(Microsoft Word - 1. Aminokwasy i bia\263ka.doc)

Ćwiczenie 1

AMINOKWASY – BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI

BIAŁKA – BUDOWA I FUNKCJE

Część doświadczalna obejmuje:

−

rozdział aminokwasów metodą chromatografii podziałowej (technika chromatografii bibu-

łowej wstępującej)

−

wykonanie reakcji charakterystycznych dla wybranych aminokwasów

−

ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową

WPROWADZENIE

AMINOKWASY

Budowa i właściwości ogólne aminokwasów

Aminokwasy są kwasami organicznymi zawierającymi wolną grupą karboksylową

oraz wolną grupą aminową, położoną przy α-atomie węgla. Poza tymi dwoma grupami,

każdy aminokwas ma charakterystyczny dla siebie łańcuch boczny R (Ryc. 1 i 2).

Ryc. 1. Schemat budowy i zróżnicowanie funkcjonalne aminokwasów (Koolman i Röhm

2005)

pierścień. Atom azotu w pierścieniu jest słabo zasadowy i w warunkach fizjologicznych nie

jest uprotonowany. Aminokwasy, które nie mogą być syntetyzowane w organizmach ludzkich

(aminokwasy egzogenne) oznaczone są czerwoną gwiazdką.

Aminokwasy są składnikami budulcowymi peptydów i białek (aminokwasy proteino-

genne). Niektóre aminokwasy wchodzą w skład lipidów, np. seryna występuje w fosfolipi-

dach, a glicyna w solach żółciowych. Glutaminian, asparaginian oraz glicyna odgrywają rolę

neuroprzekaźników. Wszystkie aminokwasy, za wyjątkiem lizyny i leucyny, mogą być me-

tabolitami pośrednimi szlaku glukoneogenezy (aminokwasy glukogenne), tzn. mogą posłużyć

do biosyntezy glukozy. Niektóre aminokwasy są wykorzystywane do syntezy zasad puryno-

wych i pirymidynowych (asparaginian, glutaminian), hemu (glicyna), amin biogennych

(np. seryna, glutaminian) (Ryc. 3). Aminokwasy są też donorami grup aminowych przenoszo-

nych na ketokwasy lub funkcjonują w cyklu mocznikowym (ornityna, cytrulina) (Ryc. 4).

Ryc. 3. Aminy biogenne wywodzące się z aminokwasów (Koolman i Röhm 2005)

Ryc. 4. Aminokwasy rzadkie (Koolman i Röhm 2005)

Właściwości amfoteryczne aminokwasów

Obecność w aminokwasach grupy karboksylowej i grupy aminowej powoduje, że są

one związkami amfoterycznymi. W roztworach wodnych występują głównie w formie jo-

nów. W zależności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy,

zgodnie z poniższymi równaniami reakcji:

Zmiany stanu jonizacji aminokwasów w zależności od pH

W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton, staje się kationem i zachowuje jak

kwas, gdyż występujące w cząsteczce grupa karboksylowa –COOH i grupa amoniowa –NH

mogą być donorami protonów. W środowisku zasadowym aminokwas oddając proton staje

się anionem i zachowuje się jak zasada, ponieważ zdysocjowana grupa karboksylowa COO

i grupa aminowa NH

mogą przyłączać protony. Jest taka wartość pH roztworu, przy której

cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, w którym liczba ładunków

ujemnych jest równa liczbie ładunków dodatnich, czyli sumarycznie ładunek równy jest zeru.

Taka wartość pH nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI).

Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania

roztworów aminokwasów mocnymi kwasami lub zasadami (Ryc. 5). Krzywa przedstawia

zależność wartości pH miareczkowanego roztworu od liczby dodanych moli kwasu lub zasa-

dy. Zależność między wartością pH a stanem dysocjacji opisano równaniem Hendersona-

Hasselbalcha, gdzie K

= stała kwasowa, a pK

= ujemny logarytm stałej kwasowej:

Z powyższego równania wynika, iż w warunkach, gdy formy zdysocjowana i niezdysocjowa-

na są w stężeniach równowagowych, to pK

= pH. Miareczkowanie roztworu aminokwasu

połączone z jednoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala na doświadczalne wyznaczenie

krzywej dysocjacji aminokwasu, określenie jego wartości pI oraz wyznaczenie wartości pK

jego grup funkcyjnych.

