Dwiczenie 8

(MOiŚ)

T: Aktywnośd biochemiczna i fizjologiczna bakterii na wybranych podłożach identyfikacyjnych. Testy
identyfikacyjne.

I)

Podłoża identyfikacyjne

Służą do określania przynależności bakterii do konkretnego gatunku na podstawie ich
cech biochemicznych i fizjologicznych. Aby w pełni zidentyfikowad szczep bakteryjny
określa się zwykle co najmniej 20 takich cech.

1) Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych

a) wykorzystanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla

b) wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla

c) wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)

d) rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)

e) fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a)

f) wytwarzanie acetoiny (test Voges-Proskauer) [T]

2) Metabolizm związków azotu

a) dekarboksylacja lizyny i ornityny

b) dwuhydroksylaza argininy

c) dezaminacja fenyloalaniny [T]

d) wytwarzanie indolu (SIM) [T]

e) wytwarzanie H

2

S (SIM)

f) ruch (SIM)

g) rozkład mocznika (ureaza)

h) redukcja azotanów do azotynów [T]

1) test na oksydazę cytochromową

2) test na obecnośd katalazy

3) test na obecnośd koagulazy



test probówkowy



CF

1.

Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych

a) test na podłożu Simmonsa na wykorzystanie cytrynianu jako źródła węgla
cytrynian – jedyne źródło węgla w pożywce
fosforan amonu – jedyne źródło azotu
błękit bromotymolowy – wskaźnik
Bakterie pozyskujące cytrynian z podłoża alkalizują pożywkę. Reaguje błękit bromotymolowy
zmieniając barwę z zielonej na niebieską. Aby bakterie pozyskiwały i rozkładały cytrynian
muszą mied odpowiednią permeazę (transport do komórki) oraz liazę cytrynianową.

b) test na wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla
Jeżeli bakterie mają zdolnośd pozyskiwania malonianu to alkalizują tym samym podłoże i
reaguje wskaźnik – błękit bromotymolowy. Barwa podłoża zmienia się z zielonej na niebieską.

c) wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol)

W płynnym podłożu znajduje się 1-2% cukru lub alkoholu oraz wskaźnik – błękit
bromotymolowy. W wyniku rozkładu cukru lub alkoholu podłoże ulega zakwaszeniu. Reaguje
wskaźnik i podłoże z barwy zielonej zmienia się na żółtą. Jest to reakcja dodatnia.

d) rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)

Jest to test na wykorzystanie cukru/alkoholu jednak w probówce dodatkowo umieszczona jest
rurka Dűrhama (szklana rurka z otworem z jednej strony skierowanym w dół). Wytwarzanie
gazu obserwuje się tylko w probówkach z dodatnią reakcją na rozkład cukru lub alkoholu – czyli
w takich, gdzie podłoże zabarwiło się na żółto. Jeżeli w rurce widad pęcherzyk powietrza to
bakterie w trakcie metabolizowania cukru wytwarzają gaz i reakcja jest dodatnia. Jeżeli
podłoże pozostało zielone to dalszy etap identyfikacji pomija się – reakcja jest ujemna.

e) fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a)

Na podłożu umieszczona jest warstwa parafiny uniemożliwiająca dostęp tlenu. Na tym podłożu
stwierdzamy zdolnośd bakterii do fermentacji glukozy. Jeżeli w warunkach beztlenowych
bakterie wykorzystują cukier to zakwaszają podłoże i reaguje błękit bromotymolowy
zmieniając barwę z zielonej na żółtą.

f) wytwarzanie acetoiny (odczyn Voges-Proskauer; V-P)

Test ten wykonuje sie na podłożu Clarka z glukozą. Po inkubacji dodaje się odpowiednie
odczynniki w celu stwierdzenia obecności acetoiny.

Acetoina jest produktem szlaku 2,3-butandiolowego:

glukoza -------> 2 x pirogronian-----(kondensacja, dekarboksylacja)-----> acetomleczan ---
(dekarboksylacja)----> acetoina

acetoina----(warunki beztlenowe, redukcja)--->2,3 butandiol

acetoina----(warunki utleniające)----> diacetyl

W celu przeprowadzenia testu do probówki dodaje się:



0,6 ml Alfa-Naftolu (silny utleniacz)



0,6 ml KOH (warunki alkaliczne)

Następnie inkubuje się probówkę 30 min. w 37st C.

Acetoina w warunkach zasadowych zostaje utleniona przy udziale alfa-naftolu do diacetylu.
Diacetyl reaguje z ugrupowaniem guanidynowym, które wchodzi w skład aminokwasów
(pepton itp.) i daje czerwony pierścieo. Widoczny pierścieo to reakcja dodatnia.

