Ilościowe oznaczenie glikogenu oraz badanie niektórych jego
właściwości
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawową wiedzą dotyczącą budowy,
funkcji i właściwości glikogenu jak również poznanie zasad najczęściej stosowanych
metod ilościowego oznaczania zawartości tego polisacharydu.
Wprowadzenie
Budowa glikogenu. Jest to silnie rozgałęziony polisacharyd zwierzęcy,
homopolimer zbudowany z reszt α-D-glukozy połączonych ze sobą wiązaniami α-1,4-
glikozydowymi, a w miejscach rozgałęzień α-1,6-glikozydowymi. Glikogen ma budowę
zbliżoną do składnika skrobi – amylopektyny, ale rozgałęzienia w jego cząsteczce są
liczniejsze i krótsze. Jedno rozgałęzienie przypada zwykle na 10-12 reszt glukozy.
Taka budowa cząsteczki glikogenu sprawia, że rozpuszcza się on lepiej w wodzie niż
amylopektyna. Wielkość cząsteczek glikogenu, jak też liczba i stopień rozgałęzień tego
wielocukru zależą od źródła, z którego został wyizolowany. Masa cząsteczkowa glikogenu
jest różna i waha się w granicach od kilkuset tysięcy do kilku milionów Da (masa
cząsteczkowa glikogenu w mięśniach ok. 1 000 000, a w wątrobie ok. 5 000 000 Da).
Występowanie i funkcje glikogenu
.
Jest to zapasowy polisacharyd odkładany w wątrobie
i w mniejszych ilościach w mięśniach. Zawartość glikogenu jest zależna od stanu
fizjologicznego organizmu, w wątrobie wynosi od 2 do 10%, a w mięśniach od 0,5 do
1,5% tkanki. Ze względu na dużą masę mięśni w porównaniu z masą wątroby w
organizmie przeważa jednak forma mięśniowa tego polisacharydu. Organizm ludzki może
zmagazynować nawet do 450 g glikogenu, z czego jedynie ok. 30 % znajduje się w
wątrobie. W komórce glikogen wraz z większością enzymów niezbędnych do jego syntezy
i degradacji jest zlokalizowany w postaci ziarnistości w cytoplazmie.
Glikogen w wątrobie służy przede wszystkim do utrzymania odpowiedniego poziomu
glukozy we krwi w przerwach pomiędzy posiłkami.
Glikogen w mięśniach stanowi
natomiast rezerwę glukozy wykorzystywanej do syntezy ATP podczas intensywnych
skurczów mięśni i nie bierze udziału w regulacji stężenia cukru we krwi.
Aktywność enzymów uczestniczących w syntezie i rozkładzie glikogenu podlega złożonej
regulacji przez hormony i inne czynniki.
Właściwości fizykochemiczne glikogenu. Podobnie jak pozostałe polisacharydy glikogen
należy do grupy nie zjonizowanych związków polarnych. Jako koloid hydrofilowy
rozpuszcza się w wodzie na zimno dając opalizujący roztwór. Możliwe jest to dzięki
występowaniu w jego cząsteczce licznych grup hydroksylowych, mogących łatwo tworzyć
wiązania wodorowe z cząsteczkami wody. W obecności soli nieorganicznych o znacznych
stężeniach oraz pod wpływem cieczy organicznych mieszających się z wodą glikogen
łatwo ulega wytrąceniu z roztworu. Dodanie do roztworu glikogenu soli obojętnej dobrze
zdysocjowanej, np. siarczanu amonowego lub chlorku sodowego, powoduje rozerwanie
wiązań wodorowych między grupami –OH polisacharydu a cząsteczkami wody
(dehydratacja), a samorzutnie tworzące się wewnątrz- i międzycząsteczkowe wiązania
doprowadzają do agregacji cząsteczek glikogenu i wytrącenia asocjatów z roztworu. Pod
wpływem rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton czy alkohol, następuje
znaczne zmniejszenie stałej dielektrycznej roztworu (woda – 80, etanol – 24), co w