Ryc. 5. Krzywa miareczkowania histydyny (Karlson 1987)

Rozdział aminokwasów

Jedną z metod rozdziału aminokwasów pozwalającą izolować z mieszaniny pojedyn-

cze aminokwasy jest chromatografia podziałowa. Opiera się ona na prawie podziału solutu

(substancji rozpuszczonej) między dwie fazy ciekłe – ruchomą i stacjonarną. Faza stacjo-

narna utrzymywana jest przez porowaty nośnik słabo adsorbujący składniki solutu. Porowa-

tym nośnikiem może być bibuła albo żel ułożony w kolumnie chromatograficznej lub wylany

na płytkę. Warunkiem decydującym o rozdziale substancji są różnice w ich rozpuszczalności

w fazie ruchomej i nieruchomej, tj. różnice we współczynnikach podziału między dwie nie

mieszające się ze sobą fazy ciekłe. Chromatografia podziałowa opiera się więc na prawie

Nernsta, które mówi, iż w układzie utworzonym przez dwie nie mieszające się ze sobą fazy

ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stężenia tego solutu w fazie 1 (c

) do jego stężenia w

fazie 2 (c

) jest w stanie równowagi wielkością stałą zależną od temperatury i właściwości

substancji tworzących roztwory, a niezależną od ilości substancji rozpuszczonej: c

= k

Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdzia-

łu, którego wartość określa wzór: β = K

gdzie K

określa stosunek podziału substancji A,

– stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą.

Technika chromatografii bibułowej. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonar-

nej, najczęściej polarnej, jest odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Bibuła jest zbu-

dowana z włókien celulozowych ułożonych w porowatą, żelową strukturę stanowiącą fazę

nieruchomą. Cząsteczki wody zaadsorbowane na bibule łączą się z włóknami celulozy wią-

zaniami wodorowymi. Fazę ruchomą w chromatografii bibułowej stanowią odpowiednie roz-

puszczalniki organiczne pojedyncze lub zmieszane. Rozpuszczalniki muszą się częściowo

mieszać z wodą, np. szeroko rozpowszechnionym układem jest mieszanina n-butanolu/kwasu

octowego/wody, w zmiennych proporcjach.

Szybkość wędrowania danego związku w określonych warunkach jest wartością stałą.

Jej miarą jest wartość R

: R

= x/y, gdzie x oznacza odległość od linii startowej do środka

plamy aminokwasu, a y – odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika. W Tabeli 1

podane są wartości R

dla większości aminokwasów rozdzielanych w warunkach zbliżonych

do tych, w jakich będzie wykonywane ćwiczenie.

Tabela 1. Wartości R

aminokwasów (faza ruchoma: n-butanol/kwas octowy/woda, 4:1:1)

Lp.

Nazwa aminokwasu

Symbol aminokwasu

Wartości R

x 100 w układzie

rozpuszczalników:
n-butanol/CH

COOH/H

alanina

Ala

arginina

Arg

kwas asparaginowy

Asp

asparagina

Asn

cystyna

cysteina

Cys

kwas cysteinowy

CysSO

fenyloalanina

Phe

glicyna

Gly

10.

kwas glutaminowy

Glu

11.

glutamina

Gln

12.

histydyna

His

13.

leucyna

Leu

14.

izoleucyna

Ile

15.

lizyna

Lys

16.

metionina

Met

17.

sulfonian metioniny

MetSO

18.

prolina

Pro

19.

hydroksyprolina

ProOH

20.

seryna

Ser

21.

treonina

Thr

22.

tryptofan

Trp

23.

tyrozyna

Tyr

24.

walina

Val

25.

ornityna

Orn

26.

cytrulina

Cytr

BIAŁKA

Budowa, podział i funkcje białek

Łączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej

makrocząsteczki – polipeptydu. Łańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt ami-

nokwasowych przyjęto określać jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane również wiąza-

niem peptydowym, powstaje z grupy

α-karboksylowej i grupy α-aminowej. Na Ryc. 6A

przedstawiono dipeptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe

jest stabilizowane mezomerycznie, gdyż wiązanie C–N ma częściowo charakter wiązania

podwójnego C=N (Ryc.6B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, że we

wszystkich ułożeniach przestrzennych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna

rotacja jest możliwa tylko wokół wiązania N

−C

i C

–C, a obroty są opisywane przez warto-

ści kątów torsyjnych ϕ (fi) i ψ (psi) (Ryc. 6A).

Ryc. 6. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman i Röhm 2005)

Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt amino-

kwasowych i stabilizowana wiązaniami wodorowymi pomiędzy atomami tlenu i azotu z

ugrupowań peptydowych definiuje strukturę drugorzędową (Ryc. 7).

Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złożone. Białka proste zbu-

dowane są tylko z aminokwasów, natomiast białka złożone zawierają szereg różnych kompo-

nentów nieaminokwasowych, których rodzaj jest podstawą podziału białek na:

−

glikoproteiny – białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), amino-

cukry (N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne monosacha-

rydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)

−

lipoproteiny – zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe

−

metaloproteiny – zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie

−

fosfoproteiny – reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforo-

wym

−

nukleoproteiny – zawierają RNA lub DNA

−

chromoproteiny – zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią różne związki barwne

Na Ryc. 8 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfi-

kacjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc ważne źródło różnorodności

białek.

Ryc. 8. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman i Röhm 2005)

Białka ze względu na pełnione funkcje można podzielić na:

−

enzymatyczne – najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróżnicowanej masie czą-

steczkowej

−

strukturalne – są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen,

elastyna, tubulina, aktyna,

α-keratyna); do białek strukturalnych zalicza się także histony

pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie

−

transportujące – np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO

, niektóre białka

osocza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca żelazo, niektóre

białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów, nośniki w trans-

porcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transporcie aktywnym jonów i meta-

bolitów

−

regulacyjne – np. niektóre hormony (somatotropina, insulina), a także receptory uczestni-

czące w percepcji różnych cząsteczek sygnałowych; białkami regulatorowymi są także

czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów

−

odpornościowe – białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią orga-

nizm przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi dla

organizmu)

−

motoryczne – uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna

funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce

−

zapasowe – np. owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijające-

go się zarodka, ferrytyna wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym mle-

ka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako materiał energe-

tyczny; także wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową

Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na globularne (kuliste) i fi-

brylarne (włókienkowate, skleroproteiny). Do białek fibrylarnych należą: α-keratyny wło-

sów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina

jedwabiu. Białka globularne obejmują: białka obojętne (albuminy, globuliny), białka kwaśne

(prolaminy, gluteiny) oraz białka zasadowe (histony, protaminy).

Na Ryc. 9 przedstawiono schematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktu-

ry kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.

WYKONANIE

Chromatografia bibułowa aminokwasów (wstępująca)

Na arkusz bibuły o wymiarach 15 x 20 cm z zaznaczoną linią startową, nanieść w 2

cm odstępach po kilka µl roztworu wzorcowych aminokwasów (glicyna, alanina, tyrozyna,

leucyna) oraz taką samą objętość roztworu zawierającego mieszaninę aminokwasów (próba

badana). Każdy aminokwas wzorcowy oraz próbę badaną nanieść na bibułę dwukrotnie w

celu wyeliminowania ewentualnych artefaktów. W czasie nanoszenia próbek miejsce nano-

szenia należy suszyć suszarką do włosów, tak by wielkość plamek była możliwie jak naj-

mniejsza. Arkusz bibuły z naniesionymi próbkami zwinąć w cylinder, spiąć zszywkami i

umieścić do rozwinięcia w komorze chromatograficznej. Rozdział przerwać, gdy rozpusz-

czalnik dotrze na wysokość około 1,5 cm od górnego brzegu bibuły. Po wyjęciu bibuły z ko-

mory, zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, bibułę wysuszyć w strumieniu ciepłego

powietrza (ok. 50

C), spryskać roztworem ninhydryny, a następnie wysuszyć w suszarce w

temperaturze 80

C w celu zlokalizowania miejsca położenia rozdzielonych aminokwasów.

Pomierzyć odległości od linii startu do środka wybarwionych plamek oraz odległość do czoła

rozpuszczalnika, a następnie obliczyć wartości współczynnika R

. Porównując wartości R

aminokwasów wzorcowych i aminokwasów zawartych w próbce zidentyfikować aminokwa-

sy występujące w otrzymanej do analizy mieszaninie. Należy również porównać wyliczone

wartości R

z wartościami zamieszczonymi w Tabeli 1.

Reakcje charakterystyczne aminokwasów

A. Reakcje ogólne:

Reakcja z ninhydryną

Do 0,1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 1 kroplę 0,1% roztworu ninhydryny i

ogrzać do wrzenia. Pojawia się fioletowo-niebieskie zabarwienie. Aminokwasy pod wpły-

wem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów (reakcja poniżej). Kolejne etapy prze-

mian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom wę-

gla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyższym procesie cząsteczki nin-

hydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum ab-

sorpcji przy

λ = 570 nm), którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu amino-

wego aminokwasu. Reakcja z ninhydryną może służyć do ilościowego oznaczania aminokwa-

sów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów,

peptydów i białek także sole amonowe, aminocukry i amoniak.

