano mieszaninę do reakcji

restrykcji, której skład przedstawiono poniżej (objętość na 1 próbkę):

dd H

12,6 l

10 × NE bufor 2

2 l

EcoRI (20 U/ l)

0,125 l

MspI (20 U/ l)

0,125 l

lub

HpaII (10 U/ l)

0,25 l

Materiał i metody

Reakcję restrykcji przygotowywano osobno dla enzymu MspI + EcoRI oraz HpaII

+ EcoRI. Do mieszaniny restrykcyjnej dodawano 5 l DNA (50 ng/µl) i reakcję

restrykcji prowadzono w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Następnie

inaktywowano enzymy restrykcyjne w temp. 70°C przez 15 min.

3.7.2.

Reakcje ligacji adaptorów do miejsc restrykcyjnych

Ze stoków jednoniciowych adaptorów wykonano roztwór dwuniciowych

adaptorów, osobno dla EcoRI, HpaII i MspI, o stężeniu odpowiednio: 5 pmol/ l

i 50 pmol/ l. Następnie sporządzono mieszaninę reakcyjną do ligacji adaptorów

(objętość na 1 próbkę):

dd H

1,8 l

10 bufor dla ligazy

1 l

adaptor MspI /HpaII(50 pmol/ l)

0,6 l

adaptor EcoRI (5 pmol/ l)

0,6 l

T4 DNA ligaza (1U/ l) (MBI Fermentas)

0,6 l

Do próbek po restrykcji dodawano po 5 µl mieszaniny ligacyjnej, zwirowywano

i prowadzono ligację w temp. 37°C przez 16 – 18 godz.

3.7.3.

Preamplifikacja i amplifikacja selektywna fragmentów DNA

Ze stoków primerów do preamplifikacji wykonano rozcieńczenia, aby

uzyskać finalną koncentrację 50 ng/µl dla primera EcoRI+A i MspI/HpaII+T.

Mieszanina reakcyjna do preamplifikacji (objętość na 1 próbkę) zawierała:

dd H

4,1 l

10 bufor

0,6 l

dNTPs (5mM) (Promega)

0,2 l

Primer MspI/HpaII+T

0,15 l

Primer Eco+A

0,15 l

Polimeraza Taq (2U/ l) (Promega)

0,1 l

Mieszaninę do preamplifikacji rozpipetowywano do nowych probówek po 5,3 µl

i dodawano 0,7 µl DNA po ligacji. Reakcję preamplifikacji prowadzono

w termocyklerze (PCR-Gene Amp PCR System 9700) w warunkach: wstępna

Materiał i metody

denaturacja - 94°C przez 2 min, następnie 20 cykli: denaturacja - 94°C przez 30

sek., przyłączanie starterów - 52°C przez 30 sek. i elongacja – 72 °C przez 1 min.

Produkty reakcji preamplifikacji rozcieńczano pięciokrotnie w sterylnej wodzie

dejonizowanej, a następnie pobierano do reakcji amplifikacji selektywnej

z użyciem starterów posiadających trzy selektywne nukleotydy na końcu 3‟

(Tabela 4.). Reakcję amplifikacji selektywnej prowadzono w następujących

warunkach: wstępna denaturacja - 94°C przez 2 min, następnie 12 cykli:

denaturacja - 94°C przez 30 sek., przyłączanie starterów - 65°C-56,6°C (12

kroków o 0,7°C) przez 30 sek. i elongacja - 72°C przez 1 min; następnie 23 cykle:

denaturacja - 94°C przez 30 sek., przyłączanie starterów - 56°C przez 30 sek.

i elongacja - 72°C przez 1 min.

3.7.4.

Wizualizacja produktów amplifikacji selektywnej

Produkty amplifikacji selektywnej wizualizowano przez elektroforezę

w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym. W tym celu sporządzano

mieszaninę żelową, która zawierała: 7M mocznik, 10×TBE, 30% AA

(akrylamid/bisakrylamid, Sigma), temed oraz 10% APS (nadsiarczyn amonu).

Następnie, przygotowywano szyby do elektroforezy w automatycznym

sekwenatorze (Li-Cor). Na dolnej szybie układano „spacery”, przykrywano górną

szybą i zakładano szyny zaciskające obie szyby. Wylewano mieszaninę żelową

między szyby i wkładano grzebień wyznaczający czoło żelu. Następnie, żel

pozostawiano na 1 godz. do całkowitego spolimeryzowania. Po wyznaczonym

czasie wyciągano grzebień, dokładnie czyszczono czoło żelu, a grzebień

wkładano odwrotnie tak, aby wyznaczał ścieżki elektroforezy. Pojemniki aparatu

wypełniano buforem 1×TBE. Następnie, prowadzono elektroforezę wstępną, tzw.

„pre-run” przez 20 min., stosując parametry: 3000 V, 35 mA i 40 W. Po jej

zakończeniu czyszczono kieszonki żelu buforem i nakładano do nich 1 µl

zdenaturowanego (94°C, 3 min.) DNA ze „stop buforem”. Do skrajnej kieszonki

nakładano 0,6 µl markera wielkości (Li-Cor). Elektroforezę prowadzono przez 4

godziny.

Materiał i metody

3.8.

ZOLACJA

DNA

PLAZMIDOWEGO

ENT

Z KULTUR BAKTERYJNYCH

Izolację DNA plazmidowego przeprowadzono z wykorzystaniem kitu

firmy Qiagen, według protokołu producenta. Bakterie E. coli zawierające wektory

pBluscript hodowano na pożywce stałej – zestalonej agarem (LA) i płynnej – LB.

Pożywki sterylizowano w autoklawie, w temperaturze 121°C i ciśnieniu 0,1 MPa

przez 20 minut. Po wystudzeniu pożywek do temp. ok. 50°C, dodawano do nich

antybiotyk – ampicylinę, o stężeniu 100 mg/ml. Płynne hodowle bakteryjne

prowadzono w sterylnych probówkach typu Falcon o pojemności 25 ml,

w temperaturze 37°C z wytrząsaniem o częstotliwości 200 drgań/minutę przez 20

godzin. Następnie, zlewano zawiesinę do probówek 2,2 ml i wirowano przez 5

min. przy 4 000 rpm (wirówka mikro 22R, Hettich). Czynność powtarzano w tych

samych probówkach do momentu całkowitego zlania zawiesiny bakteryjnej

z falkonów. Następnie supernatant usuwano, a do osadu bakteryjnego dodawano

250 µl schłodzonego do 4°C buforu P1. Po rozbiciu osadu dodawano 250 µl

buforu P2, kilkakrotnie mieszano. Na końcu dodawano 250 µl schłodzonego do

temperatury 4°C buforu P3 i wirowano przy 13 000 rpm przez 10 minut

w temperaturze pokojowej. Supernatant dekantyzowano na kolumnach

osadzonych w nowych probówkach i wirowano przy 10 000 rpm przez 1 min.

w temperaturze pokojowej. Następnie kolumny przenoszono do nowych

probówek i przemywano 700 µl buforu PE i wirowano 1 min. przy 10 000 rpm.

Po odwirowaniu pozostałości po buforze przemywającym przeprowadzano elucję

DNA, dodając 30 µl buforu EB, następnie wirowano 1 min. przy 14 000 rpm.

Kolumny usuwano, a wyizolowane DNA przechowywano w temp. -20°C. DNA

po amplifikacji i wyznakowaniu metodą PCR (w/w), wykorzystywano jako sondy

do hybrydyzacji in situ.

Materiał i metody

3.9.

EJESTRACJA OBRAZÓW W MIKROSKOPIE

FLUORESCENCYJNYM

KONFOKALNYM

I CYTOMETRZE OBRAZOWYM

Mikroskop szerokiego pola

W badaniach wzoru metylacji DNA oraz lokalizacji sekwencji

powtarzalnych, techniką FISH, wykorzystano mikroskop epifluorescencyjny

Olympus Provis, wyposażony w lampę rtęciową (160 W). Fluorescencja DAPI

(absorpcja 325 - 375 nm, emisja 440 - 475 nm), Alexa

488

(abs. 475 - 495 nm, em.

520 - 560 nm), rodaminy (Tetramethylrodamine, maksimum abs. 555 nm,

maksimum em. 580 nm) oraz fluoresceiny (FITC, maksimum abs. 494 nm,

maksimum em. 518 nm) rejestrowane były przy użyciu kamery CCD Hamamatsu

c5810.

Mikroskop konfokalny

Do analizy wzoru modyfikacji histonów wykorzystano system konfokalny

FV1000, wyposażony w mikroskop odwrócony - Olympus IX81 (obiektyw

60xPlanApo), 50 mW diodę laserową 405 nm (Coherent BV, The Netherlands)

oraz 100 mW wieloliniowy laser argonowo-jonowy (Melles Griot BV, The

Netherlands). Intensywność światła wzbudzającego była regulowana przy pomocy

filtra akustooptycznego (AOTF). Przekroje optyczne przez jądra w osi Z

(z-stocks) były rejestrowane przy użyciu dwóch oddzielnych fotopowielaczy

(R6357 Haamamatsu, Japonia), pracujących w trybie integracji przy 4 μs w czasie

rezydencji piksela oraz 12-bitowej precyzji digitalizacji sygnału. Fluorescencję

DAPI i Alexa

488

rejestrowano sekwencyjnie, celem przeciwdziałania aliasingowi

spektralnemu. Przekroje w osi Z były rejestrowane przy przesłonie konfokalnej

(confocal pinhole) ustawionej na 1.0. Grubość skrawków w osi Z wynosiła 330

nm.

Cytometr obrazowy

Wzór

acetylacji

histonów

analizowano

wykorzystaniem

cytometru obrazowego Olympus SCAN^R wyposażonego w kamerę Hamamatsu

Materiał i metody

Orca AG CCD. Segmentację obrazów przeprowadzono stosując wartość progową

„static thresolding”, wyliczoną na podstawie algorytmu. Współczynniki

kolokalizacji Pearsona (P) wyliczono przy użyciu programu Matlab 7.1

(MathWorks Inc.). Uzyskane dane pogrupowano w dwie kategorie: o wysokiej

(P>0,65) i niskiej (P<=0,65) wartości współczynnika. Pomiaru intensywności

fluorescencji DAPI i Alexa

488

dokonywano piksel po pikselu, z poszczególnych

jąder interfazowych.

3.10.

KŁAD ROZTWORÓW WYKORZYSTYWANYCH

W BADANIACH

Bufor cytrynianowy pH 4,8

A. 0,1 M C

×H

B. 0,1 M C

×2 H

Łączono 40 ml roztworu A i 60 ml roztworu B (roztwór podstawowy). Przed

użyciem rozcieńczano wodą destylowaną w stosunku 1:9 (roztwór stosowany).

Bufor do izolacji DNA

2% CTAB

100 mM Tris-HCl pH 8

1,4 M NaCl

20 mM EDTA pH 8

1% 2-merkaptoetanol

Bufor EB

10 mM Tris-Cl

Bufor TE

10 mM Tris-HCl pH 8

1 mM EDTA pH 8

Materiał i metody

Bufor P1

15 mM Tris-HCl pH 8

10 mM EDTA pH 8

100 µg/ml roztwór RNazy A

Bufor P2

0,2 N NaOH

1% SDS

Bufor P3

3 M octan potasu pH 5,5

Mieszanina do żeli poliakrylamidowych

Mocznik 7M

10×TBE

30% AA (akrylamid/bisakrylamid)

TEMED

10% APS ( nadsiarczyn amonu)

Woda destylowana

Podłoże LB o pH 7,2

1% baktotrypton (DIFCO)

0,5% ekstrakt drożdżowy (POCH – Polskie Odczynniki Chemiczne)

1% NaCl

Ampicylina

Roztwór żelu agarozowego

150 ml 0,5xTBE

1,5 g agar (Sigma)

woda destylowana

Materiał i metody

Roztwór 8-hydroksychinoliny

0,28 g substancji rozpuszczono w 1 litrze wody destylowanej o temperaturze 60°C

i mieszano na mieszadle magnetycznym do rozpuszczenia, przechowywano 4°C

w ciemności.

Stałe podłoże LA pH 7,2

Podłoże LB pH 7,2

15 g/L agar (DIFCO)

„Stop bufor” do elektroforezy w żelach poliakrylamidowych

Formamid 98%

10 mM EDTA pH 8

Bromofenol blue + Cyanol

10 x PBS pH 7,3

137 mM NaCl,

2.7 mM KCl,

4.3 mM Na

HPO

×2H

1.4 mM KH

10 x PBS pH 7

140 mM NaCl

10 mM Na

HPO

×2H

10 x TBE (objętość na 1 litr)

324 g Tris

55 g kwasu borowego

18,6 g EDTA 0,5 M pH 8

woda destylowana

20 x SSC pH 7

3 M NaCl

0,3 M C

×2 H

Wyniki

YNIKI

4.1.

YPY JĄDER INTERFAZOWYCH OBSERWOWANYCH

U GATUNKÓW

RASSICA

U badanych gatunków Brassica wyróżniono różne typy jąder

interfazowych, podziału dokonano ze względu na obecność lub brak

chromocentrów oraz ze wzgledu na ich wielkość. U B. rapa wszystkie

obserwowane jądra interfazowe chrakteryzowały się występowaniem wyraźnych

chromocentrów (Ryc. 3A), w części jąder większość tych chromocentrów była

podobnej wielkości (Ryc. 3B), znacznie częściej jednak poszczególne

chromocentra chrakteryzowały się zróżnicowanymi rozmiarami. Obserwowano

najczęściej od 12 - 16 chromocentrów w jądrze interfazowym. U B. oleracea

można było wyróżnić dwa główne typy jąder: z wyraźnie zaznaczonymi

chromocentrami różnej wielkości (Ryc. 3C) oraz takie gdzie heterochromatyna

była rozmieszczona bardziej równomiernie w całym jądrze (Ryc. 3D). W tym

typie jąder można było wyróżnić jedynie małe domeny/skupienia

heterochromatyny w obrębie obszarów euchromatynowych. Natomiast u gatunku

allotetraploidalnego

zdecydowana

wiekszość

jąder

interfazowych

chrakteryzowała się wyraźnie zaznaczonymi chromocentrami, przeważnie

o różnej wielkości (Ryc. 3E). Największe chromocentra występowały zazwyczaj

w liczbie 20 - 25 w jądrze interfazowym.

Takie zróżnicowane rozmieszczenie heterochromatyny w jądrach

interfazowych analizowanych gatunków, odbiega od tego obserwowanego

u A. thaliana, gdzie prócz wyraźnie zaznaczonych chromocentrów nie obserwuje

się mniejszych skupisk heterochromatyny.

Wyniki

4.2.

OKALIZACJA SEKWENCJI

25S,

rDNA

ORAZ

SEKWENCJI CENTROMEROWYCH

ENT

Lokalizację genów rRNA i sekwencji centromerowych badano

w chromosomach metafazowych. Przeprowadzono także analizę lokalizacji

sekwencji centromerowych w jądrach interfazowych form uprawnych gatunków

Brassica. Dla każdego gatunku badano średnio 10 - 15 płytek metafazowych,

natomiast w przypadku jąder interfazowych średnio po 20 - 30 z różnych miejsc

na preparacie.

4.2.1.

Lokalizacja sekwencji 5S i 25S rDNA w chromosomach
metafazowych u form uprawnych i RC gatunków Brassica

U form uprawnych gatunków Brassica stwierdzony został polimorfizm

liczby i rozmieszczenia loci 5S i 25S rDNA w chromosomach metafazowych

ASTEROK I IN

2001). W pracy potwierdzono występowanie polimorfizmu

i przedstawiono najczęściej obserwowane typy chromosomów u obu

analizowanych form. Zauważono, iż liczba sygnałów dla sekwencji rDNA

w chromosomach była zawsze taka sama u gatunku B. oleracea, natomiast

najczęstszym zmianom liczby i lokalizacji loci rDNA podlegały genomy B. rapa

i B. napus.

U obu form B. oleracea stwierdzono występowanie 4 sygnałów dla sondy

25S rDNA i 2 dla 5S rDNA (Ryc. 4C, 4D, 5C, 5D). Sekwencję 25S rDNA

zlokalizowano w obszarze przewężenia wtórnego i satelity w jednej parze

chromosomów, natomiast w drugiej parze geny 25S rDNA występowały na końcu

krótkiego ramienia chromosomu. Sekwencję 5S rDNA zlokalizowano

przycentromerowo w jednej parze chromosomów.

U gatunku B. rapa formy uprawnej stwierdzono 8 sygnałów dla sondy 25S

rDNA i tyle samo dla 5S rDNA (Ryc. 4A, 4B). Dwie pary chromosomów

posiadały oba sygnały: w parze chromosomów NOR sonda 25S rDNA zajmowała

obszar przewężenia wtórnego i satelity, natomiast sonda 5S rDNA kolokalizowała

Wyniki

z nią przytelomerowo, a w drugiej parze chromosomów obie sondy

kolokalizowały w obszarze przycentromerowym. U tej formy zidentyfikowano

także 2 pary chromosomów z sekwencją 5S rDNA, w jednej zlokalizowana ona

była przycentromerowo, natomiast w drugiej parze chromosomów terminalnie.

Wyróżniono także dwie pary chromosomów z sygnałami dla sondy 25S rDNA,

zlokalizowanymi przycentromerowo. U formy RC B. rapa obserwowano podobne

typy chromosomów, przy czym występowały tu jedna (Ryc. 5A) lub dwie pary

(Ryc. 5B) chromosomów z przycentromerowo zlokalizowaną sekwencją 25S

rDNA.