konsekwencji
również
prowadzi
do
zmniejszenia
stopnia
uwodnienia
grup
hydroksylowych glikogenu i powoduje jego wytrącenie z roztworu. Glikogen z jodem
tworzy kompleks o barwie czerwonobrunatnej. Pozwala to na odróżnienie niektórych
polisacharydów (glikogen, skrobia) od innych, gdyż kompleksy takie mogą być
wytwarzane tylko przez cząsteczki o odpowiednio dużych wymiarach i uporządkowanej
strukturze. Boczne łańcuchy rozgałęzionej cząsteczki glikogenu tworzą układy spiralne, w
których środku występują wolne przestrzenie umożliwiające pomieszczenie cząsteczek
jodu. Charakterystyczna absorpcja jodu występuje jedynie w przypadku łańcuchów
zawierających, co najmniej 6 reszt polisacharydowych (jeden skręt spirali). Barwny efekt
jest tym silniejszy, im większe są cząsteczki polisacharydu, a więc im większa jest liczba
cząsteczek jodu związanego w kompleksie. Glikogen, jako polisacharyd nie wykazuje
właściwości redukujących. Stosunkowo łatwo ulega on hydrolizie kwasowej oraz
enzymatycznej z udziałem amylaz. Obecność uwolnionych w wyniku hydrolizy cukrów
redukujących stanowi podstawę najczęściej stosowanych metod oznaczeń ilościowych i
jakościowych tego polisacharydu.
Rys. 1. Hydroliza kwasowa glikogenu
Zasada metody Somogyi i Nelsona (punkt A wykonania ćwiczenia).
G
lukoza redukuje w środowisku alkalicznym w obecności winianu sodowopotasowego
jony Cu
2+
do Cu
+
. Ilość powstałego w reakcji tlenku miedzi (I) oznacza się przy użyciu
kwasu arsenomolibdenowego, który ulega redukcji do błękitu molibdenowego. Natężenie
powstałej niebieskiej barwy produktu jest proporcjonalne do ilości wytworzonego Cu
2
O a
tym samym do ilości powstałej podczas hydrolizy glikogenu glukozy.
Zasada metody Benedicta (punkt B wykonania ćwiczenia). W środowisku alkalicznym
pod wpływem glukozy jony miedzi (II) ulegają redukcji do Cu(I) i z roztworu wypada
żółty, pomarańczowy lub ceglastoczerwony osad tlenku miedzi(I). Z barwy i ilości osadu
można w przybliżeniu ocenić stężenie sacharydu w badanym roztworze.
Odczynniki
1. Roztwór glikogenu o stężeniu 2 mg/1 ml.
2. Roztwór glikogenu o stężeniu 5 mg/1 ml.
3. Jod w jodku potasowym (10 g KI + 2,5 g I
2
w 1 l).
4. 2-molowy kwas solny.
5. 1-molowy wodorotlenek sodowy.
6. 2-molowy wodorotlenek sodowy.
7. Odczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodowego i 100 g węglanu sodowego
rozpuścić w 800 ml ciepłej wody , uzupełnić wodą do 850 ml. 17,3 g siarczanu
miedziowego rozpuścić w 100 ml wody do uprzednio przygotowanego roztworu, całość
uzupełnić wodą do 1000 ml.
8. Roztwór glukoamylazy (stężenie preparatu enzymatycznego jest dobrane do
warunków ćwiczenia)
9. Winian sodowopotasowy, roztwór alkaliczny: W kolbie miarowej na 1 l
rozpuścić w wodzie destylowanej 25 g bezwodnego węglanu sodowego, 25 g winianu
sodowopotasowego, 20 g kwaśnego węglanu sodowego i 200 g bezwodnego siarczanu
sodowego. Uzupełnić kolbę wodą destylowaną do kreski.
10. Siarczan miedziowy (CuSO
4
5 H
2
O) roztwór o stężeniu: 15 g/100 ml, na każde 100 ml
tego roztworu dodać 1 kroplę stężonego H
2
SO
4
.
11. Odczynnik miedziowy. Zmieszać 25 ml odczynnika nr 9 z 1 ml odczynnika nr 10.
12. Odczynnik arsenomolibdenowy: 25 g czterowodnego molibdenianu amonowego
rozpuścić w 450 ml wody destylowanej i ostrożnie dodać 21 ml stężonego H
2
SO
4
.
