IMMUNOLOGIA – PRELEKCJA 6

[e-mail]

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników

Służą one oznaczaniu substancji o charakterze białkowym w płynach ustrojowych.

Poszukiwany związek może być zarówno przeciwciałem jak i antygenem. Ogólna zasada wszystkich
metod polega na tym, że jeden ze składników kompleksu Ag-Ab wyznakowany jest znacznikiem
(markerem). Rodzaj tego znacznika dzieli metody na:



Immunoenzymatyczne (EIA) – znacznikiem jest enzym



Fluorymetryczne – znacznikiem jest fluorochrom – barwnik fluoryzujący w świetle o krótkiej

fali (zielony, żółty, czerwony)



Radioimmunometryczne (RIA) – znacznikiem jest pierwiastek promieniotwórczy



Chemiluminescenscyjne – znacznikami są określone substancje organiczne

Dodatkowo możemy wyróżnić metody

I generacji: aglutynacja, precypitacja, odczyn wiązania dopełniacza
II generacji: ELISA
III generacji: reakcja wykrywana jest nie metodą enzymatyczną, której czułość jest
ograniczona, lecz przy pomocy znaczników fluorescencyjnych i luminescencyjnych
(np. DELFIA – dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, używamy

pierwiastków z rodziny lantanowców (Europ, Samar, Dyspros, Terb)

EIA

– metody immunoenzymatyczne

Zasada metod immunoenzymatycznych:

ETAP 1) Reakcja antygen-przeciwciao
ETAP 2) Reakcja enzymatyczna wykrywająca kompleksy powstałe w etapie I

Etap pierwszy może przebiegać w roztworze (metody homogenne, np. EMIT), lub jeden ze

składników ulega wcześniejszemu związaniu z fazą stałą, np. powierzchnią polistyrenową płytki
serologicznej (metody heterogenne – ELISA)

Produkt reakcji katalizowanej przez enzym jest barwny, oznaczamy go metodami

spektrofotometrycznymi. Metody te charakteryzują się wysoką czułością oraz brakiem konieczności
stosowania pierwiastków promieniotwórczych co daje im przewagę nad metodami RIA.

Stosowane enzymy muszą spełniać takie warunki jak:



Rozpuszczalność



Stabilność



Łatwe i trwałe wiązanie się z białkiem



Nieobecność (lub występowanie w śladowych ilościach) w płynach ustrojowych



Łatwo dostępne substraty



Barwne produkty reakcji

Enzymy i substraty w metodach ELISA

Enzym

Źródło

Substrat

Peroksydaza

Chrzan

OPD – o-fenylodiamina
TMB – tetrametylobenzydyna
5-AS – kwas 5-aminosalicylowy

Fosfataza Alkaliczna

E.Coli

p-nitrofenylofosforan

D-galaktozydaza

E.coli

Nitrofenylo-D-galaktozyd

METODY BEZPOŚREDNIE ELISA

- nie używamy surowicy antyglobulinowej

WYKRYWANIE ANTYGENU

1) TECHNIKA SANDWICH

przeciwciała przeciwko poszukiwanemu antygenowi ulegają zaadsorbowaniu na powierzchni polistyrenowej
płytki serologicznej. Po dodaniu próbki zawierającej antygeny powstaje kompleks. Wykrywa się go za pomocą
przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi, które sprzężone jest z enzymem

przeciwciało znakowane enzymem

szukany antygen

przeciwciało opłaszczone na płytce

2) TECHNIKA KOMPETYCYJNA

reakcja zachodzi w 2 etapach:

1) reakcja przeciwciała zaadsorbowanego na polistyrenie a poszukiwanym antygenem
2) Do pozostałych, wolnych przeciwciał przyłącza się dodany antygen kontrolny, znakowany enzymem.

