Dwiczenie 8 

(MOiŚ)

 

T: Aktywnośd biochemiczna i fizjologiczna bakterii na wybranych podłożach identyfikacyjnych. Testy 
identyfikacyjne. 

 

I) 

Podłoża identyfikacyjne 

Służą do określania przynależności bakterii do konkretnego gatunku na podstawie ich 
cech biochemicznych i fizjologicznych. Aby w pełni zidentyfikowad szczep bakteryjny 
określa się zwykle co najmniej 20 takich cech. 
 

1)  Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych 

a)  wykorzystanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla 

b)  wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla 

c)  wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol) 

d)  rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)  

e)  fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a) 

f)  wytwarzanie acetoiny (test Voges-Proskauer) [T] 

2)  Metabolizm związków azotu 

a)  dekarboksylacja lizyny i ornityny 

b)  dwuhydroksylaza argininy 

c)  dezaminacja fenyloalaniny [T] 

d)  wytwarzanie indolu (SIM) [T] 

e)  wytwarzanie H

2

S (SIM) 

f)  ruch (SIM) 

g)  rozkład mocznika (ureaza) 

h)  redukcja azotanów do azotynów [T] 

1)  test na oksydazę cytochromową 

2)  test na obecnośd katalazy 

3)  test na obecnośd koagulazy 



 

test probówkowy 



 

CF 

1. 

Wykorzystanie cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych 

 

a)  test na podłożu Simmonsa na wykorzystanie cytrynianu jako źródła węgla 
cytrynian – jedyne źródło węgla w pożywce 
fosforan amonu – jedyne źródło azotu 
błękit bromotymolowy – wskaźnik 
Bakterie pozyskujące cytrynian z podłoża alkalizują pożywkę. Reaguje błękit bromotymolowy 
zmieniając barwę z zielonej na niebieską. Aby bakterie pozyskiwały i rozkładały cytrynian 
muszą mied odpowiednią permeazę (transport do komórki) oraz liazę cytrynianową. 
 
b)  test na wykorzystanie malonianu jako jedynego źródła węgla 
Jeżeli bakterie mają zdolnośd pozyskiwania malonianu to alkalizują tym samym podłoże i 
reaguje wskaźnik – błękit bromotymolowy. Barwa podłoża zmienia się z zielonej na niebieską. 

 

c)  wykorzystanie cukru lub alkoholu (glukoza/laktoza/mannitol/sorbitol) 

W płynnym podłożu znajduje się 1-2% cukru lub alkoholu oraz wskaźnik – błękit 
bromotymolowy. W wyniku rozkładu cukru lub alkoholu podłoże ulega zakwaszeniu. Reaguje 
wskaźnik i podłoże z barwy zielonej zmienia się na żółtą. Jest to reakcja dodatnia. 

d)  rozkład cukru/alkoholu z wydzieleniem gazu (podłoże z rurką Dűrhama)  

Jest to test na wykorzystanie cukru/alkoholu jednak w probówce dodatkowo umieszczona jest 
rurka Dűrhama (szklana rurka z otworem z jednej strony skierowanym w dół). Wytwarzanie 
gazu obserwuje się tylko w probówkach z dodatnią reakcją na rozkład cukru lub alkoholu – czyli 
w takich, gdzie podłoże zabarwiło się na żółto. Jeżeli w rurce widad pęcherzyk powietrza to 
bakterie w trakcie metabolizowania cukru wytwarzają gaz i reakcja jest dodatnia. Jeżeli 
podłoże pozostało zielone to dalszy etap identyfikacji pomija się – reakcja jest ujemna. 

e)  fermentacja glukozy (podłoże H-L, Hugh-Leifson’a) 

Na podłożu umieszczona jest warstwa parafiny uniemożliwiająca dostęp tlenu. Na tym podłożu 
stwierdzamy zdolnośd bakterii do fermentacji glukozy. Jeżeli w warunkach beztlenowych 
bakterie wykorzystują cukier to zakwaszają podłoże i reaguje błękit bromotymolowy 
zmieniając barwę z zielonej na żółtą. 

f)  wytwarzanie acetoiny (odczyn Voges-Proskauer; V-P) 

Test ten wykonuje sie na podłożu Clarka z glukozą. Po inkubacji dodaje się odpowiednie 
odczynniki w celu stwierdzenia obecności acetoiny. 

Acetoina jest produktem szlaku 2,3-butandiolowego: 

glukoza -------> 2 x pirogronian-----(kondensacja, dekarboksylacja)-----> acetomleczan ---
(dekarboksylacja)----> acetoina  

acetoina----(warunki beztlenowe, redukcja)--->2,3 butandiol 

  acetoina----(warunki utleniające)----> diacetyl 

W celu przeprowadzenia testu do probówki dodaje się: 



 

0,6 ml Alfa-Naftolu (silny utleniacz) 



 

0,6 ml KOH (warunki alkaliczne) 

Następnie inkubuje się probówkę 30 min. w 37st C. 