2. Metabolizm związków azotu

a)

dekarboksylacja lizyny i ornityny

Bakterie mające odpowiednie enzymy (dekarboksylaza lizyny/ornityny) mają zdolnośd
przekształcania aminokwasów do amin (lizyny do kadaweryny; ornityny do putrescyny).
Wytwarzanie tych enzymów jest indukowane niskim pH podłoża.

W skład podłoża wchodzi m.in. glukoza, chlorowodorek lizyny/ornityny oraz błękit
bromotymolowy – co nadaje całości barwę zieloną. Bakterie inkubuje się 24 godziny a
następnie odczytuje wynik.

Bakterie w pierwszej kolejności pobierają z podłoża glukozę. Następuje zakwaszenie podłoża,
które z zielonego przechodzi w żółte (reaguje błękit bromotymolowy). Poprzez zakwaszenie
następuje aktywacja dekarboksylazy lizyny/ornityny. Powstałe z aminokwasów aminy alkalizują
podłoże i z barwy żółtej przechodzi ono w zieloną – zielona barwa podłoża świadczy o reakcji
dodatniej*. Reakcję prowadzimy równolegle w kontrolnej probówce pozbawionej lizyny i
ornityny. Należy tak robid ponieważ nie wiadomo czy w próbie właściwej zielone podłoże jest
wynikiem wykorzystania ornityny i lizyny czy po prostu dany szczep bakteryjny nie pobiera
glukozy i żadna reakcja w probówce nie zaszła.

b)

dwuhydroksylaza argininy

Przeprowadza sie na podłożu Tornley’a, w skład którego wchodzi m.in czerwieo fenolowa
(wskaźnik) oraz nawarstwiona jest parafina (warunki beztlenowe).

Arginina jest rozkładana dwuetapowo. Dwuhydrolaza argininy (syn. desymidaza argininy)
rozkłada argininę do cytruliny i amoniaku. W wyniku działania cytrulinazy

(ureidazy cytruliny)

powstaje ornityna, amoniak i CO

2

. W tych dwóch reakcjach powstają więc dwie cząsteczki

amoniaku, który silnie alkalizuje podłoże. Wskaźnikiem jest czerwieo fenolowa, która zmienia
się z lekko różowej barwy na silnie różową.

c)

dezaminacja fenyloalaniny

Test wykonuje się na skosie agarowym. W wyniku dezaminacji fenyloalanina przechodzi w
kwas fenylopirogronowy, który z jonami żelazowymi daje charakterystyczne zabarwienie.

Do podłoża z posianym szczepem dodajemy 3% FeCl

3

(barwa pomaraoczowa). Jeżeli odczynnik

pozostaje pomaraoczowy to reakcja ujemna. Jeżeli zmieni barwę na zielono-szmaragdową to
znaczy, że bakterie na podłożu mają zdolnośd do dezaminacji fenyloalaniny.

d)

wytwarzanie indolu (SIM)

Test przeprowadza sie na podłożu SIM. Niektóre bakterie mają zdolnośd do przekształcania
tryptofanu w indol, pirogronian i amoniak. Obecnośd indolu w pożywce wykrywa sie za
pomocą odczynnika Kovacs’a.

Skład odczynnika Kovacs’a:



para-2-metylo-amino-benzaldehyd



alkohol amylowy



stęż. HCl

Po dodaniu odczynnika inkubujemy probówkę 10 min. w 37° C. Powstały czerwony pierścieo
świadczy o wyniku dodatnim.

e)

wytwarzanie H

2

S (SIM)

Test przeprowadza sie na podłożu SIM, w skład którego wchodzi m.in. tiosiarczan sodu. Jeżeli
bakterie mają zdolnośd do produkcji reduktazy tiosiarczanowej to redukują tiosiarczan do H

2

S.

H

2

S reaguje natomiast z jonami żelazawymi zawartymi w podłożu. Powstaje siarczek żelaza (II),

który ma barwę czarną. Reakcja dodatnia – podłoże zabarwione na czarno.

Bakterie mogą tez wytwarzad desulfhydrazę cysteiny i wtedy redukują siarkę z aminokwasu
cysteiny co daje taki sam efekt jak w przypadku redukcji tiosiarczanu.

f) ruch (SIM)

Podłoże SIM to podłoże stałe. Posiew jest w postaci wkłucia. Jeżeli wzrost bakterii tylko w
miejscu wkłucia to bakterie nie maja zdolności ruchu. Jeżeli natomiast wzrost występuje w
całym podłożu to świadczy o ruchliwości danego szczepu.

g)

rozkład mocznika (ureaza)

Wykonuje się ten test na podłożu Christensena zawierającym mocznik i czerwieo fenolową
(wskaźnik). Mocznik jest rozkładany przez ureazę (rozcina wiązania pomiędzy C i N). Powstaje
amoniak i dwutlenek węgla. Podłoże ulega alkalizacji i reaguje wskaźnik zmieniając się z barwy
lekko różowej na silnie różową.

