IMMUNOLOGIA – PRELEKCJA 6 

Nixon.SUM@gmail.com 

 
 

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników 

Służą one oznaczaniu substancji o charakterze białkowym w płynach ustrojowych. 

Poszukiwany związek może być zarówno przeciwciałem jak i antygenem. Ogólna zasada wszystkich 
metod polega na tym, że jeden ze składników kompleksu Ag-Ab wyznakowany jest znacznikiem 
(markerem). Rodzaj tego znacznika dzieli metody na: 



  Immunoenzymatyczne (EIA) – znacznikiem jest enzym 



  Fluorymetryczne – znacznikiem jest fluorochrom – barwnik fluoryzujący w świetle o krótkiej 

fali (zielony, żółty, czerwony) 



  Radioimmunometryczne (RIA) – znacznikiem jest pierwiastek promieniotwórczy 



  Chemiluminescenscyjne – znacznikami są określone substancje organiczne 

 
 
Dodatkowo możemy wyróżnić metody 

I generacji: aglutynacja, precypitacja, odczyn wiązania dopełniacza 
II generacji: ELISA 
III generacji: reakcja wykrywana jest nie metodą enzymatyczną, której czułość  jest 
ograniczona, lecz przy pomocy znaczników fluorescencyjnych i luminescencyjnych  
    (np. DELFIA – dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, używamy  

                   pierwiastków z rodziny lantanowców (Europ, Samar, Dyspros, Terb) 
 

EIA

 – metody immunoenzymatyczne 

Zasada metod immunoenzymatycznych: 

ETAP 1) Reakcja antygen-przeciwciao 
ETAP 2) Reakcja enzymatyczna wykrywająca kompleksy powstałe w etapie I 

 

 
Etap pierwszy może przebiegać w roztworze (metody homogenne, np. EMIT), lub jeden ze 

składników ulega wcześniejszemu związaniu z fazą stałą, np. powierzchnią polistyrenową płytki 
serologicznej (metody heterogenne – ELISA) 

Produkt reakcji katalizowanej przez enzym jest barwny, oznaczamy go metodami 

spektrofotometrycznymi. Metody te charakteryzują się wysoką czułością oraz brakiem konieczności 
stosowania pierwiastków promieniotwórczych co daje im przewagę nad metodami RIA. 
 
Stosowane enzymy muszą spełniać takie warunki jak: 



 

Rozpuszczalność 



 

Stabilność 



 

Łatwe i trwałe wiązanie się z białkiem 



 

Nieobecność (lub występowanie w śladowych ilościach) w płynach ustrojowych 



 

Łatwo dostępne substraty 



 

Barwne produkty reakcji

 

 
 
Enzymy i substraty w metodach ELISA 

Enzym 

Źródło 

Substrat 

Peroksydaza 

Chrzan 

OPD – o-fenylodiamina 
TMB – tetrametylobenzydyna 
5-AS – kwas 5-aminosalicylowy 

Fosfataza Alkaliczna 

E.Coli 

p-nitrofenylofosforan 

D-galaktozydaza 

E.coli 

Nitrofenylo-D-galaktozyd 

 

METODY BEZPOŚREDNIE ELISA 

- nie używamy surowicy antyglobulinowej 

 

WYKRYWANIE ANTYGENU 

 

1)  TECHNIKA SANDWICH 

przeciwciała przeciwko poszukiwanemu antygenowi ulegają zaadsorbowaniu na powierzchni polistyrenowej 
płytki serologicznej. Po dodaniu próbki zawierającej antygeny powstaje kompleks. Wykrywa się go za pomocą 
przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi, które sprzężone jest z enzymem 

 
 

 

przeciwciało znakowane enzymem

 

 
 
 

 

szukany antygen

 

 
 
 
 

przeciwciało opłaszczone na płytce 

 

 

2)  TECHNIKA KOMPETYCYJNA 

 
reakcja zachodzi w 2 etapach: 

1)  reakcja przeciwciała zaadsorbowanego na polistyrenie a poszukiwanym antygenem 
2)  Do pozostałych, wolnych przeciwciał przyłącza się dodany antygen kontrolny, znakowany enzymem.  