Im więcej poszukiwanego antygenu jest w badanej próbce, tym mniej antygenu kontrolnego przyłącza się w
drugim etapie

ETAP 1

ETAP 2

antygen kontrolny + enzym

E

antygen szukany

E

WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁA

1) TECHNIKA KOMPETYCYJNA

Do probówki z opłaszczonym antygenem dodajemy badaną surowicę (z szukanymi przeciwciałami). Następnie
dodajemy znakowane przeciwciała. Następuje zjawisko współzawodnictwa o miejsca wiązania przeciwciała
szukanego i znakowanego enzymem.
Im więcej poszukiwanego przeciwciała jest w badanej próbce, tym mniej przeciwciała kontrolnego przyłącza się
do opłaszczonego antygenu i tym mniejsza reakcja barwna

ETAP 1

ETAP 2

przeciwciało kontrolne + enzym

Przeciwciało szukane

antygen opłaszczony

2) TECHNIKA ZNAKOWANEGO ANTYGENU

Antygen wiążemy z płytką polistyrenową, następnie dodajemy surowicę z poszukiwanymi przeciwciałami.
Tworzy się kompleks immunologiczny, który wykrywamy przez antygen kontrolny sprzężony z enzymem

E

Antygen kontrolny + enzym

E

Szukane przeciwciało

Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) –

metoda heterogenna EIA

Zastosowanie testu:



Wykrywanie obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w chorobach
zakaźnych i pasożytniczych



Ocena ilościowego stężenia hormonów



Wykrywanie obecności autoantygenów

METODY POŚREDNIE ELISA

- używamy surowicy antyglobulinowej

WYKRYWANIE ANTYGENU

1) TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA

w odróżnieniu od metod omówionych powyżej, enzym jest sprzężony z tzw. II przeciwciałem, którym jest
surowica antyglobulinowa uzyskana w wyniku immunizacji zwierzęcia. Surowica antyglobulinowa wykrywa
wszystkie przeciwciała, bez względu na to przeciwko jakiemu antygenowi są skierowane

Surowica antyglobulinowa + enzym

Przeciwciało wolne

Szukany antygen

Przeciwciało zaadsorbowane na polistyrenie

WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁ

1) TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA

Antygen zaadsorbowany jest na polistyrenie, przeciwciała których szukamy wiążą się z nim. Powstały kompleks
jest wykrywany przez surowicę antyglobulinową

FIA -

Metody fluorymetryczne

Metoda fluorymetryczna opiera się na pomiarze natężenia emitowanego
promieniowania fluorescencyjnego powstałego po wzbudzeniu próbki. Intensywność
fluorescencji danej substancji jest proporcjonalna do jej stężenia, w pewnym przedziale
stężeń.

Emisję wzbudza wiązka światła o małej długości fali, aby ją uzyskać stosujemy:



Filtry przepuszczające promieniowanie indukujące fluorescencję



Filtry usuwające promieniowanie niepożądane

Metody oznaczania są analogiczne do EIA, różnicą jest znacznik

METODY BEZPOŚREDNIE FIA

-bez użycia surowicy antyglobulinowej

Oznaczanie Antygenu

1) Metoda Sandwich
2) Metoda Kompetycyjna

Oznaczanie Przeciwciała

1) Metoda Kompetycyjna
2) Metoda znakowanego antygenu

METODY BEZPOŚREDNIE FIA

-z użyciem surowicy antyglobulinowej

Zalety metod pośrednich to:



Większa czułość i swoistość w porównaniu do metod pośrednich



Uniknięcie możliwości zmian swoistości przeciwciała podczas znakowania

Oznaczanie Antygenu
Oznaczanie Przeciwciała

RIA

-

Metoda radioimmunologiczna

RIA = Metoda bezpośrednia homogenna
Szukamy: antygenu
Znakujemy: antygen

Polega na wykrywaniu reakcji antygen-przeciwciało poprzez pomiar promieniowania

izotopów promieniotwórczych związanych z jednym ze składników kompleksu. Najczęściej
stosowane znaczniki to izotop

125

J (wykrywany licznikiem gamma) i tryt

3

H (wykrywany ciekłym

licznikiem scyntylacyjnym).