Oddzielnie rozpuścić 3 g kwaśnego arsenianu sodowego siedmiowodnego (Na
2
HAsO
4
7H
2
O) w 25 ml wody destylowanej i przelać oba roztwory do kolby miarowej na 500 ml.
Uzupełniać do kreski wodą destylowaną.
Wykonanie
A) Oznaczanie stężenia glikogenu metodą Somogyi i Nelsona
Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór glikogenu (1) dopełnić wodą
destylowaną do kreski i wymieszać. Pobrać z kolby 2 ml roztworu do probówki, dodać 5
ml 2-molowego kwasu solnego (4), wymieszać i prowadzić hydrolizę glikogenu we
wrzącej łaźni wodnej przez 30 minut. Następnie próbę ochłodzić (np. wstawić probówkę
do zimnej wody), zobojętnić hydrolizat przez dodanie 5 ml 2-molowego wodorotlenku
sodowego (6) i wymieszać. Do 2 probówek pobrać po 1 ml uzyskanego hydrolizatu.
Przygotować także próbę kontrolną, w której należy zmieszać 0,5 ml 2-molowego kwasu
solnego (4) i 0,5 ml 2-molowego wodorotlenku sodowego (6). Do wszystkich trzech
probówek odmierzyć po 1 ml odczynnika Nelsona (11), zamieszać i wstawić do wrzącej
łaźni wodnej dokładnie na 10 minut. Próby ochłodzić i odmierzyć do nich po 1 ml
odczynnika arsenomolibdenowego (12), dokładnie wymieszać aż do rozpuszczenia osadu
tlenku miedzi (I) i ustania wydzielania pęcherzyków gazu (CO
2
). Próby rozcieńczyć
dodając po 7 ml wody destylowanej, wymieszać i po 10 minutach zmierzyć w fotometrze
absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej. Odczyty z aparatu uśrednić
a następnie odczytać z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej odpowiadające im
stężenie glukozy.
B) Badanie wybranych właściwości glikogenu
1. Stopniowa hydroliza kwasowa glikogenu.
Przygotować 8 ponumerowanych probówek. Do 4 z nich odmierzyć po 1 ml 1-molowego
wodorotlenku sodowego (5), a do 4 pozostałych po 1 ml wody. Ponadto przygotować
próbę do hydrolizy glikogenu: do kolejnej probówki odmierzyć 10 ml roztworu glikogenu
(2) i 5 ml 2-molowego kwasu solnego (4), wymieszać i pobrać natychmiast po 1 ml
mieszaniny do pierwszej probówki serii z 1-molowym wodorotlenkiem sodowym i z wodą
(próba w czasie zerowym). Pozostałą część próby do hydrolizy umieścić we wrzącej łaźni
wodnej i po 5, 10 i 15 minutach pobierać po 1 ml mieszaniny do kolejnych probówek serii
z wodorotlenkiem sodowym i z wodą. Po zakończeniu doświadczenia do probówek
zawierających wodorotlenek sodowy odmierzyć po 1 ml odczynnika Benedicta (7),
wymieszać i wstawić na 2 min do wrzącej łaźni wodnej. Roztwory w probówkach serii z
wodą natychmiast po pobraniu próby potraktować 2 kroplami roztworu jodu w jodku
potasowym (3).
2. Hydroliza enzymatyczna glikogenu. Do probówki odmierzyć 2 ml glikogenu (2) i 1 ml
glukoamylazy (8), wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temp. 40°C na 10 minut.
Reakcję przerwać przez zakwaszenie 0,2 ml 2 M kwasem solnym (4), wymieszać.
Przygotować dwie probówki , do jednej z nich pobrać 1 ml tej mieszaniny, do drugiej 1 ml
glikogenu (2), do obu dodać po 1 ml odczynnika Benedicta (7), wymieszać i ogrzewać we
wrzącej łaźni wodnej przez 2 minuty.