U formy uprawnej B. napus stwierdzono występowanie 10 (Ryc. 4F) lub

12 (Ryc. 4E) sygnałów dla sondy 25S rDNA i 10 dla sondy 5S rDNA, a u formy

RC 12 dla 25S rDNA i 10 (Ryc. 5F) lub 12 (Ryc. 5E) dla 5S rDNA. Obie formy

posiadały jedną parę chromosomów NOR z sondą 25S rDNA zlokalizowaną

w obrębie przewężenia wtórnego i satelity oraz kolokalizującą z nią terminalnie

sekwencją 5S rDNA. U formy uprawnej występowały 2 pary chromosomów

z przycentromerowo lub interstycjalnie zlokalizowanymi obiema sekwencjami.

Natomiast u formy RC obserwowano dwie lub trzy takie pary chromosomów.

U obu form występowało także po jednej parze chromosomów z terminalnie

i przycentromerowo zlokalizowanymi sekwencjami 5S rDNA. Natomiast

sekwencję 25S rDNA w okolicy centromeru wykryto w jednej lub dwóch parach

chromosomów u obu form. Tą samą sekwencję, ale zlokalizowaną terminalnie

posiadała jedna para chromosomów także u obu analizowanych form.

4.2.2.

Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 w chromosomach
metafazowych i jądrach interfazowych

U wszystkich badanych gatunków obie sondy zlokalizowano w obrębie

centromerów. Nie stwierdzono różnic w rozmieszczeniu badanych sond

w chromosomach i jądrach interfazowych, między formą uprawną i RC gatunków

Brassica. Zaobserwowano różną intensywność sygnałów w poszczególnych

chromosomach. Część chromosomów posiadała sygnały wyraźnie większe

i o intensywniejszej fluorescencji od pozostałych. Dla każdego gatunku

analizowano średnio 10 płytek metafazowych oraz 20 jąder interfazowych.

Przedstawione wyniki pochodzą z FISH, w której zastosowano 79% siłę płukań.

Wyniki

Lokalizacja sekwencji CentBr1

U B. rapa sondę CentBr1 zlokalizowano w 9 parach chromosomów. Jedna

para chromosomów NOR posiadała bardzo słabe sygnały, które nie były

widoczne w części analizowanych płytek metafazowych. Sygnały u tego gatunku

charakteryzowały się różną intensywnością fluorescencji, przy czym 4

chromosomy posiadały mniejsze sygnały o słabszej intensywności fluorescencji

(Ryc. 6A). U drugiego gatunku diploidalnego sondę CentBr1 zlokalizowano we

wszystkich

parach

chromosomów.

Jednakże cztery chromosomy

charakteryzowały się mniejszymi sygnałami o słabszej fluorescencji (Ryc. 6B).

U allotetraploidalnego B. napus obserwowano najczęściej 34 chromosomy

z sygnałami dla CentBr1 (Ryc. 6C).

W jądrach interfazowych B. rapa i B. oleracea stwierdzono najczęściej 16

- 18 sygnałów dla sondy CentBr1 (Ryc. 7A, B), natomiast u B. napus 24 - 30

sygnałów, przy czym 18 - 20 z nich było znacznie intensywniejszych od

pozostałych (Ryc. 7C).

Lokalizacja sekwencji CentBr2

Sondę CentBr2 zlokalizowano we wszystkich chromosomach u trzech

badanych gatunków Brassica. Obserwowano 4 intensywniejsze sygnały

w chromosomach B. rapa (Ryc. 8A). B. oleracea i B. napus charakteryzowały się

sygnałami o podobnej intensywności fluorescencji w poszczególnych

chromosomach (Ryc. 8B, C). W jądrach interfazowych B. rapa obserwowano

najczęściej 16 - 20 sygnałów (Ryc. 9A), B. oleracea 18 sygnałów (Ryc. 9B),

natomiast B. napus 34 - 36 sygnałów (Ryc. 9C).

Sekwencje centromerowe CentBr1 i CentBr2 kolokalizowały ze sobą

w obrębie centromerów. Chromosomy charakteryzujące się silniejszymi

sygnałami dla jednej z sond, posiadały zazwyczaj dużo słabsze sygnały dla

drugiej. U B. rapa, B. oleracea i B. napus większość chromosomów

posiadających mocne sygnały dla sondy CentBr1 miało dużo słabsze sygnały dla

sondy CentBr2 (Ryc. 10A-D, 11A, B).

W jądrach interfazowych analizowanych gatunków najczęściej

obserwowano intensywne sygnały dla obu sond, które w większości

chromocentrów kolokalizowały ze sobą. Jądra interfazowe B. rapa posiadały 4

intensywne sygnały dla sondy CentBr2, te same chromocentra charakteryzowały

Wyniki

się znacznie słabszymi sygnałami dla CentBr1 (Ryc. 12A, B). U B. oleracea

i B. napus większość intensywnych sygnałów dla obu sond pokrywało się

w chromocentrach (Ryc 12C - F).

4.3.

NALIZA POZIOMU METYLACJI

DNA

Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI

MSAP

W badaniach poziomu metylacji cytozyny w sekwencji CCGG,

wykorzystywano enzymy metylowrażliwe MspI i HpaII. Przeprowadzano dwa

etapy analizy, mające na celu identyfikację loci polimorficznych między

systemami MspI/HpaII oraz loci polimorficznych między badanymi gatunkami

Brassica. W pracy porównywano wzór metylacji cytozyn w sekwencji CCGG

między formami uprawnymi i RC, a także wzór metylacji u gatunku

allotetraploidalnego i jego gatunków ancestralnych. Dany locus klasyfikowano

jako demetylowany u danej formy/gatunku, jeżeli nie stwierdzono metylacji

żadnej z cytozyn w sekwencji CCGG, podczas gdy u drugiej formy/gatunku

w tym samym locus obserwowano metylację obu cytozyn. Jako hipermetylowany

klasyfikowano locus u danej formy/gatunku, jeżeli obie cytozyny w sekwencji

CCGG pozostawały zmetylowane, podczas gdy u drugiej formy/gatunku obie

cytozyny nie były metylowane. Jeżeli zmiana metylacji dotyczyła wyłącznie

jednej cytozyny, danego locus nie klasyfikowano jako demetylowany bądź

hipermetylowany.

Pierwsze reakcje MSAP przeprowadzano przygotowując podwójne reakcje

restrykcji dla każdego z izoschizomerów. Skład obu mieszanin reakcyjnych był

ten sam. Przygotowanie podwójnych reakcji restrykcji miało na celu sprawdzenie

poprawności działania enzymów. O prawidłowo przeprowadzonej reakcji

restrykcji wnioskowano po analizie wzoru prążkowego uzyskanego po cięciu

DNA odpowiednim enzymem. W przypadku, gdy nie stwierdzono różnic we

wzorze prążkowym dla podwójnych restrykcji, dalszą część reakcji MSAP

prowadzono wykorzystując pojedyncze restrykcje.

Wyniki

4.3.1.

Kontrola jakości i koncentracji wyizolowanego DNA

Reakcje MSAP prowadzono na DNA genomowym trzech analizowanych

gatunków Brassica. Czystość i koncentrację wyizolowanego DNA mierzono

z wykorzystaniem spektrofotometru, wyniki pomiarów zamieszczono w Tab. 6.

Tab. 6 Wyniki pomiarów spektrofotometrycznych DNA wykorzystywanego

w reakcjach MSAP

Gatunek

Koncentracja (ng/µl)

Czystość

B. rapa uprawny

1822,7

2,15

B. rapa RC

3417,2

2,15

B. oleracea uprawny

2779,3

2,15

B.oleracea RC

2991,5

2,11

B. napus uprawny

2708,4

2,11

B. napus RC

2288,1

2,15

Koncentracja DNA mieściła się w przedziale między 1800 a 3400 ng/µl,

natomiast czystość w prawidłowym przedziale współczynnika A

260/280

wynoszącym 1,8 – 2,5. Uzyskana koncentracja DNA była wystarczająca do

przeprowadzenia reakcji MSAP, do których wykorzystywano DNA o koncentracji

50 ng/µl. Jakość wyizolowanego DNA sprawdzano również poprzez elektroforezę

w żelu agarozowym (Ryc. 13). Wszystkie badane próbki nie wykazywały cech

DNA zdegradowanego, o czym świadczyło występowanie w żelu jednego

wyraźnego prążka dla danego gatunku.

Ryc.  13  Zdjęcie  żelu  agarozowego  z  DNA  genomowym  gatunków  Brassica
(marker wielkości, 1 - B. oleracea  RC, 2  – B. oleracea uprawny, 3  – B.  rapa
RC, 4 - B. rapa uprawny,  5 - B. napus RC, 6 - B. napus uprawny)

1 2

5 6

Wyniki

4.3.2.

Reakcje restrykcji z użyciem enzymów MspI i HpaII

Analiza wzoru prążkowego dla podwójnych reakcji restrykcji z enzymami

EcoRI/MspI, nie wykazała występowania prążków polimorficznych między tymi

restrykcjami w badanych loci. W celu potwierdzenia poprawności obserwacji

wzoru prążkowego, zastosowano program ImageJ z funkcją analizy żeli. Na

podstawie analizy przeprowadzonej w programie ImageJ dla wszystkich

gatunków Brassica, nie stwierdzono różnic w przebiegu poszczególnych

histogramów reprezentujących podwójne reakcje restrykcji z enzymami

EcoRI/MspI. Przykładowe wyniki dla gatunku B. oleracea, przedstawiono na Ryc.

14. Poniżej zamieszczono również fragment żelu, na którym przeprowadzono

analizę w programie ImageJ (Ryc. 15).

Ryc. 14 Porównanie wzoru prążkowego podwójnych reakcji restrykcji

u B. oleracea (enzym EcoRI/MspI, kombinacja starterów: E – ACT,
H/M – AAC)

Wyniki

Ryc. 15 Fragment żelu poliakrylamidowego przedstawiający wzór prążkowy

dla podwójnych reakcji restrykcji DNA gatunku B. oleracea
(prostokąt), (enzym EcoRI/MspI, kombinacja starterów: E – ACT,
H/M – AAC)

Dwa histogramy reprezentujące podwójne reakcje restrykcji dla enzymów

EcoRI/MspI (Ryc. 14) nie różnią się od siebie pod względem ilości i miejsca

występowania pików. Nieznaczne różnice występują jedynie w wysokości

poszczególnych pików, co uwarunkowane jest różną intensywnością fluorescencji

prążków w danym locus.

Taką samą analizę przeprowadzono dla podwójnych reakcji restrykcji

z enzymami EcoRI/HpaII. W tym przypadku jednak, stwierdzono występowanie

różnic we wzorze prążków między tymi restrykcjami. Średnio od 3 do 5 loci

w analizowanej kombinacji starterów, było polimorficznych między obiema

reakcjami restrykcji. Z tego względu zdecydowano się prowadzić pozostałą część

reakcji MSAP na podwójnych restrykcjach dla enzymów EcoRI/HpaII. Dalszej

analizie poddawano wówczas tylko loci niepolimorficzne między podwójnymi

restrykcjami.

Wyniki

4.3.3.

Reakcje amplifikacji selektywnej oraz analiza wzoru prążkowego

Analizę poziomu metylacji cytozyny w sekwencji CCGG przeprowadzono

stosując osiem kombinacji starterów do amplifikacji selektywnej. Startery te

różniły się sekwencją trzech nukleotydów na końcu 3‟ (Tab. 7).

Tab. 7 Sekwencja nukleotydów na końcu 3’ starterów wykorzystywanych

w amplifikacji selektywnej

Sekwencja nukleotydów 3‟
EcoRI

Sekwencja nukleotydów 3‟
HpaII/MspI

E - ACT

H/M - AAC

E - ACT

H/M - TGC

E - ACT

H/M - TAC

E - ACT

H/M - AAG

E - ATC

H/M - AAG

E - ACC

H/M - TGC

E - ACC

H/M - TAC

E - ACG

H/M - AAC

Zastosowanie ośmiu kombinacji starterów w amplifikacji selektywnej umożliwiło

analizę dostatecznej liczby loci polimorficznych między systemami MspI i HpaII

oraz między poszczególnymi formami/gatunkami Brassica.

Dane zestawione w Tab. 8 – 11 odnoszą się do wszystkich analizowanych

kombinacji starterów w amplifikacji selektywnej. W Tab. 8 przedstawiono

porównawcze wyniki poziomu metylacji DNA u badanych gatunków Brassica.

Stwierdzono najwyższy poziom metylacji u formy uprawnej B. rapa wynoszący

ponad 43%, natomiast najniższy procent metylacji wykazano dla formy RC tego

samego gatunku. Formy uprawne B. rapa oraz B. napus charakteryzowały się

wyższym procentem metylacji w porównaniu do form RC. Odwrotną sytuację

zaobserwowano dla gatunku B. oleracea, gdzie metylacja u formy RC była

nieznacznie wyższa, niż u formy uprawnej. Największe różnice w poziomie

metylacji między formami uprawnymi, a formami RC zaobserwowano dla

gatunku B. rapa – prawie 14%, podczas gdy różnica ta u pozostałych gatunków

nie przekraczała 5%.

Wyniki

Tab. 8 Poziom metylacji DNA u gatunków Brassica

Gatunek/forma

Liczba
analizowanych loci

Liczba loci
polimorficznych
między HpaII a MspI

Metylacja w sekwencji
CCGG (%)*

B. rapa uprawny

153

43,1

B. rapa RC

195

29,2

B. oleracea uprawny

248

37,9

B. oleracea RC

240

38,7

B. napus uprawny

249

35,3

B. napus RC

271

30,5

* Odchylenie standardowe ±5%

W pracy analizowano również liczbę loci demetylowanych

i hipermetylowanych u form uprawnych i RC. Dany locus klasyfikowano, jako

demetylowany, jeżeli nie stwierdzono metylacji żadnej z cytozyn w sekwencji

CCGG u formy RC, natomiast u formy uprawnej w tym samym locus

obserwowano metylację obu cytozyn. Dany locus klasyfikowano, jako

hipermetylowany, jeśli u formy RC stwierdzono metylację obu cytozyn

w sekwencji CCGG, a u formy uprawnej obie cytozyny pozostawały

niezmetylowane. U form RC gatunków B. rapa i B. napus stwierdzono większą

liczbę loci demetylowanych od liczby loci hipermetylowanych, podczas gdy

u formy RC gatunku B. oleracea liczba loci demetylowanych była prawie równa

liczbie loci hipermetylowanych (Tab. 9).

Tab. 9 Liczba loci demetylowanych i hipermetylowanych u form uprawnych

i RC gatunków Brassica.

Gatunek/forma

Liczba loci

polimorficznych między
gatunkami uprawnymi a
formami RC

Liczba loci
demetylowanych
u form RC

Liczba loci
hipermetylowanych
u form RC

B. rapa uprawny/
B. rapa RC

B. oleracea uprawny/
B. oleracea RC

B. napus uprawny/
B. napus RC

Analizę porównawczą poziomu demetylacji i hipermetylacji sekwencji

CCGG przeprowadzono także dla gatunków diploidalnych i allotetraploidalnych

Wyniki

(Tab. 10). W tym przypadku analizowano loci polimorficzne między gatunkami

ancestralnymi B. rapa i B. oleracea a gatunkiem allotetraploidalnym. Za locus

demetylowany uważano locus występujący u B. napus, w którym nie

obserwowano metylacji żadnej z cytozyn, jeżeli jednocześnie locus ten u obu

gatunków ancestralnych posiadał zmetylowane obie cytozyny w sekwencji

CCGG. Za locus hipermetylowany u B. napus uważano taki, w którym

obserwowano metylację obu cytozyn, podczas gdy nie stwierdzono jej

u gatunków ancestralnych (Tab. 11 C, D). Liczba loci demetylowanych

u B. napus była znacznie wyższa od liczby loci hipermetylowanych, którą

stwierdzono jedynie dla jednego locus u obu analizowanych form (Tab. 10).

Tab. 10 Liczba loci demetylowanych i hipermetylowanych u gatunków

ancestralnych i gatunku allotetraploidalnego

Liczba loci polimorficznych

między gatunkami

ancestralnymi i gat.
allotetraploidalnym

Liczba loci

demetylowanych

u gatunku

allotetraploidalnego

Liczba loci

hipermetylowanych

u gatunku

allotetraploidalnego

B. rapa uprawny/

B. oleracea uprawny

B. napus uprawny

B. rapa RC/

B. oleracea RC

B. napus RC

118

W Tab. 11 przedstawiono szczegółową analizę porównawczą zmian we

wzorze metylacji sekwencji CCGG u gatunków allotetraploidalnych i gatunków

ancestralnych. Rozpatrywano przypadki, gdy wzór metylacji u gatunku

allotetraploidalnego był taki sam w danym locus, jak u jednego z gatunków

ancestralnych (Tab. 11A, B, E), bądź gatunek allotetraploidalny posiadał nowy

wzór metylacji, którego nie stwierdzono w danym locus u żadnego z gatunków

diploidalnych (Tab. 11C, D).

Jeżeli jeden z gatunków ancestralnych posiadał zmetylowaną, co najmniej

jedną, cytozynę w sekwencji CCGG, a u drugiego gatunku ancestralnego nie

obserwowano metylacji w sekwencji CCGG, to u B. napus formy uprawnej

sekwencja CCGG była metylowana na co najmniej jednej cytozynie. Taką

sytuację stwierdzono dla 27 loci (Tab. 11A). Podobna była także liczba loci

Wyniki

u B. napus formy uprawnej, gdy nie obserwowano u tego gatunku metylacji

żadnej z cytozyn (Tab. 11B). Natomiast, u formy RC B. napus stwierdzono

nieznaczną przewagę liczby loci, gdzie obie cytozyny pozostawały

niezmetylowane (Tab. 11A i B). Przypadki loci podlegających demetylacji bądź

hipermetylacji u obu form B. napus (Tab. 10, Tab. 11C i D) opisano przy okazji

omawiania wyników przedstawionych w Tab. 10. W Tab. 11, wiersz-E

przedstawiono sytuację, gdy oba gatunki ancestralne i gatunek allotetraploidalny

posiadały zmetylowaną, co najmniej jedną z cytozyn. Liczba loci u formy

uprawnej i RC B. napus była w tym przypadku podobna i wynosiła odpowiednio

27 i 29.