WYKRYWANIE ANTYGENU

Etap pierwszy

– przygotowanie kontrolnej probówki, względem której określimy radioaktywność

badanej surowicy

1) Dodajemy do probówki znakowany izotopowo antygen, a następnie dodajemy w niedoborze

przeciwciało

2) Odpłukujemy powstałe kompleksy a następnie badamy radioaktywność pozostałych, nie

związanych antygenów

Antygen znakowany izotopem (określona ilość, ale w nadmiarze w stosunku do przeciwciała)

Badamy radioaktywność

odpłukujemy

Przeciwciało
(również określona ilość, ale w niedoborze)

Etap drugi

1) Do drugiej probówki dodajemy najpierw przeciwciała (tyle samo co w etapie pierwszym)
2) Do tej samej probówki dodajemy badaną surowicę
3) Dodajemy radioaktywne antygeny (tyle samo co w etapie pierwszym)
4) Odpłukujemy kompleksy i badamy radioaktywność
* im większa radioaktywność tym więcej wolnych, znakowanych antygenów, co z kolei oznacza
że powstało dużo kompleksów przeciwciało-szukany antygen

Zastosowanie metod RIA



Ilościowe oznaczanie antygenów lub przeciwciał



Oznaczanie stężenia hormonów w płynach ustrojowych



Wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom (np. antygenu rakowo-
płodowego i alfa-fetoproteiny)



Oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE w alergiach



Oznaczanie stężenia witamin i leków



Wykrywanie obecności autoprzeciwciał w schorzeniach autoimmunologicznych

W oparciu o techniki immunoradiometryczne opracowano dwa testy do oznaczania poziomu IgE o
danej swoistości w surowicy , oraz poziomu IgE w alergologii:



RAST (RadioAlergoSorbent Test) – oznaczanie konkretnych IgE



RIST (RadioImmunoSorbent Test) – ogólne stężenie IgE

IRMA –

metoda immunoradiometryczna

Znakujemy przeciwciało, szukamy antygenu
IRMA = metoda bezpośrednia, heterogenna

Jeden ze składników reakcji związany jest z fazą stałą. Może to być plastikowa próbówka

bądź mikropłytka którą opłaszczamy nie znakowanymi przeciwciałami, po czym dodajemy badanego
materiału (poszukujemy antygenu), a po inkubacji – znakowanego przeciwciała, uzyskanego przez
immunizację innego gatunku ludzkim poszukiwanym antygenem i inkubujemy ponownie. Nadmiar
nie związanych przeciwciał odpłukujemy, po czym mierzymy radioaktywność na płytce bądź w
próbówce.

Etap I

Etap II

Etap III

Etap IV

– dodanie surowicy badanej - płukanie

- dodanie Ab znakowane

- płukanie

- mierzenie radioaktywności

Metody chemiluminescencyjne

Są oparte na pomiarze emisji fotonów w przebiegu reakcji chemicznej. Jeden z

reagentów oznakowany jest substancją organiczną – lucyferyną lub estrem akrydyny. W
przebiegu znacznikowej reakcji chemicznej zachodzi emisja promieniowania w zakresie
światła widzialnego, które mierzymy za pomocą luminometru. Emisja fotonów trwająca kilka
sekund przetwarzana jest na liczbę impulsów na minutę. Technika ta stosowana jest do
ilościowego pomiaru tak antygenu jak i przeciwciała.

Metody immunomorfologiczne

Dzielą się one na:



Metody immunofluorescencyjne – znacznikiem są flurorchromy



Metody immunoenzymatyczne – znacznikiem są enzymy



Z użyciem metali szlachetnych jako znacznika – wykorzystujemy np. roztwór
koloidalny złota otrzymywany z kwasu chlorozłotawego za pomocą reduktorów
(aldehyd mrówkowy, kwasy organiczne)

Materiał do badań stanowią:



Wycinki tkanek (bioptaty)



Zawiesina żywych komórek (krew)



Zawiesina żywych bakterii

Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (Metody immunofluorescencyjne) lub
świetlnym (Metody immunoenzymatyczne)

METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA BEZPOŚREDNIA

np. Wykrywanie antygenu chlamydia trachomatis w wymazach z kanału szyjki macicy.

1)

Dwubarwna reakcja immunofluorescencji

Wykorzystujemy dwa fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, co pozwala nam na ocenę w preparacie dwóch
różnych antygenów. Reakcja przebiega w kilku etapach:



Badany materiał inkubujemy ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla pierwszego antygenu (np. p/ciała
przeciw białku SpoIIAB znakowane FITC, dającym kolor zielony)



Następnie inkubujemy próbkę ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla drugiego antygenu (np. anty DNA
znakowane RITC, dającym kolor czerwony)

Wynikiem reakcji jest dwukolorowy preparat oceniany w mikroskopie fluorescencyjnym.
Zastosowanie – np. wykrywanie komórek Baccillus subtilis przekształcających się w przetrwalnik

i.

METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA POŚREDNIA

Charakteryzują się większą czułością.

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym
antygenem.

Wynik pozytywny: fluorescencja

obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym

Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji

Technologia BIOCHIP

Wycinki tkanek, hodowle komórek lub rozmazy bakterii są umieszczane na

cieniutkich płytkach szklanych, które są dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty
(BIOCHIPy), które są przyklejane automatycznie do szkiełek mikroskopowych. Technologię
tą można wykorzystać do wykrywania w jednej próbce przeciwciał przeciwko kilku
antygenom.
Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce infekcji układu oddechowego:


bakteryjnych:



Botredella pertussis i parapertussis



Haemophilus influenzae



Leginonella pneumoniae



Klebsiella pneumoniae



Chlamydia trachomatis



Chlamydophila pneumoniae

wirusowych:



Herpes simplex virus 1



Wirusy oddechowe



Adenovirus



Influenza A i B virus



Parainfluenza virus 1-4



Coxsackie (A7, A9, A16, A24, B1 do

B6)

1) Metody immunomorfologiczne EIA (immunohistochemiczne)

Analogicznie do w/w testów immunoenzymatycznych, w metodach tych do

znakowania przeciwciał stosuje się enzymy katalizujące reakcje dające barwne produkty.
Detekcji kompleksów dokonuje się za pomocą metod immunohistochemicznych. Są to
metody jakościowe. Stosowane enzymy muszą spełniać takie same kryteria jak w przypadku
testów immunoenzymatycznych, stąd też w metodach tych najczęściej stosuje się wyżej
wymienione enzymy (peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, oksydazę glukozową),
natomiast stosowane chromogeny to:



Tetrachlorowodorek 3,3-dwuaminobenzydyny (DAB) – daje ciemnobrązowy produkt

nierozpuszczalny w wodzie.



3-amino-9-etylokarbazol (AEC) – daje czerwony produkt nierozpuszczalny w wodzie,

rozpuszczalny w alkoholu.

Reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP)

Składa się z dwóch etapów:



W pierwszym etapie wykrywamy antygen swoistym

przeciwciałem



W drugim etapie dodajemy p/ciał znakowanych
enzymem peroksydaza-antyperoksydaza związanych za
pomocą mostka – wiążą się one z kompleksem Ab-Ag
poprzez warstwę pośrednią nieznakowanych p/ciał
reagujących z przeciwciałem pierwotnym oraz
kompleksem enzym-antyenzym



W trzecim etapie dodajemy H

2

O

2

i związek

chromogenny



W czwartym etapie odczytujemy wynik reakcji –

obecność poszukiwanego antygenu oceniamy na
podstawie wyniku badanej reakcji – obecności lub braku
brązowego (lub innego koloru) barwnika (zależy od
chromogenu).

Zastosowanie metody to wykrywanie markerów nowotworowych w tkankach:

Typ nowotworu

Marker wykrywany immunoenzymatycznie

Mięsak gładkokomórkowy okrężnicy

Przeciwciała przeciwaktynowe

Łagodny przerost gruczołu krokowego

Receptory androgenowe

Rak przewodów żółciowych

Receptory Bcl-X

Chłoniak pochodzący z limf. T

CD3

Chłoniak Hodgkin’a

CD15

Rakowiak (nowotwór okresu płodowego)

Chromogranina A

Chłoniak

CPP32

Złośliwy międzybłoniak pochodzący z
nowotworu błony surowiczej

Cytokeratyna 5/6

Rak piersi

Receptor estrogenowy

Czerniak złośliwy

Kompleksy melaniny A

Reakcja fosfataza alkaliczna – antyfosfataza alkaliczna (APAAP)

Zasada metody jest podobna do reakcji PAP, różni się
jedynie wykorzystywanym kompleksem.
Zastosowanie metody jest bardzo podobne, służy ona
do wykrywania obecności antygenów w tkankach.
Barwne, czerwone produkty reakcji są dobrze
widoczne w mikroskopie świetlnym.