Im więcej poszukiwanego antygenu jest w badanej próbce, tym mniej antygenu kontrolnego przyłącza się w 
drugim etapie 
 
ETAP 1  

 

 

 

 

ETAP 2

  

antygen kontrolny + enzym 

 
 

E 

 
 

 

             

antygen szukany

 

 
 

E 

 
 
 
 

WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁA 

 

1)  TECHNIKA KOMPETYCYJNA 

 
Do probówki z opłaszczonym antygenem dodajemy badaną surowicę (z szukanymi przeciwciałami). Następnie 
dodajemy znakowane przeciwciała. Następuje zjawisko współzawodnictwa o miejsca wiązania przeciwciała 
szukanego i znakowanego enzymem. 
Im więcej poszukiwanego przeciwciała jest w badanej próbce, tym mniej przeciwciała kontrolnego przyłącza się 
do opłaszczonego antygenu i tym mniejsza reakcja barwna 

 

ETAP 1  

 

 

 

 

ETAP 2

  

przeciwciało kontrolne + enzym 

 

 

         Przeciwciało szukane

 

 
 

 

 
 

  antygen opłaszczony

 

 
 
 

2)  TECHNIKA ZNAKOWANEGO ANTYGENU 

Antygen wiążemy z płytką polistyrenową, następnie dodajemy surowicę z poszukiwanymi przeciwciałami. 
Tworzy się kompleks immunologiczny, który wykrywamy przez antygen kontrolny sprzężony z enzymem 

 
 

  E 

 
 

Antygen kontrolny + enzym

 

 
 

           E 

 
 
 

Szukane przeciwciało 

 

 

Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) – 

metoda heterogenna EIA  

 

Zastosowanie testu: 



 

Wykrywanie obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w chorobach 
zakaźnych i pasożytniczych 



 

Ocena ilościowego stężenia hormonów 



 

Wykrywanie obecności autoantygenów 

 
 

METODY POŚREDNIE ELISA 

- używamy surowicy antyglobulinowej 

 

WYKRYWANIE ANTYGENU 
 

1)  TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA 

w odróżnieniu od metod omówionych powyżej, enzym jest sprzężony z tzw. II przeciwciałem, którym jest 
surowica antyglobulinowa uzyskana w wyniku immunizacji zwierzęcia. Surowica antyglobulinowa wykrywa 
wszystkie przeciwciała, bez względu na to przeciwko jakiemu antygenowi są skierowane 

 

 
 
 

                                       

Surowica antyglobulinowa + enzym 

 
 
 
 
 

Przeciwciało wolne 

 

 

 

Szukany antygen 

 

 

 

Przeciwciało zaadsorbowane na polistyrenie 

 
 

WYKRYWANIE PRZECIWCIAŁ 

 

1)  TECHNIKA IMMUNOLOGICZNA POŚREDNIA

 

Antygen zaadsorbowany jest na polistyrenie, przeciwciała których szukamy wiążą się z nim. Powstały kompleks 
jest wykrywany przez surowicę antyglobulinową 

 
 
 
 
 
 
 

FIA - 

Metody fluorymetryczne 

 

Metoda fluorymetryczna opiera się na pomiarze natężenia emitowanego 
promieniowania fluorescencyjnego powstałego po wzbudzeniu próbki. Intensywność 
fluorescencji danej substancji jest proporcjonalna do jej stężenia, w pewnym przedziale 
stężeń.

 

 

 
Emisję wzbudza wiązka światła o małej długości fali, aby ją uzyskać stosujemy: 



 

Filtry przepuszczające promieniowanie indukujące fluorescencję 



 

Filtry usuwające promieniowanie niepożądane 

 
Metody oznaczania są analogiczne do EIA, różnicą jest znacznik   
 

METODY BEZPOŚREDNIE FIA 

-bez użycia surowicy antyglobulinowej 

 

Oznaczanie Antygenu 

1)  Metoda Sandwich 
2)  Metoda Kompetycyjna 

 

Oznaczanie Przeciwciała 

1)  Metoda Kompetycyjna 
2)  Metoda znakowanego antygenu 

 

METODY BEZPOŚREDNIE FIA 

-z użyciem surowicy antyglobulinowej 

 
Zalety metod pośrednich to: 



 

Większa czułość i swoistość w porównaniu do metod pośrednich 



 

Uniknięcie możliwości zmian swoistości przeciwciała podczas znakowania 

 

Oznaczanie Antygenu 
Oznaczanie Przeciwciała 

 

RIA

 - 

Metoda radioimmunologiczna

 

RIA = Metoda bezpośrednia homogenna 
Szukamy: antygenu 
Znakujemy: antygen 

 
Polega na wykrywaniu reakcji antygen-przeciwciało poprzez pomiar promieniowania 

izotopów promieniotwórczych związanych z jednym ze składników kompleksu. Najczęściej 
stosowane znaczniki to izotop 

125

J (wykrywany licznikiem gamma) i tryt 

3

H (wykrywany ciekłym 

licznikiem scyntylacyjnym). 

