Chromatografia

Chromatografia kolumnowa

Chromatografia – po co?

Zastosowanie:

oczyszczanie

wydzielanie

analiza jakościowa

analiza ilościowa

Chromatogram czarnego atramentu

Optymalizacja eluentu

Optimum 0.2 < R

F

< 0.5

Chromatografia kolumnowa



Chromatografia kolumnowa jest bardzo dobrą i wydajną

techniką służącą do wydzielania i oczyszczania produktów

naturalnych i syntetycznych.



Mechanizm rozdziału jest identyczny z mechanizmem rozdziału

w chromatografii cienkowarstwowej.

dzięki istnieniu różnic w sile oddziaływań międzycząsteczkowych

dla różnych związków pomiędzy składnikami mieszaniny, a fazą

ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną.



W roli fazy stacjonarnej można używać rozmaitych

adsorbentów.

najczęściej w chemii organicznej stosowanym jest silikażel (bardzo

silnie polarny)

Związki polarne (b) adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach

silikażelu, dlatego są wymywane z kolumny później niż składniki mniej

polarne (a), które poruszają się szybciej przy zastosowaniu rozpuszczalnika

mniej polarnego.

Chromatografia kolumnowa – co i jak?



Przygotowanie kolumny



Załadowanie kolumny



Rozwijanie kolumny



Zbieranie frakcji



Analiza frakcji

Przygotowanie kolumny

Kolumna powinna być
ustawiona pionowo!!!

silikażel

„korek” z

waty

Pakowanie kolumny



przygotowanie zawiesiny adsorbentu w eluencie

do eluentu wsypuje się adsorbent



zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać
do kolumny



odczekać chwilę, do „ubicia” się adsorbentu w
kolumnie



otwarcie kranu, aż do momentu gdy wysokość eluentu
nad adsorbentem wyniesie ok. 5 mm



nie można dopuścić do obniżenia się poziomu
rozpuszczalnika poniżej poziomu adsorbentu!!!



zamknąć kran

Wpływ wielkości cząstek adsorbentu i szybkości
przepływu na wysokość półki teoretycznej

Ź

ródło: Skoog, Holler, and Nieman, Principles of Instrumental Analysis, 5

th

edition, Saunders College Publishing.

Aplikacja próbki do kolumny



Przed aplikacją próbki wskazane jest, aby na

warstwę adsorbentu nasypać piasku (2-5 mm)



Próbka powinna być rozpuszczona w jak

najmniejszej ilości eluentu



Ostrożnie wprowadza się ją na warstwę

adsorbentu, tak aby nie spowodować

mieszania się z adsorbentem



Następnie należy ostrożnie dodać eluent, tak

aby nie dopuścić do zmieszania się z

rozdzielaną próbką

Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji



Ostrożnie otworzyć kran



Następuje rozdział substancji na warstwie
adsorbentu



Należy starać się utrzymywać stałą wysokość
rozpuszczalnika nad fazą stacjonarną



Od dołu kolumny należy odbierać kolejne frakcje w
z góry ustalonych ilościach



Objętość frakcji dobiera się empirycznie



Proces prowadzi się do czasu, aż wszystkie
analizowane związki opuszczą kolumnę

Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji

zmiana zlewki, gdy
pojawi si

ę

ż

ółty kolor

W celu szybkiego uzyskania niebieskiego zwi

ą

zku,

nale

ż

y u

ż

y

ć

rozpuszczalnika bardziej polarnego.

Rozdział zwi

ą

zków bezbarwnych

Bardzo cz

ę

sto rozdzielane (oczyszczane) zwi

ą

zki s

ą

bezbarwne.



zbiera si

ę

frakcje o niewielkiej obj

ę

to

ś

ci



obj

ę

to

ść

frakcji dobiera si

ę

w zale

ż

no

ś

ci

od wielko

ś

ci (długo

ść

,

ś

rednica) kolumny



typowa wielko

ść

frakcji wynosi 1 – 10 cm

3



ka

ż

d

ą

z frakcji analizuje si

ę

wykonuj

ą

c

oznaczenie metod

ą

TLC



ł

ą

czy si

ę

frakcje zawieraj

ą

ce t

ę

sam

ą

substancj

ę

Analiza frakcji



Analizę frakcji wykonuje się najczęściej

stosując metodą TLC



Po wykonaniu analiz łączy się frakcje

zawierające ten sam związek, a następnie

usuwa rozpuszczalnik



W końcowym etapie otrzymuje się oczyszczone

związki

Inne ważne zasady



nie powinno się dopuszczać do wyschnięcia kolumny,



kolumny nie należy poddawać udarom mechanicznym,



nie powinno się w sposób gwałtowny obniżać ciśnienia

eluentu,



należy przestrzegać zaleceń producenta co do

warunków pracy kolumny,



zasada działania identyczna jak tradycyjnej chromatografii

kolumnowej



budowa kolumny zbli

ż

ona do tradycyjnej



stosuje si

ę

niewielkie nadci

ś

nienie



szybszy rozdział substancji

Chromatografia kolumnowa – „Flash”

Chromatografia kolumnowa – „Flash”



Budowa kolumny



Aplikacji próbki



Rozwijanie kolumny



Zbieranie frakcji



Analiza – TLC



Poł

ą

czenie frakcji

Chromatografia kolumnowa – „Flash”

Średnica

kolumny

[mm]

Obj.

eluentu

a

[ml]

Ilość próbki (typowa)

[mg]

Obj.

frakcji

[ml]

∆

R

F

> 0.2

∆

R

F

> 0.2

10

100

100

40

5

20

200

400

160

10

30

400

900

360

20

40

600

1600

600

30

50

1000

2500

1000

50

a

Typowa objętość eluentu potrzebna do pakowania kolumny i elucji