Podsumowując zamieszczone w Tab. 11 wyniki stwierdzono, iż u obu

analizowanych form B. napus nieznacznie przeważała liczba loci o takim wzorze

metylacji, jak u gatunku ancestralnego B. oleracea. Liczba loci o nowym wzorze

metylacji, który nie występował u żadnego z gatunków ancestralnych, była

podobna u obu badanych form i stanowiła mniejszość wśród analizowanych

przypadków (Tab. 12).

Tab. 11 Wzór metylacji sekwencji CCGG u gatunków ancestralnych

i allotetraploidalnych

Oznaczenie
literowe typu
modyfikacji

Wzór metylacji
sekwencji CCGG u
gatunków ancestralnych

Wzór metylacji
sekwencji CCGG
u gatunku
allotetraploidalnego

Liczba
zmodyfikowanych
loci u gatunku
allotetraploidalnego

CGG + CCGG

CCGG + CCGG

CGG + CCGG

CGG

CCGG

CGG

27 - uprawny

30 - RC

CGG + CCGG

CCGG + CCGG

CGG + CCGG

CCGG

31 - uprawny

49 - RC

CCGG + CCGG

CGG

1- uprawny

1 - RC

CGG +

CGG

CCGG

11 - uprawny

9 - RC

CGG +

CCGG

CGG + C

CGG

CCGG

CGG

27 - uprawny

29 - RC

Wyniki

Tab. 12 Porównanie liczby loci u B. napus, o wzorze metylacji sekwencji

CCGG jak u B. rapa lub B. oleracea

Wzór metylacji u B.napus
jak u B. rapa/
liczba loci

Wzór metylacji u B. napus
jak u B. oleracea/
liczba loci

Nowy wzór metylacji
B. napus / liczba loci

B. napus uprawny

B. napus RC

4.4.

ZÓR METYLACJI

DNA

Analizę wzoru metylacji DNA prowadzono z wykorzystaniem techniki

immunobarwienia z przeciwciałami monoklonalnymi, skierowanymi przeciwko

metylowanej cytozynie w łańcuchu DNA (5‟mC). Wzór metylacji badano

w chromosomach metafazowych oraz w jądrach interfazowych form uprawnych

i RC gatunków Brassica, natomiast chromosomy pachytenowe analizowano tylko

u form RC. Związane to było z możliwością szybkiego otrzymania kolejnych

zakwitających roślin oraz zebrania wystarczającej do analizy liczby pączków

szczytowych. Dla każdego gatunku analizowano średnio po 10 – 15 płytek

metafazowych oraz 30 jąder interfazowych z różnych miejsc na preparacie.

W przypadku analizy preparatów mejotycznych zliczano średnio około 50

komórek w stadium pachytenu.

4.4.1.

Wzór metylacji DNA w chromosomach metafazowych

Badane

gatunki

Brassica

charakteryzują się małymi i słabo

zróżnicowanymi chromosomami, dlatego też nie obserwowano w chromosomach

tych gatunków wzoru metylacji w postaci prążków, charakterystycznego dla

gatunków o większych chromosomach, np.: Vicia faba. Większość chromosomów

metafazowych charakteryzowała się rozmieszczeniem sygnałów immunodetekcji

zmetylowanego DNA (5‟mC) prawie w całych chromosomach. Jednakże,

zaobserwowano

pewne

różnice w dystrybucji sygnałów dla 5‟mC

w poszczególnych chromosomach danego gatunku. B. rapa zaobserwowano

intensywne sygnały metylacji w niektórych chromosomach metafazowych,

Wyniki

podczas gdy pozostałe chromosomy bądź nie posiadały sygnałów wcale, bądź

wykryto je tylko w części chromosomu (Ryc. 16A, 16B). Najczęściej

obserwowano od 8 do 10 chromosomów gdzie metylację DNA wykryto w całym,

lub prawie całym chromosomie. Takiej sytuacji nie stwierdzono dla form RC

i uprawnej gatunku B. oleracea. Wszystkie chromosomy B. oleracea posiadały

sygnały dla 5‟mC i były one rozmieszczone przeważnie w okolicy centromerów,

bądź prawie równomiernie na całej powierzchni chromosomów (Ryc. 16C, 16D).

U gatunku allotetraploidalnego zaobserwowano różnice w dystrybucji sygnałów

w chromosomach pomiędzy formami RC i uprawnymi. U formy uprawnej

B. napus sygnały dla 5‟mC wykryto we wszystkich chromosomach

i charakteryzowały się one bardziej równomiernym rozmieszczeniem (Ryc. 16E),

podczas gdy u formy RC część chromosomów była mocniej zmetylowana (Ryc.

16F). Chromosomów takich obserwowano od 18 do 23, w zależności od

analizowanej płytki metafazowej. Wśród tych chromosomów wyróżniało się

zazwyczaj 8 charakteryzujących się znacznie silniejszymi sygnałami dla 5‟mC,

sygnały te prawie równomiernie pokrywały całe chromosomy (Ryc. 16F strzałki).

Należy zaznaczyć, iż przedstawione wyniki immunobarwień były uzyskane przy

zastosowaniu takich samych dla wszystkich gatunków rozcieńczeń przeciwciał

pierwszo- i drugorzędowych, a reakcje immunobarwień prowadzono w tych

samych warunkach.

4.4.2.

Wzór metylacji DNA w jądrach interfazowych

Wzór metylacji w jądrach interfazowych form uprawnych i RC nie różnił

się, stąd też otrzymane wyniki zobrazowano zdjęciami jedynie dla form

uprawnych gatunków Brassica. U B. rapa w jądrach interfazowych stwierdzono

silne sygnały dla 5‟mC, zlokalizowane w barwiących się intensywnie DAPI

chromocentrach. Liczba tych sygnałów wynosiła od 16 do 20, przy czym od 8 do

10 sygnałów w chromocentrach było znacznie większych i o intensywniejszej

fluorescencji od pozostałych (Ryc. 17A). U B. oleracea sygnały dla 5‟mC

wykryto w całym jądrze interfazowym, w niektórych jądrach można było

zaobserwować intensywniejszą fluorescencję w chromocentrach, jednak różnica

w intensywności fluorescencji pomiędzy chromocentrami, a pozostałą częścią

jądra interfazowego nie była tak wyraźna jak u B. rapa (Ryc. 17B). Natomiast

Wyniki

u gatunku allotetraploidalnego stwierdzono występowanie sygnałów metylacji

DNA zarówno w heterochromatynowych chromocentrach, jak i poza nimi (Ryc.

17C). Część jąder interfazowych B. napus charakteryzowała się wzorem metylacji

DNA podobnym do tego obserwowanego u B. rapa, z wyraźnie zmetylowanymi

chromocentrami, jednak sygnały metylacji u B. napus zlokalizowane były też

poza chromocentrami, czego nie obserwowano u B. rapa.

4.4.3.

Wzór metylacji DNA w chromosomach pachytenowych

Ze względu na wysoką kondensację chromatyny w chromosomach

metafazowych, a jednocześnie dużą liczbę sygnałów anty-5‟mC w obrębie

chromosomu, zdecydowano się wykorzystać do immunobarwienia także

chromosomy pachytenowe, które dają możliwość dokładnej lokalizacji sygnałów

wzdłuż chromosomów. Chromosomy pachytenowe charakteryzowały się

niejednolitym wzorem metylacji. Wzdłuż chromosomów obserwowano

powtarzający się wzór z naprzemiennie występującą mocniejszą fluorescencją

i jej brakiem. Wzór ten tworzył strukturę na kształt sznurka z koralikami –

miejscami o intensywnej fluorescencji (Ryc. 18A‟ kwadrat). Dodatkowo

u wszystkich trzech gatunków w stadium pachytenu zaobserwowano

charakterystyczne miejsca o intensywniejszej fluorescencji, które były

zgrupowane w kilka wyraźnych punktów (Ryc. 18A‟-C‟ strzałki). Miejsca te

kolokalizowały z intensywną fluorescencją DAPI. W celu sprawdzenia, jakie

sekwencje powtarzalne lokalizują w mocno metylowanych miejscach

chromosomów pachytenowych, wykonano fluorescencyjną hybrydyzację in situ

z sondami 25S i 5S rDNA. Na rycinie 19 przedstawiono wyniki uzyskane dla

gatunku B. rapa (Ryc. 19A) i B. oleracea (Ryc. 19B). Po przeanalizowaniu około

50 komórek w stadium pachytenu stwierdzono, iż sygnały intensywnej

fluorescencji przeciwciała anty-5‟mC pokrywają się z lokalizacją sygnałów dla

badanych sond rDNA. Sygnały dla sondy 25S rDNA w większości

kolokalizowały z sekwencjami 5S rDNA (Ryc. 19A, B) w miejscu intensywnej

fluorescencji DAPI. W niektórych komórkach sygnały 5S rDNA wykryto także

poza miejscami jej kolokalizacji z sondą 25S rDNA (Ryc. 19C strzałka).

Wyniki

4.5.

ZÓR METYLACJI HISTONU

Analizę wzóru metylacji histonu H3 przeprowadzono dla lizyny w pozycji

czwartej i dziewiątej histonu H3 w jądrach interfazowych gatunków Brassica.

Wzór metylacji H3 nie różnił się w jądrach interfazowych form RC i uprawnych,

dlatego do dlaszych badań wykorzystywano jedynie formę uprawną gatunków

Brassica. Analizę prowadzono na około 30 jądrach interfazowych dla każdego

gatunku.

Obserwacje

przeprowadzono

wykorzystaniem

mikroskopu

konfokalnego, gdzie preparaty analizowano w osi X, Y i Z. Na rycinach

zamieszczono serię przekrojów w osi Z przez jądra interfazowe.

4.5.1.

Dimetylacja H3K4

Dimetylację lizyny w pozycji czwartej histonu H3 u Brassica rapa

wykryto w rejonach euchromatynowych jąder interfazowych. Silnie barwiące się

DAPI heterochromatynowe chromocentra nie posiadały sygnałów anty-

H3K4me2, co było widoczne na wszystkich przekrojach optycznych przez jądra

interfazowe (Ryc. 20A-N). U B. oleracea w większości analizowanych jąder

interfazowych nie wykryto sygnałów anty-H3K4me2 w chromocentrach (Ryc.

21A-L), a obserwowano je głównie w euchromatynie. U B. napus metylacja

lizyny w pozycji czwartej była związana z euchromatyną, w chromocentrach nie

obserwowano sygnałów anty-H3K4me2 (Ryc. 22A-N). Taki wzór metylacji był

charakterystyczny

dla wszystkich analizowanych jąder interfazowych

i obserwowany we wszystkich przekrojach przez jądra u tego gatunku. Nie

stwierdzono dimetylacji H3K4 w obszarze jąderek, zarówno u gatunków

diploidalnych, jak i u allotetraploida. Na rycinie 23 przedstawiono porównawczo

wzór dimetylacji H3K4 u trzech analizowanych gatunków. Do ilustracji wybrano

po jednym przekroju optycznym z każdego gatunku.

Analiza rozmieszczenia sygnałów anty-H3K4me2 w chromosomach

w stadium metafazy u B. napus (Ryc. 24A) i anafazy u B. oleracea (Ryc. 24B)

wykazała, iż obszary przycentromerowe charakteryzują się brakiem sygnałów,

natomiast występują one w częściach dystalnych ramion.

Wyniki

4.5.2.

Dimetylacja H3K9

U B. rapa we wszystkich analizowanych jądrach interfazowych

intensywne sygnały anty-H3K9me2 kolokalizowały z chromocentrami (Ryc.

25A-L). Natomiast u B. oleracea większość chromocentrów nie posiadała

sygnałów anty-H3K9me2, co obserwowano na przekrojach optycznych (Ryc.

26A-L).

Przekroje

części

powierzchniowej

jąder

interfazowych

charakteryzowały się brakiem metylacji w obszarze chromocentrów (Ryc. 26A, B,

K, L), podczas gdy w przekrojach z części środkowej jąder, niektóre

chromocentra posiadały sygnały (Ryc. 26H, I). Fluorescencję, u tego gatunku,

zlokalizowano przede wszystkim w całym obszarze jądra interfazowego,

z wyjątkiem jąderka. U gatunku allotetraploidalnego jądra interfazowe

charakteryzowały się rozmieszczeniem sygnałów zarówno w chromocentrach, jak

i poza nimi w euchromatynie (Ryc. 27A-N). U B. napus nie obserwowano

sygnałów w jąderku. Dla lepszego porównania wzoru H3K9me2, na rycinie 28

przedstawiono centralne przekroje optyczne przez jądra interfazowe trzech

gatunków.

4.5.3.

Trimetylacja H3K9

Trimetylację lizyny w pozycji 9. zlokalizowano głównie w obszarze

jąderka u B. rapa i B. oleracea (Ryc. 29A-M i 30A-L), lub w jąderku

i euchromatynie jądra interfazowego u B. napus (Ryc. 31A-J). U wszystkich

trzech gatunków nie obserwowano sygnałów anty-H3K9me3 w chromocentrach.

Na serii przekrojów B. rapa i B. oleracea wyraźnie zaznaczają się sygnały

skupione w jąderku, widoczne jest to na wszystkich przekrojach przez jądra,

w których uwidocznione jest jąderko. U B. napus obserwowano sygnały, które

były skupione wokół jąderka, tworząc charakterystyczny pierścień. U tego

gatunku fluorescencję, o podobnej intensywności jak w jąderku, zlokalizowano

również w euchromatynie jądra interfazowego, co było widoczne na

poszczególnych przekrojach optycznych.

Wyniki

4.6.

ZÓR ACETYLACJI HISTONÓW

Wzór acetylacji histonu H4 badano w lizynie w pozycji 5. i 16., natomiast

histonu H3 w lizynie w pozycji 18. Analizę prowadzono na około 30 jądrach

interfazowych dla każdego gatunku. Materiału do przygotowania preparatów nie

traktowano w roztworze 8-hydroksychinoliny, tylko bezpośrednio utrwalano

w formaldehydzie. Te same preparaty wykorzystywano następnie do analizy

w cytometrze obrazowym, gdzie badano wzór acetylacji w zależności od faz

cyklu komórkowego. Analizę wzoru acetylacji prowadzono z wykorzystaniem

mikroskopu konfokalnego. Na rycinach zamieszczono serię przekrojów

optycznych przez jądra interfazowe.

4.6.1.

Acetylacja H4K5

U wszystkich trzech gatunków Brassica obserwowano zróżnicowany wzór

acetylacji H4K5 w poszczególnych jądrach interfazowych danego gatunku.

W większości jąder interfazowych B. rapa intensywne sygnały anty-H4K5

zlokalizowano w chromocentrach (Ryc. 32a A-K), podczas gdy w pozostałych

jądrach sygnały obserwowano w euchromatynie, a większość chromocentrów nie

była acetylowana (Ryc. 32b A-L). Oba analizowane przypadki znajdowały

potwierdzenie we wszystkich przekrojach w osi Z. U drugiego gatunku

diploidalnego w części jąder obserwowano intensywną acetylację H4K5

w chromocentrach (Ryc. 33a A-N), natomiast w pozostałych sygnały

zlokalizowane były w całym obszarze jądra interfazowego z wyjątkiem

chromocentrów i jąderka (Ryc. 33b A-N). U B. napus większość jąder

interfazowych posiadała intensywne sygnały anty-H4K5 w chromocentrach (Ryc.

34a A-N), natomiast pozostała część jąder, w euchromatynie (Ryc. 34b A-N).

Brak sygnałów w chromocentrach obserwowano szczególnie wyraźnie na

pierwszych przekrojach od powierzchni jądra (34b A-C).

Wyniki

4.6.2.

Acetylacja H4K16

Wzór acetylacji lizyny w pozycji 16. nie był tak zróżnicowany

w poszczególnych jądrach interfazowych danego gatunku, jak to miało miejsce

dla acetylacji H4K5. U B. rapa sygnały anty-H4K16 były zlokalizowane

w obszarze euchromatyny, przy czym większość analizowanych jąder

charakteryzowała

się

częściową

antykolokalizacją

tych

sygnałów

z chromocentrami (Ryc. 35A-H). Na niektórych przekrojach przez jądra

interfazowe

oleracea

stwierdzono

antykolokalizację sygnałów

z chromocentrami, jednak w większości przekrojów sygnały były rozproszone

w euchromatynie oraz w chromocentrach (Ryc. 36A-I). W części jąder

interfazowych u tego gatunku stwierdzono wyraźne sygnały w obszarze jąderka

(Ryc. 36C, D, E, F). B. napus cechował się najmniej zróżnicowanym wzorem

acetylacji, sygnały rozmieszczone były w euchromatynie oraz w chromocentrach

(Ryc. 37A-L), mniejszość stanowiły jądra interfazowe, gdzie obserwowano

antykolokalizację z chromocentrami.

4.6.3.

Acetylacja H3K18

Wzór acetylacji lizyny w pozycji 18 histonu H3 u badanych gatunków

Brassica przedstawiał się podobnie jak wzór acetylacji H4K16. Większość jąder

interfazowych B. rapa charakteryzowała się brakiem acetylacji H3K18

w chromocentrach, a sygnały zlokalizowane były w euchromatynie (Ryc. 38A-N).

Natomiast u B. oleracea sygnały anty-H3K18 były rozmieszczone równomiernie

w całym jądrze (z wyj. jąderka) również w chromocentrach, lub w całym jądrze

z wyjątkiem jąderka i części chromocentrów (Ryc. 39A-L). Podobny wzór

acetylacji H3K18 obserwowano dla B. napus (Ryc. 40A-L).