 

WYKRYWANIE ANTYGENU 

 

Etap pierwszy 

– przygotowanie kontrolnej probówki, względem której określimy radioaktywność 

badanej surowicy 

1)  Dodajemy do probówki znakowany izotopowo antygen, a następnie dodajemy w niedoborze 

przeciwciało 

2)  Odpłukujemy powstałe kompleksy a następnie badamy radioaktywność pozostałych, nie 

związanych antygenów 

 

Antygen znakowany izotopem (określona ilość, ale w nadmiarze w stosunku do przeciwciała) 

 
 
 
 

Badamy radioaktywność 

 
 
 

      odpłukujemy 

 

Przeciwciało  
(również określona ilość, ale w niedoborze) 

 
 

Etap drugi  

1)  Do drugiej probówki dodajemy najpierw przeciwciała (tyle samo co w etapie pierwszym) 
2)  Do tej samej probówki dodajemy badaną surowicę 
3)  Dodajemy radioaktywne antygeny (tyle samo co w etapie pierwszym) 
4)  Odpłukujemy kompleksy i badamy radioaktywność  
* im większa radioaktywność tym więcej wolnych, znakowanych antygenów, co z kolei oznacza 
że powstało dużo kompleksów przeciwciało-szukany antygen 
 
 

 
 
 
 
 

 
 
Zastosowanie metod RIA 



 

Ilościowe oznaczanie antygenów lub przeciwciał 



 

Oznaczanie stężenia hormonów w płynach ustrojowych 



 

Wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom (np. antygenu rakowo-
płodowego i alfa-fetoproteiny) 



 

Oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE w alergiach 



 

Oznaczanie stężenia witamin i leków 



 

Wykrywanie obecności autoprzeciwciał  w schorzeniach autoimmunologicznych 

 
W oparciu o techniki immunoradiometryczne opracowano dwa testy do oznaczania poziomu IgE o 
danej swoistości w surowicy , oraz poziomu IgE w alergologii: 



  RAST (RadioAlergoSorbent Test) – oznaczanie konkretnych IgE 



  RIST (RadioImmunoSorbent Test) – ogólne  stężenie IgE 

 
 
 
 
 
 
 

IRMA – 

metoda immunoradiometryczna

 

Znakujemy przeciwciało, szukamy antygenu 
IRMA = metoda bezpośrednia, heterogenna  
 

Jeden ze składników reakcji związany jest z fazą stałą. Może to być plastikowa próbówka 

bądź mikropłytka którą opłaszczamy nie znakowanymi przeciwciałami, po czym dodajemy badanego 
materiału (poszukujemy antygenu), a po inkubacji – znakowanego przeciwciała, uzyskanego przez 
immunizację innego gatunku ludzkim poszukiwanym antygenem i inkubujemy ponownie. Nadmiar 
nie związanych przeciwciał odpłukujemy, po czym mierzymy radioaktywność na płytce bądź w 
próbówce. 

 

Etap I  

 Etap II  

               Etap III   

 

     Etap IV 

– dodanie surowicy badanej               - płukanie   

 - dodanie Ab znakowane 

       - płukanie 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        - mierzenie radioaktywności 

 
 
 
 
 
 

 
 

 

Metody chemiluminescencyjne 

 

Są oparte na pomiarze emisji fotonów w przebiegu reakcji chemicznej. Jeden z 

reagentów oznakowany jest substancją organiczną – lucyferyną lub estrem akrydyny. W 
przebiegu znacznikowej reakcji chemicznej zachodzi emisja promieniowania w zakresie 
światła widzialnego, które mierzymy za pomocą luminometru. Emisja fotonów trwająca kilka 
sekund przetwarzana jest na liczbę impulsów na minutę. Technika ta stosowana jest do 
ilościowego pomiaru tak antygenu jak i przeciwciała. 
 

