Ć

wiczenie 9

Cukry proste

Wyci

ą

g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych

-

α

-naftol – T+

-

etanol 96% – F

-

kwas siarkowy – C

-

benzydyna – T, N, R/M1

-

kwas octowy – C

-

kwas solny – C

-

odczynniki Fehlinga I – N

-

odczynniki Fehlinga II – C

-

odczynnik Nylandera – C

-

rezorcyna – Xn, N

Cukry proste (monosacharydy, jednocukry) to najprostsze w

ę

glowodany. S

ą

one syntetyzowane w

organizmach samo

ż

ywnych w procesie fotosyntezy i chemosyntezy. Ich nazewnictwo chemiczne opiera si

ę

na ilo

ś

ci atomów w

ę

gla w cz

ą

steczce, których mo

ż

e by

ć

od 3 do 8. St

ą

d mówimy o triozach posiadaj

ą

cych

3 atomy w

ę

gla i konsekwentnie o tetrozach, pentozach (zwyczajowe nazwy: arabinoza, ksyloza, ryboza),

heksozach (zwyczajowo: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza), heptozach i oktozach, które maj

ą

odpowiednio 4, 5, 6, 7 i 8 atomów w

ę

gla. Ogólny, sumaryczny wzór cz

ą

steczki monosacharydu to C

n

H

2n

O

n

.

Ze wzgl

ę

du na klasyfikacje chemiczn

ą

monocukry nale

żą

do polihydroksyketonów lub

polihydroksyaldehydów, w zale

ż

no

ś

ci od wyst

ę

puj

ą

cej w cz

ą

steczce grupy ketonowej lub aldehydowej.

Charakterystyczna jest tak

ż

e obecno

ść

w cz

ą

steczce cukru asymetrycznych atomów w

ę

gla, które

poł

ą

czone z 4 ro

ż

nymi podstawnikami, tworz

ą

tzw. centra chiralno

ś

ci. Efektem tego jest wyst

ę

powanie

cz

ą

steczek cukrów w formach stereoizomerów.

Charakterystyka fizykochemiczna: monosacharydy s

ą

substancjami krystalicznymi, bez zapachu, o

słodkim smaku. Dobrze rozpuszczaj

ą

si

ę

w wodzie a słabo w alkoholu etylowym. Daj

ą

reakcje wła

ś

ciwe

aldehydom i ketonom, np. redukuj

ą

odczynniki Tollensa i Fehlinga, utleniaj

ą

c si

ę

do kwasów aldonowych

(D-glukoza do kwasu D-glukonowego), redukowane tworz

ą

alditole (np. D-glukoza — sorbitol), z alkoholami

lub fenolami tworz

ą

glikozydy, a z innymi cz

ą

steczkami sacharydów — di-, oligo- lub polisacharydy;

monosacharydy ulegaj

ą

tak

ż

e reakcjom wła

ś

ciwym alkoholom — tworz

ą

estry z kwasami (np. glukozo-6-

fosforan), utleniaj

ą

si

ę

do kwasu uronowego (np. kwas glukuronowy). Wchodz

ą

tak

ż

e w skład glikolipidów,

glikoprotein oraz kwasów nukleinowych.
Literatura:
„Biochemia” J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, PWN, 2005
„Biochemia Harpera” R.K. Murray i in., Wydanictwo Lekarskie PZWL, 2006

1. Analiza jako

ś

ciowa monosacharydów

Reakcje kondensacji

Pod wpływem st

ęż

onych kwasów nieorganicznych cukry ulegaj

ą

dehydratacji z utworzeniem pochodnych

furfuralowych, przy czym heksozy tworz

ą

5-hydroksymetylenofurfural, a pentozy – furfural. Powstałe

zwi

ą

zki kondensuj

ą

z fenolami, chinonami czy aminami aromatycznymi tworz

ą

c poł

ą

czenia

triarylometanowe o charakterystycznym zabarwieniu. Reakcje te s

ą

wykorzystywane do identyfikacji,

ró

ż

nicowania i oznacze

ń

ilo

ś

ciowych cukrów.