Wyniki

4.7.

NALIZA WZORU ACETYLACJI HISTONÓW

W CYTOMETRII OBRAZOWEJ

Badania wzoru acetylacji w cytometrii obrazowej przeprowadzono

u B. rapa. Wybrany gatunek charakteryzował się lokalizacją heterochromatyny

konstytutywnej w intensywnie barwiących się DAPI chromocentrach.

Immunobarwienia z zastosowaniem przeciwciał anty – H4K5ac, H4K16ac

i H3K18ac wykazały, że u badanych gatunków można zaobserwować trzy główne

wzory acetylacji w jądrach interfazowych. Cześć jąder charakteryzowała się

intensywnymi sygnałami w chromocentrach, w części obserwowano

antykolokalizację sygnałów z chromocentrami, lub tylko częściową kolokalizację

z chromocentrami. Postanowiono sprawdzić, czy dany wzór acetylacji jest

skorelowany z cyklem komórkowym oraz czy heterochromatyna konstytutywna

charakteryzuje się wysoką acetylacją histonów H3 i H4 w poszczególnych fazach

interfazy. W tym celu zsegmentowane jądra interfazowe podzielono, na podstawie

uzyskanego histogramu względnej intensywności fluorescencji DAPI, na trzy

frakcje: G1, S i G2, a następnie badano kolokalizację intensywności fluorescencji

przeciwciała anty-H4K5 (Alexa

488

) z intensywnością fluorescencji DAPI

w heterochromatynie konstytutywnej – co wyliczano stosując współczynnik

kolokalizacji Pearsona (P). Uzyskane wyniki przedstawiono za pomocą

histogramów i wykresów.

4.7.1.

Acetylacja H4K5

Badania wzoru acetylacji H4K5 przeprowadzono na 760 jądrach

interfazowych.

Skonstruowano

histogram

przedstawiający

całkowitą

intensywność fluorescencji DAPI, która jest skorelowana z zawartością DNA

w poszczególnych fazach (Ryc. 41). Na podstawie uzyskanego histogramu

dokonano podziału na jądra interfazowe reprezentujące fazę G0/G1, S i G2/M.

Następnie wyliczono współczynnik kolokalizacji Pearsona (P) w poszczególnych

fazach. Jądra interfazowe podzielono na dwie frakcje, reprezentujące niski

(P<0,65) i wysoki (P>=0,65) współczynnik kolokalizacji Pearsona.

Wyniki

U B. rapa 45,2% jąder interfazowych znajdowało się w fazie G1, 24,1%

w S i 30,7% w fazie G2. Spośród jąder w fazie G1 86,9% charakteryzowało się

wysokim współczynnikiem kolokalizacji Pearsona (P>=0,65), natomiast w fazie S

i G2 aż 99% jąder interfazowych (Ryc. 42). Jedynie nieco ponad 0,5% wszystkich

analizowanych jąder interfazowych posiadało ujemny współczynnik kolokalizacji

i prawie wszystkie te jądra znajdowały się w fazie G1.

0.0

1.4

2.8

4.2

5.7

7.1

8.5

9.9

11.4

ją

Całkowita intensywność DAPI (x10

)

Ryc. 41 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

200

400

600

800

spó

łc

)

Liczba jąder

Ryc. 42 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)

lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona

Wyniki

4.7.2.

Acetylacja H4K16

Analizę wzoru acetylacji H4K16 przeprowadzono dla 1295 jąder

interfazowych B. rapa. Spośród tych jąder 66,1% było w fazie G1, 15,4% w fazie

S i 18,5% w fazie G2 (Ryc. 43). Wysoki współczynnik kolokalizacji był

charakterystyczny dla: 32,9%, 47,5% i 48,1%, jąder interfazowych, odpowiednio

w fazach G1, S i G2, natomiast niski dla: 67,1%, 52,5% i 51,9% jąder

interfazowych w odpowiednich fazach. Ujemny współczynnik kolokalizacji

posiadało 0,6% analizowanych jąder interfazowych (Ryc. 44).

0.0

2.5

5.1

7.6

10.2

12.7

ją

Całkowita intensywność DAPI (x10

)

Ryc. 43 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

200

400

600

800

1000

1200

1400

spó

łc

)

Liczba jąder

Ryc. 44 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)

lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona

Wyniki

4.7.3.

Acetylacja H3K18

Badania wzoru acetylacji H3K18 przeprowadzono dla 3359 jąder

interfazowych B. rapa. W fazie G1, S i G2 znajdowało się odpowiednio: 52,3%,

14,9% i 32,8% jąder interfazowych (Ryc. 45). Wysokim współczynnikiem

kolokalizacji charakteryzowało się: 19,9% jąder w fazie G1, 22,8% w S i 14,8%

w G2. Znacznie więcej jąder interfazowych posiadało niski współczynnik

Pearsona i było to: 80,1% jąder w fazie G1, 77,2% w S i 85,2% w G2. Ujemny

współczynnik

kolokalizacji

charakteryzowało

10%

wszystkich

jąder

interfazowych (Ryc. 46).

100

120

140

160

180

0.0

2.3

4.6

6.9

9.2

11.5

13.8

ją

Całkowita intensywność DAPI (x10

)

Ryc. 45 Częstotliwość jąder o danej intensywności fluorescencji DAPI

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

łc

(

)

Liczba jąder

Ryc. 46 Liczba jąder interfazowych charakteryzujących się niskim (P<0,65)
lub wysokim (P>=0,65) współczynnikiem kolokalizacji Pearsona

Wyniki

Przedstwione wyniki dotyczące acetylacji histonów H3 i H4, wskazują na

różnice w acetylacji chromatyny jąder interfazowych, w zależności od

zastosowanego przeciwciała. W przypadku acetylacji H4K5 zdecydowana

większość jąder interfazowych charakteryzowała się wysoką acetylacją

w heterochromatynie konstytutywnej, podczas gdy acetylacja H4K16 była

obserwowana z podobną częstotliwością zarówno w chromocentrach, jak

i w euchromatynie. Zupełnie odwrotne wyniki uzyskano dla trzeciej analizowanej

modyfikacji – H3K18ac, gdzie w większości jąder sygnały wykryto tylko

w niewielkim stopniu w heterochromatynie konstytutywnej. Nie zaobserwowano

natomist większych różnic w acetylacji heterochromatyny w poszczególnych

fazach cyklu komórkowego. Sygnały fluorescencji przeciwciał przeciwko

acetylowanym histonom, były wykrywane w heterochromatynie z podobną

częstotliwością w fazie G1, S, czy G2 cyklu komórkowego.

4.8.

ODSUMOWANIE

celu

podsumowania

wyników

dotyczących

modyfikacji

epigenetycznych u gatunków Brassica, opisane powyżej dane przedstawiono

w tabeli 13.

Tab.13 Modyfikacje epigenetyczne w chromatynie jąder interfazowych

gatunków Brassica

Gatunek

Metylacja

Acetylacja

5‟mC

H3K4me2 H3K9me2 H3K9me3

H4K5

H4K16

H3K18

B. rapa

H/E

B. oleracea

H/E

H/E/J

H/E

B. napus

H/E

J/E

H/E

H – heterochromatyna konstytutywna/chromocentra, H

- głównie w heterochromatynie, E –

euchromatyna, J - jąderko

Analiza zamieszczonych wyników wskazuje na różnice w strukturze jąder

interfazowych oraz we wzorze modyfikacji chromatyny między gatunkami

diploidalnymi: B. rapa i B. oleracea. Gatunek allotetraploidalny cechuje się

Rycina 12

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z sondami CentBr1 i CentBr2 w jądrach

interfazowych gatunków Brassica

 A - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja

zielona – CentBr2

niebieska – DAPI

 B - B. rapa, forma uprawna, fluorescencja

czerwona - CentBr1

niebieska – DAPI

 C - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja

zielona – CentBr2

niebieska – DAPI

 D - B. oleracea, forma uprawna, fluorescencja

czerwona - CentBr1

niebieska – DAPI

 E - B. napus, forma uprawna, fluorescencja

zielona – CentBr2

niebieska – DAPI

 F - B. napus, forma uprawna, fluorescencja

czerwona - CentBr1

niebieska – DAPI

Skala - 5µm

Dyskusja

YSKUSJA

W niniejszej pracy przeprowadzono analizę modyfikacji genetycznych

i epigenetycznych u trzech gatunków Brassica: B. oleracea, B. rapa oraz

B. napus. W badaniach wykorzystywano zarówno formy uprawne, jak i formy

krótkiego cyklu. Formy RC są bardzo często wykorzystywane w licznych

badaniach z zakresu genetyki molekularnej, ze względu na to, iż posiadają krótki

cykl życiowy, a także mają swoje odpowiedniki w formach uprawnych. Uzyskane

wyniki badań wskazują, że obie formy gatunków Brassica różnią się między sobą

pod względem zmian genetycznych, mierzonych liczbą i lokalizacją genów

rRNA. Nie obserwowano natomiast u tych form, znaczących różnic w kontekście

modyfikacji epigenetycznych. Głównym założeniem pracy było porównanie

wzoru zmian epigenetycznych między gatunkami diploidalnymi oraz gatunkiem

allotetraploidalnym. Mimo, iż spodziewano się zaobserwować różnice we wzorze

modyfikacji epigenetycznych, wynikające z poziomu ploidalności, okazało się, że

największe zróżnicowanie cechuje gatunki diploidalne, a genom allotetraploida,

pod względem większości analizowanych modyfikacji, jest bardziej podobny do

genomu B. oleracea.

5.1.

ENY

rRNA

JAKO MARKER CHROMOSOMÓW

Liczba i położenie genów rRNA w genomie są zazwyczaj stałe dla danego

gatunku. Jednakże u niektórych gatunków, posiadających wiele loci rDNA, ich

liczba i lokalizacja mogą być zmienne. Zwiększenie liczby loci u gatunków

allotetraploidalnych może zachodzić na drodze translokacji fragmentu

chromosomu zawierającego locus rDNA do innego chromosomu, co jest

zjawiskiem dość powszechnie obserwowanym w ewolucji genomów roślinnych,

natomiast zmniejszenie liczby loci rDNA może odbywać się w wyniku delecji

Dyskusja

fragmentu zwierającego locus rDNA. W przypadku takich rearanżacji

chromosomowych nie dochodzi do zmiany liczby chromosomów, jednakże

zmienia się liczba i lokalizacja sekwencji rDNA w poszczególnych

chromosomach. U podstaw tego zjawiska leżą różnego rodzaju mechanizmy, takie

jak: przemiany strukturalne chromosomów, niesymetryczny crossing – over,

konwersja czy transpozycja genów (L

EITCH I

ESLOP

-H

ARRISON

1993;

ALL I

ARKER

1995;

HISHIDO I IN

2000;

ASTEROK I IN

2005).

Badania molekularne prowadzone na resyntetyzowanych gatunkach

allotetraploidalnych wskazują na występowanie intensywnych i szybkich

przemian w genomach tych mieszańców. U genomie B. napus potwierdzono

liczne rearanżacje, które najprawdopodobniej powodowane były niewzajemną

transpozycją pomiędzy chromosomami homeologicznymi (S

ONG I IN

1995).

Polimorfizm liczby loci genów rRNA może być powiązany z rearanżacjami

chromosomów w trakcie ewolucji. Taki mechanizm został zaproponowany przez

YSAKA I INNYCH

(2006), w rodzaju Arabidopsis, który wskazywał na rolę

specyficznych pericentrycznych inwersji i translokacji oraz eliminacji

fragmentów chromosomów.

Po raz pierwszy liczbę loci genów rRNA u gatunków rodzaju Brassica,

określili M

ALUSZYNSKA I

ESLOP

-H

ARRISON

(1993). Obserwowali oni pięć par

loci genów 25S rDNA u B. rapa oraz dwie większe i jedną mniejszą parę

u B. oleracea. Trzy pary loci genów 25S rRNA u B. oleracea obserwował

również A

RMSTRONG I INNI

(1998). Natomiast inne prace, donoszą o istnieniu

tylko dwóch par loci tych genów u B. oleracea (S

NOWDON I IN

1997

;

UKUI I

1998;

ASTEROK I

ALUSZYNSKA

2000

;

ASTEROK I IN

2001;

LI I IN

2005;

ASTEROK I IN

2006). U B. rapa 5 par loci genów 25S rRNA wykazali

w późniejszych badaniach H

ASTEROK I INNI

(2006).

W chromosomach

diploidalnych gatunków Brassica występują prócz genów 25S rRNA, również

geny 5S rRNA. H

ASTEROK I INNI

(2006) u B. rapa zlokalizowali 8 loci genów 5S

rRNA i 2 loci tych genów u B. oleracea. Natomiast A

LI I INNI

(2005) u B.

oleracea wyróżnili 2 chromosomy niosące po dwa loci genów 5S rRNA i 6

chromosomów z locus 5S rDNA u B. rapa. Nieco inaczej wyglądają wyniki badań

przedstawione przez S

NOWDOWN I INNI

(2002),

gdzie stwierdzono 3 pary loci 5S

rDNA u B. rapa i 1 parę u B. oleracea.

Dyskusja

Interesująco przedstawia się zagadnienie liczby loci genów rRNA

u allotetraploidalnego

B. napus. Liczba

chromosomów u gatunków

allotetraploidalnych

Brassica

jest równa sumie liczby chromosomów

odpowiednich ancestralnych gatunków diploidalnych (U,

1935), jednak liczba loci

rDNA nie zawsze jest równa sumie (M

ALUSZYNSKA I

ESLOP

-H

ARRISON

1993).

Dotychczasowe badania u B. napus wskazują na obecność 6 (M

ALUSZYNSKA I

ESLOP

-H

ARRISON

1993;

CHRADER I IN

2000;

NOWDON I IN

2000;

ASTEROK

ALUSZYNSKA

2000

), lub siedmiu (H

ASTEROK I IN

2001)

par loci genów 25S

rRNA oraz 5 par loci genów 5S rRNA (H

ASTEROK I IN

2006).

Natomiast

w niniejszej pracy u B. napus formy uprawnej zlokalizowano 5 lub 6 par loci 25S

rDNA oraz 5 par loci 5S rDNA, natomiast u formy RC 6 par loci 25S rDNA i 5

lub 6 par 5S rDNA.

Przedstwione wyniki badań potwierdzają występowanie polimorfizmu

wewnątrzgatunkowego genów rRNA u gatunków Brassica. Polimorfizm genów

rRNA wykazano również u wielu innych gatunków, między innymi u bawełny

ANSON I IN

1996), fasoli (G

ALASSO I IN

1995),

Arabidopsis (F

RANSZ I IN

1998),

czy też

koniczyny (A

NSARI I IN

1999).

Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami rDNA daje

możliwość identyfikowania wielu chromosomów, należących do genomów

ancestralnych, a przede wszystkim jest szczególnie ważna w analizie

allopoliploidalnych gatunków Brassica. Geny rRNA stanowią, nie tylko cenne

źródło markerów cytogenetycznych, pozwalających identyfikować poszczególne

chromosomy, ale także umożliwiają śledzenie przemian chromosomowych,

różnego rodzaju rearanżacji, które mają miejsce po procesie allopoliploidyzacji,

a także w trakcie ewolucji gatunków poliploidalnych.

5.2.

EKWENCJE CENTROMEROWE

Centromery badanych w pracy gatunków Brassica zbudowane są

z sekwencji tandemowo powtórzonych o długości 176 pz (L

IM I IN

2005). Na

podstawie badań filogenetycznych, wyróżniono dwie klasy sekwencji

centromerowych u Brassica: CentBr1 i CentBr2. Sekwencje centromerowe

należące do tych klas charakteryzują się około 85% homologią. L

IM I INNI

(2005)

Dyskusja

wykorzystali te sekwencje, jako sondy do FISH. U B. rapa sonda CentBr1

hybrydyzowała do 8 par chromosomów, natomiast CentBr2 do 2 par. Nieco

później L

IM I INNI

(2007) przeprowadzili hybrydyzację in situ z sondami CentBr1

i CentBr2 u pozostałych gatunków Brassica. Sonda CentBr1 hybrydyzowała z 8

parami chromosomów u B. rapa, 9 parami u B. oleracea i 17 parami u B. napus.

Natomiast CentBr2 z 2 parami chromosomów u B. rapa, 5 parami u B. oleracea

i 7 parami u B. napus.

Zastosowanie sond centromerowych do FISH u badanych w pracy

gatunków Brassica, wykazało różną liczbę sygnałów w chromosomach i jądrach

interfazowych w zależności od stosowanej siły płukań. Największe różnice

w stosunku do wyników otrzymanych przez L

IM I INNI

(2005,

2006),

zabserwowano dla sondy CentBr2, gdyż u badanych gatunków hybrydyzowała

ona z wszystkimi chromosomami. W niniejszej pracy zastosowano siłę płukań

wyższą, niż ta użyta przez L

‟

A I INNYCH

(2005),

a mimo to obserwowano

większą liczbę specyficznych sygnałów.

Sekwencje CentBr są zlokalizowane zarówno w funkcjonalnych

centromerach, jak i w heterochromatynie przycentromerowej (L

IM I IN

2005),

a liczba powtórzeń sekwencji 176 pz może różnić się w poszczególnych

chromosomach. Może to wpływać na generowanie różnej wielkości sygnałów

hybrydyzacyjnych, których wielkość jest pozytywnie skorelowana z liczbą

powtórzeń sekwencji 176 pz. Powoduje to, że trudniej jest wykryć sygnały

charakteryzujące się mniejszą intensywnością fluorescencji.