h)

redukcja azotanów do azotynów

Istnieją dwie drogi redukcji azotanów



asymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> hydroksyamina -> amoniak)



dysymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> podtlenek azotu -> azot cząsteczkowy)

Test przeprowadza sie na bulionie zwykłym z dodatkiem KNO

3

. Bakterie redukujące azotany

(wytwarzające m.in. reduktazę azotanową) wykrywamy poprzez obecnośd azotynów. Po
inkubacji bakterii dodajemy dwa odczynniki:

Griess’a A (kw. sulfanilowy)

Griess’a B (alfa-naftyloamina)

Odczynniki łączą się z azotynami i powstaje czerwony kompleks. Świadczy to o reakcji
dodatniej. Jednak brak czerwonego zabarwienia nie musi świadczyd o braku redukcji azotanów.
Byd może wszystkie azotyny zostały juz przekształcone w dalsze produkty szlaku
metabolicznego.

Aby to sprawdzid dodajemy pył cynkowy. Powoduje on natychmiastową redukcję azotanów do
azotynów. Tak więc jeżeli w pożywce nadal były nieprzetworzone azotany to zredukują się i
utworzą barwny kompleks z Griess A i Griess B. Jeżeli tak się stanie to znaczy, że to pył cynkowy
zredukował azotany, a nie bakterie więc reakcja jest ujemna. Jeżeli natomiast po dodaniu pyłu
cynkowego barwa sie nie zmieni to znaczy, że bakterie przekształciły wszystkie azotany.
Reakcja jest wtedy dodatnia.

1)

Test na oksydazę cytochromową

Oksydaza cytochromowa (oksydaza cytochromu c) to ostatnie białko łaocucha oddechowego.
Przenosi elektrony na tlen. W celu wykrycia tego kompleksu u bakterii na bibułę nakrapiamy
odczynnik Kovacs’a (2) (tetra-metyl-para-fenylendiamina). Następnie nanosimy szczep
bakteryjny. Jeżeli w ciągu 10 sekund pojawi się ciemnoniebieskie zabarwienie to reakcja jest
dodatnia.

Szczepy nanosimy ezą platynową (metal szlachetny), żeby zapobiec transportowi elektronów z
ezy na oksydazę cytochromową.

Elektrony z odczynnika Kovacs’a przechodzą na oksydazę, a następnie na tlen. Sam odczynnik
przechodzi w błękit Wűrstera (ciemny niebieski kolor).

2)

Test na obecnośd katalazy

Katalaza to enzym rozkładający nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Katalaza
pomaga niektórym bakteriom bronid się przed nadtlenkiem wodoru produkowanym przez
układ immunologiczny. Katalazę wytwarzają na przykład gronkowce.
3% roztwór nadtlenku wodoru nakrapiamy na kolonie bakteryjne. Jeżeli powstają pęcherzyki
gazu(tlen) to oznacza, że bakterie wytwarzają katalazę.

3)

Test na obecnośd koagulazy

Koagulaza jest to enzym, który przekształca protrombinę zawartą w osoczu w tzw.
„staphylotrombinę”. Ta ostatnia katalizuje reakcję przekształcenia rozpuszczalnego w osoczu
fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę. Fibryna powstała drogą patologiczną za
pośrednictwem bakterii chorobotwórczych powoduje skrzepy wewnątrznaczyniowe. Bakterie
mogą wytwarzad koagulazę, która jest związana z powierzchną ściany komórkowej lub
uwalnianą do środowiska (tzw. koagulaza wolna).

Wyróżniamy 2 rodzaje testów na obecnośd koagulazy:

a)

test na koagulazę wolną i związaną (test probówkowy)

Do probówki zawierającej osocze królika posiewamy szczep bakteryjny i inkubujemy przez 24
h. Jeżeli można zaobserwowad zestalenie osocza to badany szczep jest koagulazo-dodatni
b)

test na koagulazę związaną ze ścianą komórkową (CF-clumping factor; czynnik zlepny)

Na szkiełko podstawowe nanosimy 1 kroplę 0,85% NaCl i obok jedną kroplę osocza królika. Do
obu kropli wprowadzamy po 1 kolonii bakteryjnej, a następnie mieszamy. Jeżeli w kropli z
plazmą króliczą powstają strąty (następuje zestalenie osocza) to szczep ma koagulazę związaną
ze ściana komórkową. Kolonia wprowadzona do NaCl służy jako próba kontrolna. Gdyby także
w tym przypadku zaobserwowano strąty oznaczałoby to, że szczep ma zdolnośd do
autoaglutynacji i testu nie można brad wtedy pod uwagę.