Dehydratacja

C

O

C

O

HC

HC

OH

OH

CH

OH

H (lub

CH

OH

HC

HC

C

C

O

H

H

+

- 3 H

2

O

H

H

pentoza (lub heksoza)

furfural (lub 5-hydroksymetylenofurfural)

CH

2

OH)

(lub

CH

2

OH)

1.1 Reakcja Molischa (kondensacja z fenolem)

Jest to najbardziej ogólna reakcja wykrywaj

ą

ca cukry i to zarówno te wolne jak i zwi

ą

zane. Jest jednak mało

specyficzna, gdy

ż

jej dodatni wynik mo

ż

e równie

ż

ś

wiadczy

ć

o obecno

ś

ci aldehydów i ketonów.

1

odczynniki

: 1% glukoza, 20%

α

-naftol w 95% etanolu (przechowywa

ć

w ciemno

ś

ci w temp.

pokojowej), st

ęż

. H

2

SO

4

sprz

ę

t

: 1 probówka szklana długa, pipeta szklana, pipety automatyczne, worteks

wykonanie

: do 1 ml roztworu glukozy doda

ć

0,5 ml

ś

wie

ż

o przygotowanego roztworu

α

-naftolu i

wymiesza

ć

. Nast

ę

pnie podwarstwi

ć

1 ml st

ęż

onego H

2

SO

4

, nie miesza

ć

(do pipetowania

st

ęż

onego H

2

SO

4

u

ż

ywa

ć

szklanej pipety Pasteur’a). Na granicy faz pojawia si

ę

fiołkowo-

malinowe zabarwienie.

O

OH

O

OH

2

+

C

O

H

H lub (

CH

2

OH)

C

lub (

CH

2

OH)

H

O

α −

naftol

fiolkowomalinowy

furfural lub
hydroksymetylenofurfural

1.2 Reakcja Taubera (kondensacja z benzydyn

ą

– amin

ą

aromatyczn

ą

)

odczynniki

: 0,5% arabinoza, 1% glukoza, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym

sprz

ę

t

: 2 probówki szklane długie, pipety automatyczne, worteks

wykonanie: do dwóch probówek odpipetowa

ć

po 0,5 ml roztworu benzydyny. Do jednej probówki

doda

ć

1 ml roztworu arabinozy, a do drugiej 1 ml roztworu glukozy, wymiesza

ć

i ogrzewa

ć

do

wrzenia. Pentozy w tych warunkach daj

ą

zabarwienie czerwone, a heksozy

ż

ółte lub brunatne.

O

O

O

+

C

O

H

H lub (

CH

2

OH)

CH

2

OH)

furfural lub
hydroksymetylenofurfural

NH

2

H

2

N

benzydyna

2

- 3 H

2

O

N

C

H

N

C

H

H

H

CH

2

OH)

lub (

lub (

czerwony (lub zóltobrunatny)

1.3 Reakcja Seliwanowa (kondensacja z rezorcyn

ą

– fenodiol)

Pozwala na odró

ż

nienie aldoz od ketoz. Wa

ż

ne jest zachowanie odpowiednich warunków reakcji, tzn.:

st

ęż

enie u

ż

ytego kwasu solnego powinno wynosi

ć

12% a czas ogrzewania - 30 sekund. W tych warunkach

ketozy przechodz

ą

w hydroksymetylenofurfural, natomiast aldozy pozostaj

ą

niezmienione. Je

ż

eli u

ż

yje si

ę

bardziej st

ęż

onego kwasu lub wydłu

ż

y czas ogrzewania, to wówczas aldozy równie

ż

ulegaj

ą

dehydratacji i

daj

ą

odczyn dodatni – pojawia si

ę

czerwono-wi

ś

niowe zabarwienie.