ARRISON I

ELSOP

-H

ARRISON

(1995) stwierdzili podobne zmiany

w liczbie loci dla sond centromerowych u diploidalnych gatunków Brassica,

w zależności od zastosowanej siły płukań. Różnice te tłumaczono, tym iż

poszczególne chromosomy mogą charakteryzować się nieco zróżnicowanymi

sekwencjami, mimo że należą one do tej samej klasy. Należy pamiętać przy tym,

iż współczesne gatunki diploidalne Brassica, są uznawane za paleopoliploidy.

Proces diploidyzacji, związany między innymi z eliminacją sekwencji

i rearanżacjami genomu, mógł także wpływać na liczbę kopii sekwencji

zlokalizowanych przycentromerowo.

Na liczbę sygnałów w jądrach interfazowych gatunków Brassica, może

mieć wpływ rozmieszczenie heterochromatyny. U gatunków Brassica obserwuje

się liczne małe domeny heterochromatyny przycentromerowej, która znajduje się

Dyskusja

w obszarach euchromatyny (L

IM I IN

2005), powoduje to, że struktura jąder

interfazowych wygląda nieco inaczej niż u A. thaliana, gdzie heterochromatyna

jest skupiona w obrębie chromocentrów. L

IM I INNI

(2005), wyróżnili cztery typy

jąder interfazowych u B. rapa: posiadające 20 wyraźnych chromocentrów,

posiadających mniej niż 12 chromocentrów i między 12, a 18 chromocentrów

oraz jądra z 20, ale silnie zdekondensowanymi chromocentrami. W niniejszej

pracy obserwowano, dekondensację części chromocentrów, co mogło być

związane z replikacją DNA w późnej fazie S cyklu komórkowego. U gatunków

diploidalnych najczęściej obserwowano 12-16 sygnałów w jądrach interfazowych

i były one zlokalizowane w obrębie dużych chromocentrów. Różnice

w lokalizacji i liczbie sygnałów dla sond centromerowych u gatunków Brassica

w komórkach merystematycznych mogą zależeć od fazy cyklu komórkowego,

a w zróżnicowanych również od poziomu endopoliploidalności.

5.3.

EMODELING CHROMATYNY

Zastosowanie technik immunobarwienia umożliwiło wykrycie i lokalizację

epigenetycznych modyfikacji chromatyny zarówno w chromosomach, jak

i jądrach interfazowych gatunków Brassica. Przedstawione wyniki badań

wskazują, iż gatunki Brassica mimo tego, że są ze sobą blisko spokrewnione, to

charakteryzują się zróżnicowanym wzorem metylacji DNA i modyfikacji

histonów. Największe różnice obserwowano pomiędzy gatunkami diploidalnymi,

natomiast gatunek allotetraploidalny cechował się wypadkową modyfikacji

obserwowanych u obu ancestorów. Takich różnic nie wykazano między dwiema

analizowanymi formami gatunków Brassica. Wzór modyfikacji epigenetycznych

w jądrach interfazowych przedstawiał się u nich podobnie.

Heterochromatyna konstytutywna cechuje się wysokim poziomem

metylacji DNA oraz H3K9me2, a także wykazuje niski poziom acetylacji

histonów H3 i H4. W niniejszej pracy wykazano, że typowe markery

heterochromatyny konstytutywnej zostały wykryte również poza wysoce

skondensowaną formą chromatyny. Modyfikacje te uważane są za

konserwatywne wyznaczniki heterochromatyny konstytutywnej, ale są obecne

również w wyciszonej transkrypcyjnie euchromatynie w wyniku złożonego

Dyskusja

procesu zwanego heterochromatynizacją (O

LSZEWSKA

2007). Typowa dla

euchromatyny dimetylacja H3K4 została zlokalizowana poza chromocentrami

w jądrach interfazowych gatunków Brassica. Natomiast ciekawie u badanych

gatunków, przedstawia się wzór acetylowanej lizyny 5. histonu H4. Niski poziom

acetylacji histonu H4 lub jej brak, związany jest z heterochromatyną

przycentromerową u wielu gatunków, podczas gdy u B. rapa zaobserwowano, że

chromocentra większości jąder interfazowych są wyraźnie wzbogacone o tę

modyfikację. Nie wykazano jednak by acetylacja H4K5 była skorelowana

z cyklem komórkowym, czyli replikacją heterochromatyny konstytutywnej

w późnej fazie S. Na podstawie uzyskanych w pracy wyników można

przypuszczać, że wysoki poziom acetylacji histonu H4 w heterochromatynie

konstytutywnej związany jest z procesem innym, niż wyłącznie replikacja DNA.

5.3.1.

Metylacja DNA

Wzór metylacji DNA u B. rapa wyglądał podobnie jak u A. thaliana.

ARIQ I INNI

(2003), wykorzystując immunobarwienie z przeciwciałami anty –

5‟mC wykazali, iż w jądrach interfazowych A. thaliana metylacja DNA

ograniczona jest do chromocentrów. B. rapa posiada stosunkowo mały genom

i heterochromatynę konstytutywną zlokalizowaną głównie w obrębie

chromocentrów w jądrach interfazowych, w przeciwieństwie do drugiego gatunku

diploidalnego – B. oleracea, gdzie metylację DNA wykrywano przede wszystkim

poza chromocentrami. Wzór metylacji DNA charakteryzował się bardziej

równomiernym rozmieszczeniem w jądrach interfazowych także u gatunku

allotetraploidalnego i był podobny do tego obserwowanego u B. oleracea.

Ciekawym, jest fakt, iż obserwowano dwa rodzaje jąder interfazowych

u B. napus. Większość charakteryzowała się mocniej metylowanymi

chromocentrami, jednak występowały też takie, w których nie stwierdzono

wyraźnego zróżnicowania w intensywności metylacji w całym jądrze

interfazowym. Może to wynikać, z faktu, iż analizowane jądra interfazowe mogą

pochodzić z różnego rodzaju komórek, między innymi z komórek epidermy.

U A. thaliana w epidermie korzenia komórki różnicują w dwa typy: trichoblasty

i atrichoblasty, los tych komórek jest ustalany już podczas embriogenezy, ale

także utrzymywany w trakcie rozwoju korzeni, w młodych siewkach. Proces ten

Dyskusja

kontrolowany jest poprzez ekspresję genu GL2, a ta ściśle związana jest ze

stanem chromatyny w locus tego genu (C

OSTA I

HAW

2006).

Epigenetyczne modyfikacje chromatyny odgrywają bardzo istotną rolę

w rozwoju u roślin. Ta regulacja może dotyczyć poszczególnych genów, ale także

przejawiać się w sposób bardziej „globalny”, na poziomie chromatyny jąder

interfazowych. Ostatnie badania T

ESSADORI I INNYCH

(2007

), wskazują, iż

podczas przejścia w fazę generatywną, obserwuje się zmiany we wzorze metylacji

DNA w jądrach interfazowych u A. thaliana. Sygnały anty-5‟mC w jądrach

interfazowych roślin zakwitających, były rozproszone, w przeciwieństwie do

intensywnie

metylowanych, skondensowanych chromocentrów u roślin

niekwitnących. Podobną sytuację zaobserwowano dla loci 5S rDNA oraz

sekwencji transpozonowych, które ulegały rozproszeniu podczas zakwitania.

ATHIEU

INNI

(2003)

obserwowali z kolei zmiany w organizacji

heterochromatyny podczas rozwoju siewek A. thaliana. Porównywano wzór

metylacji DNA w jądrach interfazowych u roślin dwudniowych, czterodniowych

oraz trzytygodniowych. Okazało się, że u roślin najmłodszych sygnały anty-5‟mC

były rozproszone w jądrach interfazowych, w przeciwieństwie do roślin starszych,

gdzie metylację DNA zlokalizowano głównie w obszarze chromocentrów.

Rozproszone sygnały metylacji DNA wykryto również w kulturach protoplastów

u A. thaliana. Wykonując pomiar intensywności fluorescencji przeciwciała anty –

5‟mC z całego obszaru jąder interfazowych, nie stwierdzono znacznych zmian

w poziomie metylacji DNA w protoplastach, w porównaniu do komórek mezofilu

pochodzących z liści. Wyniki tych badań sugerują, iż w protoplastach dochodzi

do znacznej redukcji zawartości heterochromatyny w chromocentrach, co jest

związane z dekondensacją sekwencji powtarzalnych, w tym także sekwencji

centromerowych. Jednak ta dekondensacja nie jest powodowana znacznymi

zmianami w ogólnym poziomie metylacji DNA (T

ESSADORI I IN

2007

U gatunków Brassica metylację DNA analizowano również

w chromosomach mitotycznych, w stadium metafazy oraz w chromosomach

pachytenowych. Ze względu na niewielkie rozmiary chromosomów

metafazowych, nie wyodrębniono u gatunków Brassica specyficznego wzoru

prążkowego, związanego z metylacją cytozyny. U B. napus zauważono

charakterystyczny wzór immunobarwienia, gdzie część chromosomów posiadała

znacznie intensywniejsze sygnały anty – 5‟mC. Podobne badania przeprowadzono

Dyskusja

u pszenżyta (C

ASTILHO I IN

1999). Nie stwierdzono by homologiczne pary

chromosomów wykazywały podobny wzór metylacji DNA u tego gatunku. Nie

wykazano także korelacji między zmetylowanymi prążkami, a sekwencjami

centromerowymi, telomerowymi, czy też rDNA. U pszenżyta przeprowadzono

GISH w celu odróżnienia chromosomów żyta i pszenicy, nie wykazano jednak

odmiennego wzoru metylacji DNA w tych chromosomach. U B. napus GISH nie

daje satysfakcjonujących wyników, ze względu na wysoką homeologię między

genomami

ancestralnymi

NOWDON

1997

Immonobarwienie

przeprowadzone na chromosomach pachytenowych, które dają możliwość

dokładniejszej lokalizacji sygnałów, wykazało z kolei nierównomierną

dystrybucję sygnałów anty – 5‟mC. W tym stadium mejozy w chromosomach

widoczne są struktury, silnie barwiące się DAPI, są to tzw. chromomery

RMSTRONG I

ONES

2003;

LI I IN

2004;

HI I

AWE

2006). Silne sygnały

metylacji DNA zlokalizowano w chromomerach, podczas gdy pomiędzy tymi

strukturami były one nie obecne.

Mimo, że stwierdzono różnice we wzorze metylacji DNA między

gatunkami Brassica, okazało się, że poziom metylacji DNA jest u nich podobny.

Gatunek allotetraploidalny charakteryzował się zbliżonym poziomem metylacji,

do gatunków diploidalnych, przy czym u formy uprawnej ilość metylowanych

cytozyn u B. napus mieściła się w podobnym przedziale jak u B. oleracea,

a u formy RC jak u B. rapa. Zaobserwowano także nieznaczne różnice

w poziomie metylacji DNA między dwiema analizowanymi formami danego

gatunku.

Technika MSAP z powodzeniem jest stosowana do analizy poziomu

metylacji DNA u różnych gatunków roślin. Umożliwia ona przeprowadzenie

analizy na stosunkowo dużych populacjach i mimo tego, iż jest czasochłonna, to

daje powtarzalne wyniki. C

ERVERA I INNI

(2002) wykorzystali tę metodę do

porównania poziomu metylacji DNA u różnych ekotypów Arabidopsis. Poziom

metylacji DNA wynosił od 34,7% u ekotypu „Copenhagen” do 43,3% u „Cape

Verde Islands”. Podobny poziom metylacji DNA stwierdzono u badanych

w pracy gatunków Brassica, które należą do tej samej rodziny, co Arabidopsis.

Technika ta posłużyła do określenia poziomu metylacji DNA u wielu gatunków

roślin, między innymi u banana (B

AURENS I IN

2003),

jabłoni (X

U I IN

2000;

I I

2002

czy też

palmy oleistej (J

ALIGOT I IN

2004).

Technikę MSAP

Dyskusja

wykorzystano w badaniach poziomu metylacji DNA u resyntetyzowanych

B. napus. Badania te wskazują na istnienie zmian w poziomie metylacji DNA

u gatunków allopoliploidalnych, w porównaniu z gatunkami rodzicielskimi.

U resyntetyzowanych B. napus reakcje MSAP przeprowadzono na cDNA,

wykorzystując między innymi startery RFLP i SSR. W pracy tej pokazano, że

metylacja „de novo” była charakterystyczna dla fragmentów pochodzących

z genomu B. rapa, natomiast wśród homeologów B. oleracea wykryto zarówno

„de novo” metylację, jak i demetylację (L

UKENS I IN

2006). Podobne badania

przeprowadził G

AETA I INNI

(2007), analizie MSAP poddano ponad 50 linii

resytetyzowanych B. napus, a zmiany w poziomie metylacji porównywano

w przeciągu pięciu kolejnych pokoleń. Stwierdzono, iż wzór metylacji DNA

w pokoleniu S0 jest, z wyjątkiem niewielkich zmian, utrwalony w pokoleniu S5.

W pracy dokonano zbiorczej analizy metylacji występującej w obu

cytozynach w sekwencji CCGG. Wynikało to z faktu, iż w większości

przypadków obserwowano metylację wewnętrznej cytozyny, natomiast

stosunkowo rzadko hemimetylację zewnętrznej cytozyny. Wyniki te są zgodne

z wcześniejszymi doniesieniami X

U I INNYCH

(2000)

I I INNYCH

(2002

), którzy

wskazują, iż większość obserwowanych fragmentów EcoRI/HpaII może być

wynikiem metylacji w wewnętrznej cytozynie. Fragmenty te generowane są na

skutek niedocięcia sekwencji przez enzym MspI, a dopiero później, cięcia

enzymem HpaII. Najwięcej takich fragmentów obserwowano w górnych partiach

żelu, gdzie znajdowały się fragmenty największe, stąd można wnioskować, iż

wzór prążków odnosił się do fragmentów powstałych po cięciu trzema enzymami:

EcoRI/MspI/HpaII i jest w rezultacie efektem metylacji cytozyny wewnętrznej,

a nie hemimetylacji cytozyny zewnętrznej.

5.3.2.

Modyfikacje histonów

Stosunkowo dobrze poznaną modyfikacją epigenetyczną u roślin, jest

metylacja histonów. W pracy badano metylację lizyny 4. i 9. histonu H3.

Podobnie, jak w przypadku metylacji DNA, zaobserwowano pewne tendencje we

wzorze metylacji histonu H3, u trzech analizowanych gatunków Brassica.

Dimetylację H3K4 w jądrach interfazowych tych gatunków zlokalizowano

w obszarze euchromatyny, natomiast nie wykryto sygnałów anty – H3K4

Dyskusja

w heterochromatynie konstytutywnej. Wzór metylacji H3K4 jest konserwatywny

pomiędzy różnymi gatunkami roślin. U Arabidopsis, jęczmienia, bobu

i kukurydzy ta modyfikacja jest ewidentnym markerem euchromatyny (S

OPPE I

2002;

ASENCAKOVA I IN

2003;

ARIQ I IN

2003;

UCHS I IN

2006;

HI I

AWE

2006). Podobnie jest z resztą u innych eukariontów: drożdży (N

OMA I IN

2001) myszy (T

ERRANOVA I IN

2006), czy Drosophila (B

EISEL I IN

2002;

ENNEY I IN

2006).

Wzór dimetylacji lizyny 9. histonu H3 różnił się pomiędzy gatunkami

Brassica. U B. rapa modyfikacja ta była wykrywana w heterochromatynie,

zlokalizowanej w chromocentrach, natomiast u dwóch pozostałych gatunków,

również poza chromocentrami. Różnice te mogą wynikać ze sposobu

rozmieszczenia heterochromatyny w genomach o różnej wielkości. H

OUBEN I INNI

(2003), opisali lokalizację metylacji H3K9 w jądrach interfazowych, w zależności

od wielkości genomu, czyli zawartości jądrowego DNA. Według założeń

Houbena, gatunki, które posiadają genom wielkości do około 500 Mpz na 1C,

charakteryzują się metylacją H3K9 w obrębie chromocentrów, natomiast

u gatunków o genomach większych, tę modyfikację wykrywa się również

w euchromatynie. U B. rapa wielkość genomu wynosi około 529 Mpz (na 1C

DNA), podczas gdy u pozostałych dwóch gatunków, ponad 696 Mpz dla

B. oleracea i 1132 dla B. napus (J

OHNSTON I IN

2005). Koncepcja Houbena,

wydaje się więc słuszna także w przypadku analizowanych gatunków Brassica.

thaliana

(160

Mpz/1C)

dimetylacja

H3K9

jest

wykrywana

w chromocentrach, natomiast u V. faba (740 Mpz/1C) przeciwciała anty –

H3K9me2 zlokalizowane są równomiernie w całej chromatynie jąder

interfazowych (F

UCHS I IN

2006). Dimetylacja H3K9 jest uważna u wielu

gatunków za klasyczny marker heterochromatyny konstytutywnej. Z kolei

u kukurydzy H3K9me2 zlokalizowano głównie pomiędzy chromomerami

w chromosomach pachytenowych, co wskazywałoby, że ta modyfikacja jest

u tego gatunku związana z obszarami euchromatynowymi. Natomiast markerem

heterochromatyny u kukurydzy jest dimetylacja H3K27 (S

HI I

AWE

2006).

Interesująco przedstawia się wzór trimetylacji H3K9 w jądrach

interfazowych gatunków Brassica. Uzyskane wyniki wskazują na brak

kolokalizacji przeciwciał anty – H3K9me3 z heterochromatyną konstytutywną

u wszystkich badanych gatunków Brassica. Większość sygnałów wykrywano

Dyskusja

w jąderku, natomiast nie obserwowano ich w chromocentrach. J

ACKSON I INNI

(2004), stosując różne przeciwciała anty – H3K9me3, nie wykazali, by

heterochromatyna chromocentrów u A. thaliana była wzbogacona w trimetylację

lizyny 9. Stwierdzono natomiast, iż wykorzystywane w badaniach przeciwciała

charakteryzują się reaktywnością z innymi białkami niehistonowymi. Specyficzna

lokalizacja H3K9me3 w jąderku może być powiązana z regulacją aktywności

genów rRNA. Z badań prowadzonych u bobu, jęczmienia i A. thaliana wiadomo,

iż trimetylacjia H3K9 jest związana z euchromatyną u tych gatunków (F

UCHS I

2006).