Opracowanie wyników
A. W celu obliczenia czystości otrzymanego roztworu glikogenu należy na
podstawie średniej wartości absorbancji prób pełnych dokonać odczytu stężenia glukozy z
krzywej wzorcowej i uwzględnić podany podczas zajęć sposób rozcieńczenia preparatu
glikogenu. W obliczeniach należy także uwzględnić współczynnik 0,9 pozwalający na
przeliczenie stężenie glukozy na stężenie glikogenu.
Przykładowe obliczenia na podstawie przedstawionego poniżej schematu rozcieńczenia
zadania kontrolnego:
2 g glikogenu technicznego (zawierającego zanieczyszczenia niecukrowe) rozpuszczono
w 1000 ml wody destylowanej; z tak przygotowanego roztworu studenci otrzymali w
formie zadania kontrolnego różne jego objętości (objętość podaje prowadzący ćwiczenia
po przyjęciu wyników absorbancji, w przedstawionym przykładzie 3ml) w kolbce
miarowej na 10ml, uzupełnionej do kreski wodą destylowaną.
Do hydrolizy pobrano 2 ml z kolby na 10 ml, po neutralizacji pH otrzymano mieszaninę o
objętości 12 ml, z której pobrano 1 ml do oznaczenia zawartości glukozy.
Przyjmijmy, ze średnia wartość absorbancji dla prób pełnych wyniosła 0,240 a odczytana
wartość z krzywej wzorcowej 90 μg glukozy, co po uwzględnieniu współczynnika 0,9 daje
nam 81 μg.
Z analizy schematu rozcieńczenia otrzymanej próby wynika, skoro ze w 1 ml roztworu
pobranego do oznaczenia jest 81 μg glukozy to w 12 ml 960 μg, tyle samo glukozy jest w 2
ml pobranego z kolby na 10 ml roztworu. W kolbie miarowej (10 ml) jest 4,8 mg glukozy i
tyle samo w 3 ml wydanego zadania kontrolnego, zatem w 1000 ml:
3 ml –4,8 mg
1000 ml –x mg ; x = 1800 mg =1,6 g, co odpowiada zawartości glikogenu w roztworze
glikogenu technicznego. W 1000 ml rozpuszczono 2 g glikogenu technicznego, więc:
2,0 g– 100%
1,6 g – x%
Obliczony procent czystości glikogenu w jego preparacie handlowym wynosi 80%.
B. 1. Należy dokonać obserwacji powstałego osadu tlenku miedzi (I) w próbach, w których
przeprowadzono reakcję z odczynnikiem Benedicta. W próbach z wodą obserwować
stopniowy zanik barwy kompleksu glikogenu z jodem. Dla ułatwienia opisu wyników
można przyjąć kilkustopniową skalę barwy i względem niej odpowiednio uszeregować
próby.
B. 2. Dokonać obserwacji prób po reakcji z odczynnikiem Benedicta. Zapisać i wyjaśnić
potencjalne różnice między nimi.
Pytania
1. Do jakiej grupy związków należy glikogen? Omów występowanie i funkcje glikogenu.
2. Napisz fragment cząsteczki glikogenu. Wskaż i nazwij występujące tam wiązania.
3. W jaki sposób można dokonać hydrolizy glikogenu?
4. W jaki sposób można ilościowo oznaczyć glikogen? Podaj zasadę stosowanej na
ćwiczeniach metody.
5. Omów sposoby wytrącania glikogenu z roztworu.
6. Czy jod w kompleksie z glikogenem zmienia swoją wartościowość? Uzasadnij
odpowiedź.
7. Uzasadnij stopniową zmianę barwy roztworu glikogenu z odczynnikiem Benedicta i z
jodem w miarę reakcji: a) z kwasem solnym, b) z preparatem glukoamylazy.
Literatura:
M. Somogyi. Notes on sugar determination. The Journal of Biological Chemistry,
Baltimore, 195: 19-23 (1952)
N. Nelson. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of
glucose. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, 153: 375-381 (1944)
Krishnaveni, S., Theymoli Balasubramanian and Sadasivam, S. Sugar distribution in sweet
stalk Sorghum. Food Chemistry 15: 229-232 (1984).