Reakcja aminokwasów z ninhydryną

B. Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów

Reakcja ksantoproteinowa

Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml stężonego HNO

i kroplę stężone-

go H

. Roztwór barwi się na żółto. Po zalkalizowaniu 30% roztworem NaOH, zabarwie-

nie przechodzi w pomarańczowe. Reakcja ta jest charakterystyczna dla aminokwasów aro-

matycznych i fenoli. W wyniku działania stężonego HNO

pierścień benzenowy ulega ni-

trowaniu, a powstałe żółte pochodne wielonitrowe dają w roztworze zasadowym pomarań-

czowe aniony nitrofenolanowe.

Reakcja cystynowa

Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,5 ml 10% roztworu NaOH i kilka kropel

nasyconego roztworu octanu ołowiu. Podczas ogrzewania ze stężonym NaOH, z cystyny i

cysteiny wydziela się siarkowodór, który w reakcji z Pb

daje siarczek ołowiu. Po dłuższym

gotowaniu roztwór staje się brunatny, a następnie wytrąca się osad PbS.

Pb(OOC-CH

)

Pb(OH)

PbS

↓

NaOH

Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową

Zasada metody:

Metoda polega na oznaczaniu natężenia barwy powstałej w wyniku wytworzenia

związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z mak-

simum absorbancji przy

λ = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest propor-

cjonalna do liczby wiązań peptydowych. Zależność ta jest wykorzystywana do ilościowego

oznaczania białek. Czułość metody – 0,1 mg/ml.

Nazwa reakcji pochodzi od biuretu, związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch czą-

steczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe:

Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdyż jon

amonu daje również barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza także

siarczan (VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotle-

nek magnezu maskuje właściwy odczyn.

Odczynniki:

Standardowy roztwór albuminy – 10 mg/ml w 0,9% NaCl

Odczynnik biuretowy – 1,5 g 5hydratu CuSO4 i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w

500 ml wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale miesza-

jąc dodać 300 ml 10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczyn-

nik jest stabilny.

Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stężenia białek w surowicy krwi

Do suchych probówek odmierzyć kolejno pipetą podane w tabeli objętości standardo-

wego roztworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. Każdą próbę wykonać w dwóch

powtórzeniach.

Nr próby

Stężenie albuminy (mg/próbę) 1

Roztwór standardowy (ml)

Woda destylowana (ml)

Odczynnik biuretowy (ml)

540nm

śr

K =

0,1

0,4

2,0

0,2

0,3

2,0

0,3

0,2

2,0

0,4

0,1

2,0

0,5

2,0

0,5

2,0

Równocześnie należy oznaczyć zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi.

Do oznaczeń pobrać 0,5 ml surowicy (w dwóch powtórzeniach) i dodać 2 ml odczynnika biu-

retowego. Po upływie 30 minut zmierzyć absorbancję wszystkich prób przy długości fali

λ =

540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonać względem próby zerowej nie zawierającej białka

mg albuminy w próbie

540 nm

(próba 6). Zapisać wyniki w tabeli i obliczyć współczynnik kierunkowy K. Narysować krzy-

wą wzorcową (zależność wartości absorbancji od stężenia białka w próbie). Przy obliczaniu

ilości białka w próbie stosować obliczony współczynnik K. Z oznaczonej w próbie zawartości

białka obliczyć stężenie białka w surowicy.

Zagadnienia do przygotowania:

−

wzory, symbole trzy- i jednoliterowe aminokwasów proteinogennych oraz aminokwasów

cyklu mocznikowego (ornityna, cytrulina)

−

klasyfikacja aminokwasów oparta na budowie chemicznej łańcucha bocznego oraz jego

polarności

−

podstawowe funkcje aminokwasów (przykłady)

−

ogólne zasady chromatografii podziałowej; technika chromatografii bibułowej wstępującej

−

reakcje ogólne na aminokwasy (znajomość reakcji z ninhydryną)

−

wybrane reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

−

budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)

−

struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)

−

wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek

−

podział białek ze względu na funkcję (przykłady)

−

kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)

Literatura:

Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005

Zarys biochemii – P Karlson PWN, Warszawa, 1987

Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN, Warszawa, 2005

Biochemia. Ilustrowany przewodnik – J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005