odczynniki

: 0,5% fruktoza, 1% glukoza, st

ęż

ony HCl, rezorcyna kryst

sprz

ę

t

: 3 probówki szklane długie, pipety automatyczne, ła

ź

nia wodna, szpatułka, stoper, worteks

wykonanie

: do pierwszej probówki odpipetow

ć

1 ml roztworu fruktozy, a do drugiej i trzeciej

probówki po 1 ml roztworu glukozy. Do wszystkich probówek doda

ć

po 0,5 ml st

ęż

onego HCl

(otrzymuje si

ę

roztwór o st

ęż

eniu 12%), ogrza

ć

do wrzenia w ła

ź

ni wodnej, a nast

ę

pnie probówki

pierwsz

ą

i drug

ą

utrzymywa

ć

we wrzeniu przez 30 sekund, natomiast probówk

ę

trzeci

ą

utrzymywa

ć

we wrzeniu przez 3 min. Mieszaniny ostudzi

ć

, doda

ć

kilka kryształków rezorcyny i

ogrza

ć

do wrzenia w ła

ź

ni wodnej. Porówna

ć

wyniki dla obu roztworów cukrów.

2

O

O

O

2

+

C

O

H

H lub (

CH

2

OH)

lub (

CH

2

OH)

H

O

rezorcyna

czerwonowisniowy

furfural lub
hydroksymetylenofurfural

OH

HO

HO

1.4 Odczyn Fehlinga

W odczynie Fehlinga redukcji ulegaj

ą

jony miedzi z Cu

2+

do Cu

+

. U

ż

ywa si

ę

odczynnika Fehlinga I, który

zawiera CuSO

4

oraz odczynnika Fehlinga II, który zawiera NaOH i winian sodowo-potasowy. Winian

sodowo-potasowy zapobiega wytr

ą

caniu si

ę

osadu Cu(OH)

2

, co mo

ż

e mie

ć

miejsce przy małym st

ęż

eniu

cukru. Sól ta wi

ąż

e jony Cu

2+

tworz

ą

c kompleksow

ą

sól kwasu winowego.

odczynniki: 1% glukoza, odczynnik Fehlinga I i II
sprz

ę

t

: 2 długie probówki, palnik, worteks, pipety automatyczne

wykonanie

: w jednej probówce zmiesza

ć

0,5 ml odczynnika Felinga I i 0,5 ml odczynnika Felinga

II. Do drugiej probówki nala

ć

1 ml roztworu glukozy. Zawarto

ść

obu probówek ogrzewa

ć

do

wrzenia. Oba roztwory zla

ć

razem. Wyst

ę

puje zabarwienie lub brunatnoczerwony osad

wydzielonego Cu

2

O.

CuSO

4

+ 2NaOH

→

Cu(OH)

2

+ Na

2

SO

4

HC

HC

COOK

OH

OH

HC

HC

O

O

Cu

2 H

2

O

COOK

COONa

COONa

+

HO

HO

Cu

+

HC

HC

O

O

Cu

COOK

COONa

+

C

CHOH

R

H

O

+ H

2

O

C

CHOH

R

OH

O

+

HC

HC

COOK

OH

OH

COONa

+

Cu

2

O

c z e rw o n y o
o s a d

1.5 Odczyn Nylandera

Odczynnik Nylandera zawiera zasadowy azotan bizmutu, KOH i winian sodowo-potasowy, który spełnia tu
t

ę

sam

ą

rol

ę

, co w odczynie Felinga i co cytrynian w odczynie Benedicta. Pod wpływem cukrów redukcji

ulega Bi

3+

do Bi

0

.

odczynniki

: 1% glukoza, odczynnik Nylandera

sprz

ę

t

: probówka szklana długa, ła

ź

nia wodna, worteks, pipety automatyczne

wykonanie

: do 5 ml 1% roztworu glukozy doda

ć

kilka kropel odczynnika Nylandera, wymiesza

ć

i

wstawi

ć

do wrz

ą

cej ła

ź

ni wodnej na 5 min. Wytr

ą

ca si

ę

czarny osad metalicznego bizmutu

Bi(OH)