Wyniki badań przeprowadzone w ostatnich latach u różnych gatunków

roślin wskazują, że na strukturę chromatyny istotny wpływ ma proces acetylacji

histonów korowych. W niniejszej pracy analizowano wzór acetylacji histonów H3

i H4 w jądrach interfazowych gatunków Brassica. Wyniki badań wskazywały, iż

wzór acetylacji poszczególnych lizyn danego histonu, różni się w jądrach

interfazowych danego gatunku, a modyfikacja ta jest wykrywana w eu- lub/i

heterochromatynie. W przypadku acetylacji H4K5 zdecydowana większość jąder

interfazowych charakteryzowała się wysoką acetylacją w chromocentrach,

podczas gdy acetylacja H4K16 była obserwowana z podobną częstotliwością

zarówno w chromocentrach, jak i w euchromatynie. Zupełnie odwrotne wyniki

uzyskano dla trzeciej analizowanej modyfikacji – H3K18ac, gdzie w większości

jąder sygnały wykryto tylko w niewielkim stopniu w heterochromatynie

konstytutywnej.

ASENCKOVA I INNI

(2000) badali wzór acetylacji histonu H4 w jądrach

interfazowych bobu, w zależności od fazy cyklu komórkowego. Wydzielono kilka

typów wzoru acetylacji, które były charakterystyczne dla jąderka,

chromocentrów, lub euchromatyny. Badania prowadzono na posortowanych

jądrach interfazowych, w fazach: G1, S i G2. Wyniki tej analizy wskazują, iż

wzór acetylacji H4 w eu-, lub heterochromatynie jest skorelowany z replikacją

DNA. Acetylacja H4K5 w chromocentrach była wykrywana w późnej fazie S

i w G2, natomiast w euchromatynie głównie w środkowej fazie S.

U analizowanych gatunków Brassica acetylację H4K5 zlokalizowano w obrębie

chromocentrów, a w części jąder również w euchromatynie. Sygnały anty –

H4K5ac wykrywano w heterochromatynie konstytutywnej we wszystkich fazach

interfazy u gatunków Brassica. Podobną zależność wzoru acetylacji od

Dyskusja

poszczególnych faz w interfazie, dla lizyny 16. histonu H4 obserwowali

ASENCKOVA I INNI

(2000). Należy jednak zaznaczyć, że acetylacja H4K16

w chromocentrach była wykrywana w przeważającej części jąder w fazie G2 –

50%, jak również w G1 – 15%. U B. rapa w fazach S i G2 liczba jąder, gdzie

stwierdzono wysoką kolokalizację sygnałów anty – H4K16 z heterochromatyną

konstytutywną była podobna do tych o niskiej kolokalizacji. Nieco mniej

natomiast obserwowano jąder o wysokiej kolokalizacji w fazie G1. Różnica

w acetylacji H4K16 w chromocentrach pomiędzy poszczególnymi fazami nie była

tak wyraźna u B. rapa jak w przypadku Vicia faba. U A. thaliana acetylację

H4K16 i H3K18 w chromocentrach, zlokalizowano w jądrach interfazowych

w późnej fazie S oraz G i znacznie rzadziej w fazie G1 (J

ASENCAKOVA I IN

2003).

Odmienne wyniki uzyskano dla acetylacji H3K18 u bobu, gdzie jądra

interfazowe charakteryzowały się równomiernym rozmieszczeniem sygnałów

anty – H3K18 w całej chromatynie oraz dla acetylacji H4K5 u A. thaliana, gdzie

sygnały zlokalizowane były głównie w euchromatynie w trakcie całej interfazy

ASENCAKOVA I IN

2003).

Mimo dużego podobieństwa w organizacji chromatyny w jądrze

interfazowym u B. rapa i A. thalina, wyniki przedstawione w niniejszej pracy nie

potwierdzają jednoznacznie, by acetylacja histonów H3 i H4 u Brassica była

powiązana bezpośrednio z replikacją DNA. Mimo, że obserwowano

zróżnicowany wzór acetylacji w poszczególnych jądrach u B. rapa nie powiązano

określonych wzorów z poszczególnymi fazami interfazy.

Modyfikacje histonów są konserwatywne u różnych grup organizmów.

Jednakże wpływ tych modyfikacji na strukturę chromatyny może być

zróżnicowany. Wiadomo, że przyłączenie różnej liczby grup metylowych do

lizyny 9. ma zupełnie inny efekt u poszczególnych gatunków, czyli prowadzi do

powstania hetero- bądź euchromatyny. Liczne badania przeprowadzone

w ostatnich latach jednoznacznie wskazują, że poszczególne modyfikacje

epigenetyczne są od siebie ściśle uzależnione. W świetle tych badań powstaje

model, który wskazuje na powiązanie metylacji DNA, metylacji i acetylacji

histonów, wiązania białka LHP1 oraz wpływu siRNA na regulację struktury

chromatyny. Te liczne powiązania modyfikacji epigenetycznych określane są

mianem „remodelingu chromatyny”. Termin ten przez wielu autorów używany

Wnioski

NIOSKI

Uzyskane w pracy wyniki pozwalają na wyciągnięcie następujących wniosków:

1. Jądra interfazowe badanych gatunków różnią się strukturą chromatyny.

B. rapa i B. napus charakteryzują się wyraźnie zaznaczonymi

chromocentrami, natomiast w jądrach interfazowych B. oleracea nie

zawsze występują typowe chromocentra.

2. Modyfikacje genetyczne, mierzone liczbą i lokalizacją loci genów rRNA,

wykazały istnienie polimorfizmu wewnątrzgatunkowego.

3. Zastosowane w pracy sondy centromerowe nie są gatunkowo –

specyficzne i w zależności od warunków in situ hybrydyzują z różną

liczbą chromosomów u wszystkich badanych gatunków.

4. Zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciwko zmodyfikowanym

histonom i DNA pozwala wykryć i lokalizować modyfikacje

epigenetyczne w chromosomach i jądrach interfazowych gatunków

Brassica.

5. Gatunki diploidalne Brassica różnią się między sobą wzorem modyfikacji

epigenetycznych, natomiast gatunek allotetraploidalny charakteryzuje się

wzorem modyfikacji, podobnym do tego obserwowanego u B. oleracea.

6. Formy uprawne i RC badanych gatunków Brassica nie różnią się wzorem

modyfikacji epigenetycznych w jądrach interfazowych.

7. Badane gatunki różnią się między sobą wzorem metylacji DNA, przy

czym poziom metylacji DNA jest podobny u wszystkich analizowanych

gatunków.

8. Dimetylacja H3K4 jest charakterystyczna dla euchromatyny u gatunków

Brassica,

natomiast

dimetylacja

H3K9

występuje

zarówno

w euchromatynie, jak i w heterochromatynie.

Streszczenie

TRESZCZENIE

W niniejszej pracy przedstawiono analizę zmian genetycznych

i epigenetycznych w genomach trzech gatunków z rodzaju Brassica. Badaniami

objęto formę uprawną i RC dwóch diploidalnych gatunków: B. oleracea i B. rapa

oraz gatunku allotetraploidalnego B. napus.

Większość badań prowadzono na jądrach interfazowych, dla których

wykazano różnice w rozmieszczeniu heterochromatyny u poszczególnych

gatunków Brassica. Jądra interfazowe B. rapa i B. napus charakteryzowały się

wyraźnie zaznaczonymi chromocentrami, przeważnie o zróżnicowanej wielkości,

natomiast u B. oleracea w części jąder nie występowały typowe chromocentra.

Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami rDNA

potwierdziło występowanie polimorfizmu wewnątrzgatunkowego genów rRNA.

Analiza rozmieszczenia sekwencji centromerowych w chromosomach i jądrach

interfazowych gatunków Brassica, wykazała, że sondy CentBr nie są gatunkowo-

specyficzne i w zależności od warunków in situ hybrydyzują z różną liczbą

chromosomów.

Głównym założeniem pracy było porównanie zmian epigenetycznych

w genomach gatunków Brassica. Uzyskane wyniki wskazywały, iż największe

różnice we wzorze metylacji DNA i histonu H3 cechują gatunki diploidalne,

natomiast B. napus posiada wzór tych modyfikacji bardziej podobny do

występującego u B. oleracea. Nie wykazano natomiast istotnych różnic we

wzorze metylacji w jądrach interfazowych, pomiędzy formami uprawnymi i RC

gatunków Brassica. Analiza poziomu metylacji DNA z wykorzystaniem techniki

MSAP wykazała, że badane gatunki nieznacznie różnią się poziomem metylacji

DNA, który oscyluje w granicach 30-40% procent u poszczególnych gatunków.

Interesujące wyniki otrzymano w wyniku analizy wzoru acetylacji

histonów H3 i H4 w jądrach interfazowych. U wszystkich badanych gatunków

obserwowano zróżnicowny wzór acetylacji. W części jąder interfazowych sygnały

Streszczenie

były wykrywane w heterochromatynie konstytutywnej, natomiast w pozostałych

jądrach w euchromatynie, lub zarówno w eu- jak i w heterochromatynie.

Modyfikację tę badano również z wykorzystaniem, pionierskiej u roślin, analizy

w cystometrii obrazowej. Okazało się, że poziom acetylacji H4K5, H4K16

i H3K18 w heterochromatynie konstytutywnej nie zmienia się w cyklu

komórkowym. Zaobserwowano jednak pewne różnice we wzorze acetylacji

histonów H3 i H4. W przypadku acetylacji H4K5 większość jąder interfazowych

charakteryzowała się wysoką acetylacją w chromocentrach, podczas gdy

acetylacja H4K16 była obserwowana z podobną częstotliwością zarówno

w chromocentrach, jak i w euchromatynie. Zupełnie inaczej wyglądała acetylacja

H3K18, gdzie w większości jąder sygnały wykryto tylko w euchromatynie.

Przedstawione wyniki badań wskazują, iż gatunki Brassica mimo tego, że

są ze sobą blisko spokrewnione, to charakteryzują się zróżnicowanym wzorem

metylacji DNA i modyfikacji histonów. Największe różnice obserwowano

pomiędzy gatunkami diploidalnymi, natomiast gatunek allotetraploidalny

cechował się wypadkową modyfikacji obserwowanych u obu ancestorów.

Literatura

ITERATURA

Abbott R, Lowe A. 2004. Origins, establishment and evolution of new polyploid

species: Senecio cambrensis and S. eboracensis in the British Isles. Biol J

Linn Soc 82: 467-474

Adams KL, Cronn R, Percifield R, Wendel F. 2003. Genes duplicated by

polyploidy show unequal contributions to the transcriptome and organ-

specific reciprocal silencing. PNAS 100: 4649-4654

Adams KL, Percifield R, Wendel JF. 2004. Organ-specific silencing of

duplicated genes in a newly synthesized cotton allotetraploid. Genetics

168: 2217-26

Ainouche ML, Baumel A, Salmon A. 2004. Spartina anglica C. E. Hubbard: a

natural model system for analysing early evolutionary changes that affect

allopolyploid genomes. Biol J Linn Soc 82: 475-484

Ali BM, Lysak M, Schubert I. 2004. Genomic in situ hybridization in plants

with small genomes is feasible and elucidates the chromosomal parentage

in interspecific Arabidopsis hybrids. Genome 47: 954-960

Ali BM, Lysak MA, Schubert I. 2005. Chromosomal localization of rDNA in

the Brassicaceae. Genome 48: 341-346

Ansari HA, Ellison NW, Reader SM, Badaeva ED, Friebe B, Miller TE,

Williams WM. 1999. Molecular cytogenetic organization of 5S and 18S-

26S rDNA loci in white clover (Trifolium repens L.) and related species.

Ann Bot 83: 199-206

Armstrong S, Fransz P, Marshall D, Jones G. 1998. Physical mapping of DNA

repetitive sequences to mitotic and meiotic chromosomes of Brassica

oleracea var. alboglabra by fluorescence in situ hybridization. Heredity

81: 666-673

Armstrong SJ, Jones G. 2003. Meiotic cytology and chromosome behaviour in

wild-type Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany 54: 1-10

Literatura

Aufsatz W, Mette F, Van der Winden J, Matzke A, Matzke M. 2002. RNA-

directed DNA methylation in Arabidopsis. PNAS 99: 16499-16506

Bastow R, Mylne JS, Lister C, Lippman Z, Martienssen RA, Dean C. 2004.

Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation.

Nature 427: 164-167

Baumel A, Ainouche ML, Levasseur J. 2001. Molecular investigations in

populations of Spartina anglica C.E. Hubbard (Poaceae) invading coastal

Brittany (France). Molecular Ecology 10: 1689-1701

Baurens F, Bonnot F, Bienvenu D, Causse S, Legavre T. 2003. Using SD-

AFLP and MSAP to Assess CCGG Methylation in the Banana Genome.

Plant Mol Biol Rep 21: 339-348

Beisel C, Imhof A, Greene J, Kremmer E, Sauer F. 2002. Histone methylation

by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1. Nature 419:

857-862

Belyaev ND, Houben A, Baranczewski P, Schubert I. 1998. The acetylation

patterns of histones H3 and H4 along Vicia faba chromosomes are

different. Chromosome Res. 6: 59-63

Belyayev A, Raskina O, Korol A, Nevo E. 2000. Coevolution of A and B

genomes in allotetraploid Triticum dicoccoides. Genome 43: 1021-6

Bender J. 2004. DNA methylation and epigenetics. Annu Rev Plant Biol 55: 41-

Berg A, Meza TJ, Mahic M, Thorstensen T, Kristiansen K, Aalen RB. 2003.

Ten members of the Arabidopsis gene family encoding methyl-CpG-

binding domain proteins are transcriptionally active and at least one,

AtMBD11, is crucial for normal development. Nucleic Acids Res 31:

5291–5304

Bharti K, Von Koskull-Doring P, Bharti S, Kumar P, Tintschl-Korbitzer A,

Treuter E, Nover L. 2004. Tomato heat stress transcription factor HsfB1

represents a novel type of general transcription coactivator with a histone-

like motif interacting with the plant CREB binding protein ortholog

HAC1. Plant Cell 16: 1521-35

Brysting A, Holst-Jensen A, Leitch IJ. 2000. Genomic origin and organization

of the hybrid Poa jemtlandica (Poaceae) verified by genomic in situ

hybridization and chloroplast DNA sequences. Ann Bot 85: 439-445

Literatura

Cao X, Jacobsen SE. 2002. Role of the Arabidopsis DRM methyltransferases in

de novo DNA methylation and gene silencing. Curr Biol 13: 1138-44

Caro E, Castellano M, Gutierrez C. 2007. A chromatin link that couples cell

division to root epidermis patterning in Arabidopsis. Nature 447: 213-217

Castilho A, Neves N, Rufini-Castaglione M, Viegas W, Heslop-Harrison JS.

1999. 5-methylcytosine distribution and genome organization in Triticale

before and after treatment with 5-azacytidine. Cell Sci 112: 4397-4404

Cervera MT, Ruiz-Garcia L, Martinez-Zapater JM. 2002. Analysis of DNA

methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP

markers. Mol Genet Genomics 286: 543-552

Chen BY, Heneen WK. 1991. The basic number of Brassica genomes: x=3?

Cruciferae Newsletter 14/15: 20-21

Chen ZJ, Pikaard CS. 1997

. Epigenetic silencing of RNA polymerase I

transcription: a role for DNA methylation and histone modification in

nucleolar dominance. Genes Dev 11: 2124-36

Chen Z, Pikaard CS. 1997

. Transcriptional analysis of nucleolar dominance in

polyploid plants: Biased expressionysilencing of progenitor rRNA genes is

developmentally regulated in Brassica. PNAS 94: 3442-3447

Chen J, Comai L, Pikaard CS. 1998. Gene dosage and stochastic effects

determine the severity and direction of uniparental ribosomal RNA gene

silencing (nucleolar dominance) in Arabidopsis allopolyploids. PNAS 95:

14891-14896

Chen ZJ, Tian L. 2007. Roles of dynamic and reversible histone acetylation in

plant development and polyploidy. Biochim Biophys Acta 1769: 295-307

Cheng BF, Heneen WK, Chen BY. 1994. Meiotic studies on a Brassica

campestris - alboglabra monosomic addition line and derived B.

campestris primary trisomics. Genome 37: 584-589

Choi S, Creelman RA, Mullet JE, Wing RA. 2000. Construction and

characterization of bacterial artificial chromosome library of Arabidopsis

thaliana. Plant Mol Biol Rep 13: 124-128

Comai L, Tyagi AP, Winter K, Holmes-Davis R, Reynolds SH, Stevens Y,

Byers B. 2000. Phenotypic instability and rapid gene silencing in newly

formed Arabidopsis allotetraploids. Plant Cell 12: 1551-68

Literatura

Costa S, Shaw P. 2006. Chromatin organization and cell fate switch respond to

positional information in Arabidopsis. Nature 439: 493-496

Cuadrado A, Ceoloni C, Jouve N. 1995. Variation in highly repetitive DNA

composition of heterochromatin in rye studied by fluorescence in situ

hybridization. Genome 38: 1061-1069

Cuadrado A, Jouve N. 1997. Distribution of highly repeated DNA sequences in

species of the genus Secale. Genome 40: 309-317

Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities

of fresh leaftissue. Phytochem Bull 19: 11-15

Feldman M, Liu B, Segal G, Abbo S, Levy AA, Vega JM. 1997. Rapid

elimination of low-copy DNA sequences in polyploid wheat: a possible

mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes. Genetics

147: 1381-7

Finnegan EJ, Kovac KA. 2000. Plant DNA methyltransferases. Plant Mol Biol

43: 189-201

Finnegan EJ. 2002. Epialleles - a source of random variation in times of stress.