Acetoina w warunkach zasadowych zostaje utleniona przy udziale alfa-naftolu do diacetylu. 
Diacetyl reaguje z ugrupowaniem guanidynowym, które wchodzi w skład aminokwasów 
(pepton itp.) i daje czerwony pierścieo. Widoczny pierścieo to reakcja dodatnia. 

2.  Metabolizm związków azotu 

a) 

dekarboksylacja lizyny i ornityny 

Bakterie mające odpowiednie enzymy (dekarboksylaza lizyny/ornityny) mają zdolnośd 
przekształcania aminokwasów do amin (lizyny do kadaweryny; ornityny do putrescyny). 
Wytwarzanie tych enzymów jest indukowane niskim pH podłoża. 

W skład podłoża wchodzi m.in. glukoza, chlorowodorek lizyny/ornityny oraz błękit 
bromotymolowy – co nadaje całości barwę zieloną. Bakterie inkubuje się 24 godziny a 
następnie odczytuje wynik. 

Bakterie w pierwszej kolejności pobierają z podłoża glukozę. Następuje zakwaszenie podłoża, 
które z zielonego przechodzi w żółte (reaguje błękit bromotymolowy). Poprzez zakwaszenie 
następuje aktywacja dekarboksylazy lizyny/ornityny. Powstałe z aminokwasów aminy alkalizują 
podłoże i z barwy żółtej przechodzi ono w zieloną – zielona barwa podłoża świadczy o reakcji 
dodatniej*. Reakcję prowadzimy równolegle w kontrolnej probówce pozbawionej lizyny i 
ornityny. Należy tak robid ponieważ nie wiadomo czy w próbie właściwej zielone podłoże jest 
wynikiem wykorzystania ornityny i lizyny czy po prostu dany szczep bakteryjny nie pobiera 
glukozy i żadna reakcja w probówce nie zaszła. 

b) 

dwuhydroksylaza argininy 

Przeprowadza sie na podłożu Tornley’a, w skład którego wchodzi m.in czerwieo fenolowa 
(wskaźnik) oraz nawarstwiona jest parafina (warunki beztlenowe). 

Arginina jest rozkładana dwuetapowo. Dwuhydrolaza argininy (syn. desymidaza argininy) 
rozkłada argininę do cytruliny i amoniaku. W wyniku działania cytrulinazy

 

(ureidazy cytruliny) 

powstaje ornityna, amoniak i CO

2

. W tych dwóch reakcjach powstają więc dwie cząsteczki 

amoniaku, który silnie alkalizuje podłoże. Wskaźnikiem jest czerwieo fenolowa, która zmienia 
się z lekko różowej barwy na silnie różową. 

c) 

dezaminacja fenyloalaniny 

Test wykonuje się na skosie agarowym. W wyniku dezaminacji fenyloalanina przechodzi w 
kwas fenylopirogronowy, który z jonami żelazowymi daje charakterystyczne zabarwienie. 

Do podłoża z posianym szczepem dodajemy 3% FeCl

3

 (barwa pomaraoczowa). Jeżeli odczynnik 

pozostaje pomaraoczowy to reakcja ujemna. Jeżeli zmieni barwę na zielono-szmaragdową to 
znaczy, że bakterie na podłożu mają zdolnośd do dezaminacji fenyloalaniny. 

d) 

wytwarzanie indolu (SIM)  

Test przeprowadza sie na podłożu SIM. Niektóre bakterie mają zdolnośd do przekształcania 
tryptofanu w indol, pirogronian i amoniak. Obecnośd indolu w pożywce wykrywa sie za 
pomocą odczynnika Kovacs’a. 

Skład odczynnika Kovacs’a: 



 

para-2-metylo-amino-benzaldehyd 



 

alkohol amylowy 



 

stęż. HCl 

Po dodaniu odczynnika inkubujemy probówkę 10 min. w 37° C. Powstały czerwony pierścieo 
świadczy o wyniku dodatnim. 

 

e) 

wytwarzanie H

2

S (SIM) 

Test przeprowadza sie na podłożu SIM, w skład którego wchodzi m.in. tiosiarczan sodu. Jeżeli 
bakterie mają zdolnośd do produkcji reduktazy tiosiarczanowej to redukują tiosiarczan do H

2

S. 

H

2

S reaguje natomiast z jonami żelazawymi zawartymi w podłożu. Powstaje siarczek żelaza (II), 

który ma barwę czarną. Reakcja dodatnia – podłoże zabarwione na czarno. 

Bakterie mogą tez wytwarzad desulfhydrazę cysteiny i wtedy redukują siarkę z aminokwasu 
cysteiny co daje taki sam efekt jak w przypadku redukcji tiosiarczanu. 

f)  ruch (SIM) 

Podłoże SIM to podłoże stałe. Posiew jest w postaci wkłucia. Jeżeli wzrost bakterii tylko w 
miejscu wkłucia to bakterie nie maja zdolności ruchu. Jeżeli natomiast wzrost występuje w 
całym podłożu to świadczy o ruchliwości danego szczepu. 

g) 

rozkład mocznika (ureaza) 