Zastosowanie metody:

Reakcje z układem biotyna-awidyna

W metodzie tej wykorzystuje się wysokie

powinowactwo biotyny (nisko cząsteczkowej wit.
H) do zasadowej glikoproteiny białka jaja kurzego
– awidyny. Czasem zamiast awidyny wykorzystuje
się streptawidynę, izolowaną z bakterii
Streptomyces avidini.

Typ nowotworu

Marker wykrywany
immunoenzymatycznie

Anaplasyczny chłoniak
olbrzymiokomórkowy

CD30

Łuskowaty rak skóry

Nabłonkowy cz. wzrostu
EGFR

Chłoniak obwodowy
wyw. z limfocytów T

Granzym B

Cytometria przepływowa

Jest to nowoczesna metoda badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek układu

krwiotwórczego. Pozwala ona na jednoczesne określenie:



Komórek krwi na podstawie ich wielkości i granularności (populacje erytrocytów, granulocytów,
limfocytów, monocytów i trombocytów)



Różnych rodzajów antygenów różnicowania (CD) i innych poprzez użycie przeciwciał monoklonalnych
znakowanych różnymi fluorochromami.

Warunkiem wykonania analizy cytometrycznej jest doprowadzenie posiadanego materiału do zawiesiny
pojedynczych komórek. Przy pobieraniu krwi do badań cytometrycznych stosujemy odpowiedni antykoagulant:



EDTA i heparyna – dla pełnej krwi



Hirudyna – dla szpiku kostnego

Po dokonaniu analizy można komórki sortować na poszczególne frakcje stosując odpowiednie urządzenie
pomiarowe, tzw. sorter komórek.

Zasada metody polega na tym, że komórki kierowane są do kanału w strumieniu cieczy pojedynczo, po

czym wiązka niebieskiego bądź ultrafioletowego światła oświetla przepływające komórki, ulegając ugięciu i
rozproszeniu, a jeśli komórki zostały wyznakowane znacznikiem fluorescencyjnym, także wzbudzając
fluorescencję. Źródłem światła są lasery lub rtęciowe lampy wysokociśnieniowe. Światło ugięte i rozproszone, a
także fluorescencyjne zbierane jest przez odpowiednio dopasowany układ optyczny, przesyłający je poprzez
filtry zaporowe do detektorów. Następnie dołączony system automatyki, sterowania oraz komputer zbiera i
przetwarza uzyskane dane, co pozwala na ocenę parametrów co najmniej 100 komórek na sekundę. Liczba
mierzonych parametrów zależy od rodzaju przyrządu.

Wykorzystywane w tej metodzie barwniki to fikobiliproteiny:



Fikoerytryna B, fikoerytryna R (światło czerwone)



Fikocyjanina C, fikocyjanina R (światło fioletowe)



Allofikocyjanina (światło zielone)

Do oznaczania DNA w komórce stosowany jest jodek propidyny.

Techniką cytometrii przepływowej możemy:



Określić liczebność populacji komórek w badanym materiale



Określić cechy morfologiczne (fenotyp) badanych komórek



Ocenić stan czynnościowy komórek



Oznaczyć stopień ekspresji antygenu na powierzchni komórek



Oznaczać ilościowo niektóre białka (cytokiny)

Wyznaczanie powyższych parametrów jest przydatne w diagnostyce klinicznej – umożliwia monitorowanie stanu
immunologicznego w trakcie choroby i leczenia.



Określić fenotyp komórek blastycznych w białaczkach ostrych



Diagnozować:

- chłoniaki
- białaczki przewlekłe
- zespoły mielodysplastyczne (MDS)



Oceniać DNA w komórkach białaczkowych



Poszukiwać choroby resztkowej (MRD)



Oceniać molekułę lekooporności (MDR)



Monitorować pacjentów po przeszczepach allogenicznych i szpiku



Badać komórki krwiotwórcze, retikulocyty i erytrocyty



Oceniać morfologicznie i czynnościowo płytki krwi



Diagnozować AIDS przez ocenę limfocytów CD4



Wykrywać erytrocyty płodu we krwi matki



Oznaczać ilościowo cytokiny

Najczęściej stosowane markery to:



CD45 leukocytów



CD3 limfocytów



CD19 i CD20 limfocytów B



CD15 neutrofili



CD16 i CD56 komórek NK