Curr Opin Plant Biol 5: 101-6

Finnegan E, Kovac K, Jaligot E, Sheldon C, Peacock J, Dennis E. 2005. The

downregulation of Flowering Locus C (FLC) expression in plants with low

levels of DNA methylation and by vernalization occurs by distinct

mechanisms. Plant J 44: 420-432

Fransz P, Armstrong S, Alonso-Blanco C, Fischer TC, Torres-Ruiz RA,

Jones G. 1998. Cytogenetics for the model system of Arabidopsis

thaliana. Plant J 13: 867-876

Fransz P, Armstrong S, DeJong H, Parnell L, Van Drunen C, Dean C, Zabel

P, Bisseling T, Jones G. 2000. Integrated cytogenetic map of chromosome

arm

Arabidopsis

thaliana:

structural

oraganization

heterochromatic knob and centromere region. Cell 100: 367-376

Fransz P, Soppe W, Schubert I. 2003. Heterochromatin in interphase nuclei of

Arabidopsis thaliana. Chromosome Res 11: 227-240

Frieman M, Chen Z, Saez-Vasquez J, Shen A, Pikaard CS. 1999. RNA

polymerase I transcription in a Brassica interspecific hybrid and its

progenitors: tests of transcription factor involvement in nucleolar

dominance. Genetics 152: 451-460

Literatura

Fuchs J, Demidov D, Houben A, Schubert I. 2006. Chromosomal histone

modification patterns - from conservation to diversity. Trends in Plant

Science 11: 199-208

Fukui K, Nakayama S, Ohmido N, Yoshiaki H, Yamabe M. 1998. Quantitative

karyotyping of three diploid Brassica species by imaging methods and

localization of 45s rDNA loci on the identified chromosomes. Theor Appl

Genet 96: 325-330

Gaeta R, Pires JC, Iniguez-Luy F, Leon E, Osborn TC. 2007. Genomic

changes in resynthesized Brassica napus and their effect on gene

expression and phenotype. Plant Cell 19: 3403-3417

Galasso I, Schmidt T, Pignone D, Heslop-Harrison JS. 1995. The molecular

cytogenetics of Vigna unguiculata (L.) Walp: the physical organization

and characterization of 18S-5.8S-25S rRNA genes, 5S rRNA genes,

telomere-like sequences, and a family of centromeric repetitive DNA

sequences. Theor Appl Genet 91: 928-935

Gaudin V, Libault M, Pouteau S, Juul T, Zhao G, Lefebvre D, Grandjean O.

2001. Mutations in Like Heterochromatin Protein 1 affect flowering time

and plant architecture in Arabidopsis. Development 128: 4847-58

Gaut B, Doebley J. 1997. DNA sequence evidence for the segmental

allotetraploid origin of maize. PNAS 94: 6809-6814

Gendall A, Levy Y, Wilson A, Dean C. 2001. The Vernalization 2 gene mediates

the epigenetic regulation of vernalization in Arabidopsis. Cell 107: 525-

535

Gerlach WL, Dyer TA. 1980. Sequence organization of the repeating units in the

nucleus of wheat which contain 5S rRNA genes. Nucleic Acids Res 8:

4851-65

Gernand D, Demidov D, Houben A. 2003. The temporal and spatial pattern of

histone H3 phosphorylation at serine 28 and serine 10 is similar in plants

but differs between mono- and polycentric chromosomes. Cytogenet

Genome Res 101: 172-6

Grant D, Cregan P, Shoemaker RC. 2000. Genome organization in dicots:

genome duplication in Arabidopsis and synteny between soybean and

Arabidopsis. PNAS 97: 4168-4173

Literatura

100

Grossniklaus U, Spillane C, Page D, Köhler C. 2001. Genomic imprinting and

seed development: endosperm formation with and without sex. Curr Opin

Plant Biol 4: 21-27

Hajdera I, Siwinska D, Hasterok R, Maluszynska J. 2003. Molecular

cytogenetic analysis of genome structure in Lupinus angustifolius and

Lupinus cosentinii. Theor Appl Genet 107: 988-96

Hall KJ, Parker JS. 1995. Stable chromosome fission associated with rDNA

mobility. Chromosome Res 3: 417-422

Han F, Fedak G, Guo W, Liu B. 2005. Rapid and repeatable elimination of a

parental genome-specific DNA repeat (pGc1R-1a) in newly synthesized

wheat allopolyploids. Genetics 170: 1239-45

Hanson RE, Islam-Faridi MN, Percival EA, Crane CF, Ji Y, McKnight TD,

Stelly DM, Price HJ. 1996. Distributions of 5S and 18S-28S rDNA loci in

a tetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.) and its putative diploid

ancestors. Chromosoma 105: 55-61

Harrison GE, Heslop-Harrison JS. 1995. Centromeric repetitive DNA

sequences in the genus Brassica. Theor Appl Genet 90: 157-165

Hasterok R, Małuszyńska J. 1997. Analiza cytogenetyczna wybranych

gatunków Brassica. Hodowla Roślin, materiały z I Krajowej konferencji,

Poznań

Hasterok R, Maluszynska J. 1998. Sequential silver staining and FISH – their

use to distinguish active and inactive rRNA genome loci. In: Plant

Cytogenetics, Maluszynska J (Ed). Wyd. Uniwersytetu Śląskiego,

Katowice, pp. 168-172

Hasterok R, Maluszynska J. 2000. Nucleolar dominance does not occur in root

tip cells of allotetraploid Brassica species. Genome 43: 574-9

Hasterok R, Maluszynska J. 2000

. Cytogenetic analysis of diploid Brassica

species. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 42: 145-163

Hasterok R, Maluszynska J. 2000

. Cytogenetic markers of Brassica napus

chromosomes. Journal of Applied Genetics 41: 1-9

Hasterok R, Jenkins G, Langdon T, Jones RN, Maluszynska J. 2001.

Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor

App Genet 103: 486 - 490

Literatura

101

Hasterok R, Wolny E, Kulak S, Zdziechiewicz A, Maluszynska J, Heneen

WK. 2005. Molecular cytogenetic analysis of Brassica rapa - Brassica

oleracea var. alboglabra monosomatic addition lines. Theor Appl Genet

111: 196-205

Hasterok R, Wolny E, Hosiawa M, Kowalczyk M, Kulak-Ksiazczyk S,

Ksiazczyk T, Heneen WK, Maluszynska J. 2006. Comperative analysis

of rDNA distribution in chromosomes of various species of Brassicaceae.

Ann Bot 97: 205-216

Hasterok R, Marasek A, Donnison IS, Armstead I, Thomas A, King IP,

Wolny E, Idziak D, Draper J, Jenkins G. 2006

. Alignment of the

genomes of Brachypodium distachyon and temperate cereals and grasses

using bacterial artificial chromosome landing with fluorescence in situ

hybridization. Genetics 173: 349-362

Himelblau E, Lauffer D, Teutonico R, Pires JC, Osborn TC. 2004. Rapid -

Cycling Brassica in research and education. [In]: Biotechnology in

agriculture and forestry [Ed.] Nagata T, Lorz H, Windholm JM. Springer-

Verlag, Berlin, 54: 13-28

Houben A, Demidov D, Gernand D, Meister A, Leach C, Schubert I. 2003.

Methylation of histone H3 in euchromatin of plant chromosomes depends

on basic nuclear DNA content. Plant J 33: 967-973

Houben A, Demidov D, Caperta A, Karimi R, Agueci F, Vlasenko L. 2007.

Phosphorylation of histone H3 in plants - A dynamic affair. Biochim

Biophys Acta 1769: 308-315

Hsieh T, Fischer R. 2005. Biology of chromatin dynamics. Annu Rev Plant Biol

56: 327-351

Irigoyen ML, Linares C, Ferrer E, Fominaya A. 2002. Fluorescence in situ

hybridization mapping of Avena sativa L. cv. SunII and its monosomic

lines using cloned repetitive DNA sequences. Genome 45: 1230-1237

Jackson J, Johnson L, Jasencakova Z, Zhang X, Perez-Burgos L, Singh P,

Cheng X, Schubert I, Jenuwein T, Jacobsen S. 2004. Dimethylation of

histone H3 lysine 9 is a critical mark for DNA methylation and gene

silencing in Arabidopsis thaliana. Chromosoma 112: 308-315

Jaligot E, Beulé T, Baurens F, Billotte N, Rival A. 2004. Search for

methylation-sensitive amplification polymorphisms associated with the

Literatura

102

“mantled” variant phenotype in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.).

Genome 47: 224-228

Jasencakova Z. 2003. Dynamics and functional aspects of histone modifications

in plants. http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv

%3A3-000005488

Jasencakova Z, Meister A, Walter J, Turner B, Schubert I. 2000. Histone H4

acetylation of euchromatin and heterochromatin is cell cycle dependent

and correlated with replication rather than with transcription. Plant Cell

12: 2087-2100

Jasencakova Z, Meister A, Schubert I. 2001. Chromatin organization and its

relation to replication and histone acetylation during the cell cycle in

barley. Chromosoma 110: 83-92

Jasencakova Z, Soppe W, Meister A, Gernand D, Turner B, Schubert I. 2003.

Histone modifications in Arabidopsis – high methylation of H3 lysine 9 is

dispensable for constitutive heterochromatin. Plant J 33: 471-480

Jeddeloh JA, Stokes TL, Richards EJ. 1999. Maintenance of genomic

methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. Nat Genet 22: 94-7

Jenczewski E, Eber F, Grimaud A, Huet S, Lucas M, Monod H, Chevre M.

2003. PrBn, a major gene controlling homeologous pairing in oilseed rape

(Brassica napus) haploids. Genetics 164: 645-653

Johnston JS, Pepper AE, Hall AE, Chen ZJ, Hodnett G, Drabek J, Lopez R,

Price HJ. 2005. Evolution of genome size in Brassicaceae. Ann Bot 95:

229-235

Kashkush K, Feldman M, Levy AA. 2002. Gene loss, silencing and activation in

a newly synthesized wheat allotetraploid. Genetics 160: 1651-9

Kato M, Miura A, Bender J, Jacobsen S, Kakutani T. 2003. Role of CG and

non-CG methylation in immobilization of transposons in Arabidopsis.

Curr Biol 13: 421-426

Kiysue T, Ohad O, Yadegari R, Hannon M, Dinney J, Wells D, Katz A,

Margossian L, Harada J, Goldberg R, Fischer R. 1999. Control of

fertilization-independent endosperm development by the MEDEA

polycomb gene in Arabidopsis. PNAS 96: 4186-4191

Literatura

103

Kolano B, Pando LG, Maluszynska J. 2001. Molecular cytogenetic studies in

Chenopodium quinoa and Amaranthus causatus. Acta Societatis

Botanicorum Poloniae 70: 85-90

Lagercrantz U. 1998. Comparative mapping between Arabidopsis thaliana and

Brassica nigra indicates that Brassica genome have evolved through

extensive genome replication accompanied by chromosome fusions and

frequent rearrangements. Genetics 150: 1217-1228

Lagercrantz U, Lydiate DJ. 1996. Comparative genome mapping in Brassica.

Genetics 144: 1903-10

Lee HS, Chen ZJ. 2001. Protein-coding genes are epigenetically regulated in

Arabidopsis polyploids. PNAS 98: 6753-8

Leitch A, Lim K, Skalicka K, Kovarik A. 2006. Nuclear cytoplasmic interaction

hypothesis and the role of translocations in Nicotiana allopolyploids. [In]:

Radiation Risk Estimates in Normal and Emergency Situations. Springer

Link Netherlands p. 319-326

Leitch IJ, Heslop-Harrison JS. 1993. Physical mapping for four sites of 5S

rDNA sequences and one site of the alfa-amylase gene in barley (Hordeum

vulgare). Genome 36: 517-523

Leitch IJ, Bennett MD. 1997. Polyploidy in angiosperms. Trends Plant Sci 2:

470-476

Li G, Hall TC, Holmes-Davis R. 2002. Plant chromatin: development and gene

control. BioEssays 24: 234-243

Li X, Xu M, Korban S. 2002a. DNA methylation profiles differ between field-

and in vitro-grown leaves of apple. J Plant Physiol 159: 1229-1234

Li Y, Butenko Y, Grafi G. 2005. Histone deacetylation is required for

progression through mitosis in tabacco cells. Plant J 41: 346-352

Lim K, Matysek R, Kovarik A, Leitch A. 2004. Genome evolution in

allotetraploid Nicotiana. Biol J Linn Soc 82: 599-606

Lim KB, H. J, Yang TJ, Park JY, Kwon SJ, Kim JS, Lim MH, Kim JA, Jin

M, Jin YM, Kim SH, Lim YP, Bang JW, Kim HI, Park BS. 2005.

Characterization of rDNAs and tandem repeats in the heterochromatin of

Brassica rapa. Mol Cells 19: 436-444

Lim KB, Yang TJ, Hwang YJ, Kim JS, Park JY, Kwon SJ, Kim J, Choi BS,

Lim MH, Jin M, Kim HI, de Jong H, Bancroft I, Lim Y, Park BS.

Literatura

104

2007. Characterization of the centromere and peri-centromere

retrotransposons in Brassica rapa and their distribution in related Brassica

species. Plant J 49: 173-83

Lippman Z, May B, Yordan C, Singer T, Martienssen R. 2003. Distinct

mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small

interfering RNA and histone modification. PLoS Biol 1: 420-428

Liu B, Vega JM, Feldman M. 1998

. Rapid genomic changes in newly

synthesized amphiploids of Triticum and Aegilops. II. Changes in low-

copy coding DNA sequences. Genome 41: 535-542

Liu B, Brubaker CL, Mergeai G, Cronn RC, Wendel JF. 2001. Polyploid

formation in cotton is not accompanied by rapid genomic changes.

Genome 44: 321-30

Liu B, Wendel JF. 2003. Epigenetic phenomena and the evolution of plant

allopolyploids. Mol Phylogenet Evol 29: 365-79

Lombard V, Delourme R. 2001. A consensus linkage map for rapeseed

(Brassica napus L.): construction and integration of three individual maps

from DH populations. Theor Appl Genet 103: 491-507

Luger K. 2003. Structure and dynamic behavior of nucleosomes. Curr Opin

Genet Dev 13: 127-35

Lukens L, Pires JC, Leon E, Vogelzang R, Oslach L, Osborn TC. 2006.

Patterns of sequence loss and cytosine methylation within a population of

newly resynthesized Brassica napus allopolyploids. Plant Physiol 140:

336-348

Luo M, Bilodeau P, Koltunow A, Dennis E, Peacock W, Chaudhury A. 1999.

Genes controlling fertilization-independent seed development in

Arabidopsis thaliana. PNAS 96: 296-301

Lysak MA, Fransz PF, Ali HB, Schubert I. 2001. Chromosome painting in

Arabidopsis thaliana. Plant J 28: 689-697

Lysak MA, Pecinka A, Schubert I. 2003. Recent progress in chromosome

painting of Arabidopsis and related species. Chromosome Res 11: 195-204

Lysak MA, Berr A, Pecinka A, Schmidt R, McBreen K, Schubert I. 2006.

Mechanisms of chromosome number reduction in Arabidopsis thaliana

and related Brassicaceae species. PNAS 103: 5224-9

Literatura

105

Lysak MA, Cheung K, Kitschke M, Bures P. 2007. Ancestral chromosomal

bloks are triplicated in Brassiceae species with varying chromosome

number and genome size. Plant Physiology 145: 402-410

Ma X, Gustafson J. 2005. Genome evolution of allopolyploids: a process of

cytological and genetic diploidization. Cytogenet Genome Res 109: 236-

249

Ma X, Gustafson J. 2006. Timing and rate of genome variation in triticale

following allopolyploidization. Genome 49: 950-958

Madlung A, Masuelli R, Watson B, Reynolds S, Davison J, Comai L. 2002.

Remodeling of DNA methylation and phenotypic and transcriptional

changes in synthetic Arabidopsis allotetraploids. Plant Physiol 129: 733-

746

Madlung A, Comai L. 2004. The effect of stress on genome regulation and

structure. Ann Bot 94: 481-495

Małuszyńska J. 1995. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych in situ: od ISH do

DIRVISH. Biotechnologia 2: 92-101

Małuszyńska J. 1999. Porównawcze badania organizacji genomu roślinnego.

Postępy biologii komórki 26: 507-522

Małuszyńska J. 2001. Cytogenetyczne badania struktury genomów

poliploidalnych. Biotechnologia 52: 35-41

Maluszynska J, Heslop-Harrison JS. 1991. Localization of tandemly repeated

DNA sequences in Arabidopsis thaliana. Plant J 1: 159-166

Maluszynska J, Heslop-Harrison JS. 1993. Physical mapping of rDNA loci in

Brassica species. Genome 36: 774-781

Maluszynska J, Hasterok R, Weiss H. 1998. rRNA genes - their distribution and

activity in plants. Prace Naukowe Uniwersytetu Śląskiego 1696: 76-95

Mathieu O, Jasencakova Z, Vaillant I, Gendrel A, Colot V, Schubert I,

Tourmente S. 2003. Changes in 5S rDNA chromatin organization and

transcription during heterochromatin establishment in Arabidopsis. Plant

Cell 15: 2929-2939

McClintock B. 1984. The significance of responses of the genome to challenge.

Science 256: 792-801

Literatura

106

McKittric E, Gafken PR, Ahmad K, Henikoff S. 2004. Histone H3.3 is

enriched in covalent modifications associated with active chromatin. PNAS

101: 1525-1530

Murata M, Heslop - Harrison JS, Motoyoshi F. 1997. Physical mapping of the

5S ribosomal RNA genes in Arabidopsis thaliana by multicolor

fluorescence in situ hybridization with cosmid clones. Plant J 12: 31-37

Nakano Y, Steward N, Sekine M, Kusano T, Sano H. 2000. A tobacco

NtMET1 cDNA encoding a DNA methyltransferase: molecular

characterization and abnormal phenotypes of transgenic tobacco plants.