Wykonuje się ten test na podłożu Christensena zawierającym mocznik i czerwieo fenolową 
(wskaźnik). Mocznik jest rozkładany przez ureazę (rozcina wiązania pomiędzy C i N). Powstaje 
amoniak i dwutlenek węgla. Podłoże ulega alkalizacji i reaguje wskaźnik zmieniając się z barwy 
lekko różowej na silnie różową. 

h) 

redukcja azotanów do azotynów 

Istnieją dwie drogi redukcji azotanów 



 

asymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> hydroksyamina -> amoniak) 



 

dysymilacyjna (azotany -> azotyny -> tlenek azotu -> podtlenek azotu -> azot cząsteczkowy) 

Test przeprowadza sie na bulionie zwykłym z dodatkiem KNO

3

. Bakterie redukujące azotany 

(wytwarzające m.in. reduktazę azotanową) wykrywamy poprzez obecnośd azotynów. Po 
inkubacji bakterii dodajemy dwa odczynniki: 

Griess’a A (kw. sulfanilowy) 

Griess’a B (alfa-naftyloamina) 

Odczynniki łączą się z azotynami i powstaje czerwony kompleks. Świadczy to o reakcji 
dodatniej. Jednak brak czerwonego zabarwienia nie musi świadczyd o braku redukcji azotanów. 
Byd może wszystkie azotyny zostały juz przekształcone w dalsze produkty szlaku 
metabolicznego.  

Aby to sprawdzid dodajemy pył cynkowy. Powoduje on natychmiastową redukcję azotanów do 
azotynów. Tak więc jeżeli w pożywce nadal były nieprzetworzone azotany to zredukują się i 
utworzą barwny kompleks z Griess A i Griess B. Jeżeli tak się stanie to znaczy, że to pył cynkowy 
zredukował azotany, a nie bakterie więc reakcja jest ujemna. Jeżeli natomiast po dodaniu pyłu 
cynkowego barwa sie nie zmieni to znaczy, że bakterie przekształciły wszystkie azotany. 
Reakcja jest wtedy dodatnia. 

 

 

1) 

Test na oksydazę cytochromową 

Oksydaza cytochromowa (oksydaza cytochromu c) to ostatnie białko łaocucha oddechowego. 
Przenosi elektrony na tlen. W celu wykrycia tego kompleksu u bakterii na bibułę nakrapiamy 
odczynnik Kovacs’a (2) (tetra-metyl-para-fenylendiamina). Następnie nanosimy szczep 
bakteryjny. Jeżeli w ciągu 10 sekund pojawi się ciemnoniebieskie zabarwienie to reakcja jest 
dodatnia. 

Szczepy nanosimy ezą platynową (metal szlachetny), żeby zapobiec transportowi elektronów z 
ezy na oksydazę cytochromową. 

Elektrony z odczynnika Kovacs’a przechodzą na oksydazę, a następnie na tlen. Sam odczynnik 
przechodzi w błękit Wűrstera (ciemny niebieski kolor). 

2) 

Test na obecnośd katalazy 

 
Katalaza to enzym rozkładający nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Katalaza 
pomaga niektórym bakteriom bronid się przed nadtlenkiem wodoru produkowanym przez 
układ immunologiczny. Katalazę wytwarzają na przykład gronkowce. 
3% roztwór nadtlenku wodoru nakrapiamy na kolonie bakteryjne. Jeżeli powstają pęcherzyki 
gazu(tlen) to oznacza, że bakterie wytwarzają katalazę. 
 
 

 
3) 

Test na obecnośd koagulazy 

 
Koagulaza jest to enzym, który przekształca protrombinę zawartą w osoczu w tzw. 
„staphylotrombinę”. Ta ostatnia katalizuje reakcję przekształcenia rozpuszczalnego w osoczu 
fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę. Fibryna powstała drogą patologiczną za 
pośrednictwem bakterii chorobotwórczych powoduje skrzepy wewnątrznaczyniowe. Bakterie 
mogą wytwarzad koagulazę, która jest związana z powierzchną ściany komórkowej lub 
uwalnianą do środowiska (tzw. koagulaza wolna).  
 
Wyróżniamy 2 rodzaje testów na obecnośd koagulazy: 
 
a) 

test na koagulazę wolną i związaną (test probówkowy) 

Do probówki zawierającej osocze królika posiewamy szczep bakteryjny i inkubujemy przez 24 
h. Jeżeli można zaobserwowad zestalenie osocza to badany szczep jest koagulazo-dodatni 
b) 

test na koagulazę związaną ze ścianą komórkową (CF-clumping factor; czynnik zlepny) 

Na szkiełko podstawowe nanosimy 1 kroplę 0,85% NaCl i obok jedną kroplę osocza królika. Do 
obu kropli wprowadzamy po 1 kolonii bakteryjnej, a następnie mieszamy. Jeżeli w kropli z 
plazmą króliczą powstają strąty (następuje zestalenie osocza) to szczep ma koagulazę związaną 
ze ściana komórkową. Kolonia wprowadzona do NaCl służy jako próba kontrolna. Gdyby także 
w tym przypadku zaobserwowano strąty oznaczałoby to, że szczep ma zdolnośd do 
autoaglutynacji i testu nie można brad wtedy pod uwagę.