2

NO

3

+ KOH

→

Bi(OH)

3

+ KNO

3

Bi(OH)

3

Bi

3+

+

3 OH

-

3

+ 2 Bi(OH)

3

winian
Na-K

+ 2 Bi

0

+ 3 H

2

O

OH

glukoza

kwas glukonowy

czarny osad

3 C

H

O

R

+

+

+

3 C

O

R

2. Oznaczanie ilo

ś

ciowe monocukrów

Metoda antronowa

Jest to kolorymetryczna metoda oznaczania zawarto

ś

ci cukru w roztworze wykorzystuj

ą

ca powstawanie

kompleksów pomi

ę

dzy furfuralowymi i hydroksymetylenofurfuralowymi pochodnymi cukrów a antronem.

Powstaj

ą

cy kompleks o barwie niebiesko-zielonej ma maksimum absorpcji przy długo

ś

ci fali 600 nm. Jest to

metoda niestechiometryczna wi

ę

c wymaga sporz

ą

dzenia krzywej kalibracyjnej.

O

O

2

+

C

O

H

H lub (

CH

2

OH)

C

lub (

CH

2

OH)

H

O

antron

zielononiebieski

furfural lub
hydroksymetylenofurfural

O

H

H

H

O

odczynniki

: 1% glukoza (roztwór wzorcowy), próbki badane (roztwory cukru o nieznanym

st

ęż

eniu), odczynnik antronowy

sprz

ę

t

: 20 probówek szklanych krótkich, szklana bagietka, pipety automatyczne, worteks, ła

ź

nia

wodna, czytnik do płytek titracyjnych, papier milimetrowy, stoper
wykonanie

:

a) w krótkich szklanych probówkach przygotowa

ć

zgodnie z tabel

ą

wzrastaj

ą

ce st

ęż

enia

roztworu wzorcowego do krzywej kalibracyjnej oraz dwa roztwory z próbek o
nieznanym st

ęż

eniu cukru; roztwory po przygotowaniu wymiesza

ć

.

Próbka

badana

Obj. roztworu

wzorcowego (

µ

l)

Obj. wody

(

µ

l)

St

ęż

enie cukru

(mg/ml)

A

600

∅

0

1000

1

5

995

2

10

990

3

20

980

4

30

970

5

40

960

6

50

950

7

60

940

Obj. próbki

badanej

(

µ

l)

Obj.

wody (

µ

l)

Rozcie

ń

czenie

próbki

A

600

St

ęż

enie

cukru (mg/ml)

P1

50

950

P2

50

950

4

b)

do 12-stu krótkich szklanych probówek odmierzy

ć

1,25 ml odczynnika antronowego i

przy ozi

ę

bianiu w zlewce z zimn

ą

wod

ą

ostro

ż

nie dodawa

ć

, mieszaj

ą

c bagietk

ą

szklan

ą

, 0,25 ml badanego roztworu. Cało

ść

umie

ś

ci

ć

we wrz

ą

cej ła

ź

ni wodnej lna 10

minut, po wyj

ę

ciu ozi

ę

bi

ć

pod bie

żą

c

ą

wod

ą

. Z ka

ż

dej probówki przenie

ść

po 100

µ

l

mieszaniny do dołków w płytce titracyjnej i zmierzy

ć

warto

ść

absorbancji przy

λ

= 600

nm wobec próby

ś

lepej przy u

ż

yciu czytnika do płytek titracyjnych. Wyniki st

ęż

enia

cukru dla badanych próbek odczyta

ć

w mg/ml z wykre

ś

lonej krzywej kalibracyjnej.

Odczynniki:

0,5% arabinoza, 0,5% fruktoza, 1% glukoza, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym, 20%



-naftol w

95% etanolu, st

ęż

ony H

2

SO

4

, st

ęż

ony HCl, rezorcyna kryst., odczynnik Fehlinga I i II, odczynnik Nylandera,

odczynnik antronowy – 40 mg antronu w 25 ml st

ęż

onego H

2

SO

4

.

5