Plant Cell Physiol 41: 448-57

Negi MS, Devic M, Delseny M, Lakshmikumaran M. 2000. Identification of

AFLP fragments linked to seed coat colour in Brassica juncea and

conversion to a SCAR marker for rapid selection. Theor Appl Genet 101:

146-152

Noma K, Allis CD, Grewal SI. 2001. Transitions in distinct histone H3

methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science

293: 1150-1155

Ohad N, Yadegari R, Margossian L, Hannon M, Michaeli D, Harada J,

Goldberg R, Fischer R. 1999. Mutations in FIE, a WD polycomb group

gene, allow endosperm development without fertilization. Plant Cell 11:

407-415

Olszewska M. 1981. Metody badania chromosomów. Wyd. Nauk. PWN,

Warszawa

Olszewska M. 2003. DNA i białka centromerowe. Postępy biologii komórki 30:

167-185

Olszewska M. 2007. Heterochromatyna i heterochromatynizacja. Postępy biologii

komórki 34: 391-407

Osborn T, Pires C, Birchler J, Auger D, Chen Z, Lee H, Comai L, Madlung

A, Doerge R, Colot V, Martienssen R. 2003. Understanding mechanisms

of novel gene expression in polyploids. Trends Genet 19: 141-147

Ozkan H, Levy A, Feldman M. 2001. Allopolyploidy-Induced Rapid Genome

Evolution in the Wheat (Aegilops–Triticum) Group. Plant Cell 13: 1735-

1747

Literatura

107

Pandey R, Muller A, Napoli CA, Selinger DA, Pikaard CS, Richards EJ,

Bender J, Mount DW, Jorgensen RA. 2002. Analysis of histone

acetyltransferase and histone deacetylase families of Arabidopsis thaliana

suggests functional diversification of chromatin modification among

multicellular eukaryotes. Nucleic Acids Res 30: 5036–5055

Park JY, Koo DH, Hong CP, Lee SJ, Jeon JW, Lee SH, Yun PY, Park BS,

Kim HR, Bang JW, Plaha P, Bancroft I, Lim YP. 2005. Physical

mapping and microsynteny of Brassica rapa ssp. pekinensis genome

corresponding to a 222 kbp gene-rich region of Arabidopsis chromosome 4

and partially duplicated on chromosome 5. Mol Gen Genomics 274: 579-

588

Parkin AP, Sharpe AG, Keith DJ, Lydiate DJ. 1995. Identification of the A and

C genomes of amphidiploid Brassica napus (oilseed rape). Genome 38:

1122-1131

Parra I, Windle B. 1993. High resolution visual mapping of stretched DNA by

fluorescent hybridization. Nat Genet 5: 17-21

Pfluger J, Wagner D. 2007. Histone modifications and dynamic regulation of

genome. Curr Opin Plant Biol 10: 645-652

Podesta A, Ruffni Castiglione M, Avanzi S, Montagnoli G. 1993. Molecular

geometry of antigen binding by a monoclonal antibody against 5-

methylcytidine. Int J Biochem 25: 929-933

Polakowski B. 1995. Botanika.

Wyd. Nauk. PWN, Warszawa

Pontes O, Li CF, Nunes PC, Haag J, Ream T, Vitins A, Jacobsen S, Pikaard

CS. 2006. The Arabidopsis chromatin-modifying nuclear siRNA pathway

involves a nucleolar RNA process. Cell 126: 79-92

Pradhan A, Gupta V, Mukhopadhyay A, Arumugam N, Sodhi Y, Pental D.

2004. A high-density linkage map in Brassica juncea (Indian mustard)

using AFLP and RFLP markers. Theor Appl Genet 106: 607-614

Prymakowska-Bosak M, Przewłoka M, Ślusarczyk J, Kuraś M, Lichota J,

Kiliańczyk B, Jerzmanowski A. 1999. Linker histones play a role in male

meiosis and the development of pollen grains in tobacco. Plant Cell 11:

2317-2329

Ramsey J, Schemske DW. 1998. Pathways, mechanisms, and rates of polyploid

formation in flowering plants. Annu Rev Ecol Syst 29: 467-501

Literatura

108

Reyes JC, Hennig L, Gruissem W. 2002. Chromatin-remodeling and memory

factors. New regulators of plant development. Plant Physiol 130: 1090-

1101

Salina EA, Lim KY, Badaeva ED, Shcherban AB, Adonina IG, Amosova AV,

Samatadze TE, Vatolina TY, Zoshchuk SA, Leitch AR. 2006.

Phylogenetic reconstruction of Aegilops section Sitopsis and the evolution

of tandem repeats in the diploids and derived wheat polyploids. Genome

49: 1023-1035

Sarnowski T, Rios G, Jasik J, Swierzewski S, Kaczanowski S, Li Y,

Kwiatkowska A, Pawlikowska K, Kozbial M, Kozbial P, Koncz C,

Jerzmanowski A. 2005. SWI3 Subunits of putative SWI/SNF chromatin-

remodeling complexes play distinct roles during Arabidopsis development.

Plant Cell 17: 2454-2472

Schmidt T, Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 1994. Physical mapping of

rRNA genes by fluorescent in situ hybridization and structural analysis of

5S rRNA genes and intergenic spacer sequences in sugar beet (Beta

vulgaris). Theor Appl Genet 88: 629-636

Schmitz R, Amasino R. 2007. Vernalization: A model for investigating

epigenetics and eukaryotic gene regulation in plants. Biochim Biophys

Acta 1769: 269-275

Schrader O, Budahn H, Ahne R. 2000. Detection of 5S and 25S rRNA genes in

Sinapis alba, Raphanus sativus and Brassica napus by double fluorescence

in situ hybridization. Theor Appl Genet 100: 665-669

Schranz ME, Lysak MA, Mitchell-Olds T. 2006. The ABC‟s of comparative

genomics in the Brassicaceae: building blocks of crucifer genomes.

Trends in Plant Science 11: 536-541

Schubert I. 1984. Mobile Nucleolus Organizing Regions (NORs) in Allium

(Liliaceae) - Inferences from the specifity of silver staining. Pl Syst Evol

144: 291-305

Schubert I. 1992. Telomeric polymorphism in Vicia faba. Zentralblatt fur

biologische Aerosolforschung 111: 164-168

Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 1991. In situ hybridisation to plant

telomeres using synthetic oligomers. Genome 34: 317-323

Literatura

109

Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS. 2000. Practical in situ hybridization.

Oxford: BIOS Scientific Limited

Sears ER. 1976. Genetic control of chromosome pairing in wheat. Can J Genet

Cytol 19: 585-593

Shaked H, Kashkush K, Ozkan H, Feldman M, Levy AA. 2001. Sequence

elimination and cytosine methylation are rapid and reproducible responses

of the genome to wide hybridization and allopolyploidy in wheat. Plant

Cell 13: 1749-59

Sherman JD, Talbert LE. 2002. Vernalization-induced changes of the DNA

methylation pattern in winter wheat. Genome 45: 253-260

Shi J, Dawe RK. 2006. Partioning of the maize epigenome by the number of

methyl groups on histone H3 lysines 9 and 27. Genetics 173: 1571-1583

Shishido R, Sano Y, Fukui K. 2000. Ribosomal DNAs: an exception to the

conservation of gene order in rice genomes. Mol Gen Genet 263: 586-591

Shoemaker R, Polzin K, Labate J, Specht J, Brummer E, Olson T, Young N,

Concibido V, Wilcox J, Tamulonis J, Kochert G, H. B. 1996. Genome

Duplication in Soybean (Glycine subgenus soja). Genetics 144: 329-338

Snowdon RJ, Köhler W, Köhler A. 1997

. Chromosomal localization and

characterization of rDNA loci in the Brassica A and C genomes. Genome

40: 582-587

Snowdon RJ, Köhler W, Friedt W, Köhler A. 1997

. Genomic in situ

hybridization in Brassica amphidiploids and interspecific hybrids. Theor

Appl Genet 95: 1320-1324

Snowdon RJ, Friedt W, Köhler A, Köhler W. 2000. Molecular cytogenetic

localization and characterization of 5S and 25S rDNA loci for

chromosome identification in oilseed rape (Brassica napus L.). Ann Bot

86: 201-204

Snowdon RJ, Friedrich T, Friedt W, Köhler W. 2002. Identifying the

chromosomes of the A- and C-genome diploid Brassica species B. rapa

(syn. campestris) and B. oleracea in their amphidiploid B. napus. Theor

Appl Genet 104: 533-538

Sokol A, Kwiatkowska A, Jerzmanowski A, Prymakowska-Bosak M. 2007.

Up-regulation of stress-inducible genes in tabacco and Arabidopsis cells in

Literatura

110

response to abiotic stresses and ABA treatment corrleates with dynamic

changes in histone H3 and H4 modifications. Planta 227: 245-254

Soltis DE, Soltis PS. 1999. Polyploidy: recurrent formation and gene evolution.

Trends Ecol Evol 14: 348-352

Soltis DE, Soltis PS, Tate JA. 2003. Advances in the study of polyploidy since

plant speciation. New Phytol. 161: 173-191

Song KM, Suzuki JY, Slocum MK, Williams PH, Osborn TC. 1991. A linkage

map of Brassica rapa (syn. campestris) based on restriction fragment

length polymorphism loci. Theor Appl Genet 82: 296-304

Song K, Lu P, Tang K, Osborn TC. 1995. Rapid genome change in synthetic

polyploids of Brassica and its implications for polyploid evolution. PNAS

92: 7719-23

Soltis DE, Soltis PS, Pires C, Kovaric A, Tate JA, Mavrodiev E. 2004. Recent

and recurrent polyploidy in Tragopogon (Asteraceae): cytogenetic,

genomic and genetic comparisons. Biol J Linn Soc 82: 485-501

Soppe W, Jasencakova Z, Houben A, Kakutani T, Meister A, Huang M,

Jacobsen S, Schubert I, Fransz P. 2002. DNA methylation controls

histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in

Arabidopsis. EMBO Journal 21: 6549-6559

Sridha S, Wu K. 2006. Identification of AtHD2C as a novel regulator of abscisic

acid responses in Arabidopsis. Plant J 46: 124-133

Stawski K, Dąbrowska G, Goc A. 2005. Współzależność pomiędzy metylacją

cytozyny i modyfikacjami chromatyny. Postępy biologii komórki 32: 679-

696

Sunkar R, Zhu J. 2004. Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and Other

Small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell 16: 2001-2019

Szittya G, Silhavy D, Molnar A. 2003. Low temperature inhibits RNA silencing-

mediated defence by the control of siRNA generation. EMBO Journal 22:

633-640

Tacik T. 1985. Kapusta Brassica L. [W]: Flora Polski. Rośliny naczyniowe.

Jasiewicz A [Wyd]. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa, Kraków, tom IV, wyd

II, pp. 268-280

Literatura

111

Tariq M, Saze H, Probst A, Lichota J, Habu Y, Paszkowski J. 2003. Erasure

of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3

methylation in heterochromatin. PNAS 100: 8823-8827

Tate JA, Ni Z, Scheen AC, Koh J, Gilbert CA, Lefkowitz D, Chen ZJ, Soltis

PS, Soltis DE. 2006. Evolution and expression of homeologous loci in

Tragopogon miscellus (Asteraceae), a recent and reciprocally formed

allopolyploid. Genetics 173: 1599-611

Taverna S, Coyne R, Allis C. 2002. Methylation of histone H3 at lysine 9 targets

orogrammed DNA elimination in Tetrahymena. Cell 110: 701-711

Teerawanichpan P, Chandrasekharan MB, Jiang Y, Narangajavana J, Hall

TC. 2004. Characterization of two rice DNA methyltransferase genes and

RNAi-mediated reactivation of a silenced transgene in rice callus. Planta

218: 337-49

Tenney K, Gerber M, Ilvarsonn A, Schneider J, Gause M, Dorsett D,

Eissenberg J, Shilatifard A. 2006. Drosophila Rtf1 functions in histone

methylation, gene expression, and Notch signaling. PNAS 103: 11970-

11974

Terranova R, Agherbi H, Boned A, Meresse S, Djabali M. 2006. Histone and

DNA methylation defects at Hox genes in mice expressing a SET domain-

truncated form of Mll. PNAS 103: 6629-6634

Tessadori F, Schulkes R, Driel R, Fransz P. 2007

. Light-regulated large-scale

reorganization of chromatin during floral transition i Arabidopsis. Plant J

50: 848-857

Tessadori F, Chupeau M, Knip M, Germann S, Driel R, Fransz P, Gaudin V.

2007

. Large-scale dissociation and sequential reasembly of pericentric

heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. Journal of Cell

Science 120: 1200-1208

Tian L, Chen ZJ. 2001. Blocking histone deacetylation in Arabidopsis induces

pleiotropic effects on plant gene regulation and development. PNAS 98:

200-205

Truco MJ, Hu J, Sadowski J, Quiros CF. 1996. Inter- and intragenomic

homology of the Brassica genomes: implications for their origin and

evolution. Theor Appl Genet 93: 1225-1233

Literatura

112

Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette ML, Guillaume E, Buisine

N, Gagnot S, Martienssen RA, Coupland G, Colot V. 2007. Arabidopsis

TFL2/LHP1 specifically associates with genes marked by trimethylation of

histone H3 lysine 27. PLoS Genet 3: e86

U N. 1935. Genome analysis in Brassica with special reference to the

experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilization. Jpn

J Genet 7: 784-794

Unfried I, Gruendler P. 1990. Nucleotide sequence of the 5.8S and 25S rRNA

genes and of the internal transcribed spacers from Arabidopsis thaliana.

Nucleic Acids Res 18: 4011

Vinkenoog R, Spielman M, Adams S, Fischer R, Dickinson HG, Scott R.

2000. Hypomethylation promotes autonomous endosperm development

and rescues postfertilization lethality in fie mutants. Plant Cell 12: 2271-

2282

Volkov R, Komarova N, Zentgraf U, Hemleben V. 2006. Epigenetic gene

silencing in plants. Progress in Botany 67: 101-133

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Hornes M, Frijters A,

Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique

for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23: 4407-4414

Wood C, Robertson M, Tanner G, Peacock W, Dennis E, Helliwell C. 2006.

The Arabidopsis thaliana vernalization response requires a polycomb-like

protein complex that also includes Vernalization Insensitive 3. PNAS 103:

14641-14636

Xiong LZ, Xu CG, Saghai Maroof MA, Zhang Q. 1999. Patterns of cytosine

methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by a

methylation-sensitive amplification polymorphism technique. Mol Gen

Genet 261: 439-446

Xu M, Li X, Korban S. 2000. AFLP-based detection of DNA methylation. Plant

Mol Biol Rep 18: 361-368

Yang Q, Hanson L, Bennett MD, Leitch I. 1999. Genome structure and

evolution in the allohexaploid weed Avena fatua L. (Poaceae). Genome

42: 512-518

Literatura

113

Yang YW, Tai PY, Chen Y, Li WH. 2002. A study of the phylogeny of Brassica

rapa, B. nigra, Raphanus sativus, and their related genera using noncoding

regions of chloroplast DNA. Mol Phylogenet Evol 23: 268-275

Yang TJ, Kim JS, Kwon SJ, Lim KB, Choi BS, Kim JA, Jin M, Park JY, Lim

MH, Kim HI, Lim YP, Kang JJ, Hong JH, Kim CB, Bhak J, Bancroft

I, Park BS. 2006. Sequence-level analysis of the diploidization process in

the triplicated Flowering Locus C region of Brassica rapa. Plant Cell 18:

1339-47

Yang TJ, Kwon SJ, Choi BS, Kim JS, Jin M, Lim KB, Park JY, Kim JA, Lim

MH, Kim HI, Lee HJ, Lim YP, Paterson AH, Park BS. 2007.

Characterization of terminal-repeat retrotransposon in miniature (TRIM) in

Brassica relatives. Theor Appl Genet 114: 627-36

Yu Y, Tomkins JP, Waugh R, Frisch DA, Kudrna D, Kleinhofs A,

Brueggeman RS, Muehlbauer GJ, Wise RP, Wing RA. 2000. A

bacterial artificial chromosome library for barley (Hordeum vulgare L.)

and the identification of clones containing putative resistance genes. Theor

Appl Genet 101: 1093-1099

Zemach A, Li Y, Wayburn B, Ben-Meir H, Kiss V, Avivi Y, Kalchenko V,

Jacobsen S, Grafi G. 2005. DDM1 binds Arabidopsis metyl-CpG binding

domein proteins and affects their subnuclear localization. Plant Cell 17:

1549-1558

Zhang X, Clarenz O, Cokus S, Bernatavichute YV, Pellegrini M, Goodrich J,

Jacobsen SE. 2007. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27

trimethylation in Arabidopsis. PLoS Biol 5: e129

Zhao X, Si Y, Hanson R, Crane C, Price J, Stelly D, Wendel J, Paterson AH.

1998. Dispersed repetitive DNA has spread to new genomes since

polyploid formation in cotton. Genome Res 8: 479-492

Zhou C, Zhang L, Duan J, Miki B, Wua K. 2005. Histone deacetylase19 is

involved in jasmonic acid and ethylene signaling of pathogen response in

Arabidopsis. Plant Cell 17: 1196-1204

Zhu J, Jeong J, Zhu Y, Sokolchik I, Miyazaki S, Zhu JK, Hasegawa P,

Bohnert H, Shi H, Yun D, Bressan R. 2008. Involvement of Arabidopsis

HOS15 in histone deacetylation and cold tolerance. PNAS 105: 4945-4950