Test kometowy

SCGE
Służy m.in. ocenie cyto i genotoksyczności związków chemicznych.
Umożliwia wizualizację uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach.
Niewielka liczba komórek zawieszana w warstwie agarowy na szkiełku mikroskopowym poddawana
lizie (detergenty) i elektroforezie.
Celem uwidocznienia zmian jakim uległy komórki pod wpływem czynnika chemicznego/ fizycznego,
preparaty wybarwiane są barwnikami fluorescencyjnymi wiążącymi się z DNA.
Pęknięte nici DNA migrują jako ogon komety.
Ilość uwolnionego z jąder materiału genetycznego proporcjonalna do intensywności i czasu działania
dawki promieniowania/ czynnika chemicznego jakim traktowane były komórki.
Obraz przypomina kometę.
DNA pozostające w obrębie otoczki jądrowej formuje „głowę”.
„Ogon” złożony jest z wolnych fragmentów DNA (wędrują szybciej i dalej od tych, zakotwiczonych
w macierzy jądrowej), a intensywność fluorescencji i długość ogona odzwierciedlają liczbę pęknięć
DNA.
Wyższe stężenia związków toksycznych nie powoduje zmian w długości ogona, różnice dotyczą
poziomu fluorescencji.

Etapy i ocena wyników testu kometowego:
Podstawowy model techniki obejmuje następujące etapy:
1) Izolacja pojedynczych komórek z materiału badawczego
2) Pokrycie szkiełek agarową (jedna, dwie lub trzy warstwy, o różnych stężeniach i temp topnienia),
odmienne obrazy komet
3) Liza komórek (Tryton- X100, SDS)
4) Elektroforeza szkiełkowa
5) Barwienie preparatów i wizualizacja w mikroskopie fluorescencyjnym (barwniki- DAPI- wiąże się
selektywnie z parami AT, bromek etydyny- interkaluje między zasady azotowe, jodek propidyny,
oranż akrydyny).

Błękit bromofenolowy- ok. 500pz
Zieleń ksylenowa- ok. 1000pz
Nie wiążą się z kw nuk, migrują niezależnie, bo mają swój własny ładunek.

Oceniane parametry komet:

•

Długość ogona

•

Długość komety

•

Intensywność fluorescencji ogona

•

Tzw moment ogonowy (iloczyn długości ogona i intensywności fluorescencji)

Zalety metody:

•

Czułość wykrywania uszkodzeń DNA

•

Niewielka ilość materiału niezbędna do przeprowadzenia testu

•

Krótki okres uzyskania wyników

•

Relatywnie niskie koszty eksperymentów

•

Do oceny uszkodzeń komórek niezbędne są komputerowe programy analizy obrazu