Metody immunomorfologiczne  

Dzielą się one na: 



  Metody immunofluorescencyjne – znacznikiem są flurorchromy 



  Metody immunoenzymatyczne – znacznikiem są enzymy 



 

Z użyciem metali szlachetnych jako znacznika – wykorzystujemy np. roztwór 
koloidalny złota otrzymywany z kwasu chlorozłotawego za pomocą reduktorów 
(aldehyd mrówkowy, kwasy organiczne) 

 
Materiał do badań stanowią: 



  Wycinki tkanek (bioptaty) 



 

Zawiesina żywych komórek (krew) 



 

Zawiesina żywych bakterii 

 
Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (Metody immunofluorescencyjne) lub 
świetlnym (Metody immunoenzymatyczne) 
 
 
 
 

 

METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA BEZPOŚREDNIA  

 
 
 
 

 
 
 

np. Wykrywanie antygenu chlamydia trachomatis w wymazach z kanału szyjki macicy.  

 

1) 

Dwubarwna reakcja immunofluorescencji

 

 

 

Wykorzystujemy dwa fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, co pozwala nam na ocenę w preparacie dwóch 
różnych antygenów. Reakcja przebiega w kilku etapach: 



 

Badany materiał inkubujemy ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla pierwszego antygenu (np. p/ciała 
przeciw białku SpoIIAB znakowane FITC, dającym kolor zielony) 



 

Następnie inkubujemy próbkę ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla drugiego antygenu (np. anty DNA 
znakowane RITC, dającym kolor czerwony) 

Wynikiem reakcji jest dwukolorowy preparat oceniany w mikroskopie fluorescencyjnym. 
Zastosowanie – np. wykrywanie komórek Baccillus subtilis przekształcających się w przetrwalnik

i. 

 

 
 
 

METODA IMMUNOFLUORESCENCYJNA POŚREDNIA  

 

Charakteryzują się większą czułością. 

 
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych 
fluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym 
antygenem.  
 
Wynik pozytywny: fluorescencja 

obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym 

Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
Technologia BIOCHIP 

 

Wycinki tkanek, hodowle komórek lub rozmazy bakterii są umieszczane na 

cieniutkich płytkach szklanych, które są dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty 
(BIOCHIPy), które są przyklejane automatycznie do szkiełek mikroskopowych. Technologię 
tą można wykorzystać do wykrywania w jednej próbce przeciwciał przeciwko kilku 
antygenom. 
Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce infekcji układu oddechowego: 
  
 
bakteryjnych: 



  Botredella pertussis i parapertussis 



  Haemophilus influenzae 



  Leginonella pneumoniae 



  Klebsiella pneumoniae 



  Chlamydia trachomatis 



  Chlamydophila pneumoniae 

 

wirusowych: 



  Herpes simplex virus 1 



  Wirusy oddechowe 



  Adenovirus 



  Influenza A i B virus 



  Parainfluenza virus 1-4 



  Coxsackie (A7, A9, A16, A24, B1 do 

B6) 

 

 

1)  Metody immunomorfologiczne EIA (immunohistochemiczne) 

 
 

Analogicznie do w/w testów immunoenzymatycznych, w metodach tych do 

znakowania przeciwciał stosuje się enzymy katalizujące reakcje dające barwne produkty. 
Detekcji kompleksów dokonuje się za pomocą metod immunohistochemicznych. Są to 
metody jakościowe. Stosowane enzymy muszą spełniać takie same kryteria jak w przypadku 
testów immunoenzymatycznych, stąd też w metodach tych najczęściej stosuje się wyżej 
wymienione enzymy (peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, oksydazę glukozową), 
natomiast stosowane chromogeny to: 



  Tetrachlorowodorek 3,3-dwuaminobenzydyny (DAB) – daje ciemnobrązowy produkt 

nierozpuszczalny w wodzie.  



  3-amino-9-etylokarbazol (AEC) – daje czerwony produkt nierozpuszczalny w wodzie, 

rozpuszczalny w alkoholu. 

 

Reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) 

 
Składa się z dwóch etapów: 



  W pierwszym etapie wykrywamy antygen swoistym 

przeciwciałem 



 

W drugim etapie dodajemy p/ciał znakowanych 
enzymem peroksydaza-antyperoksydaza związanych za 
pomocą mostka – wiążą się one z kompleksem Ab-Ag 
poprzez warstwę pośrednią nieznakowanych p/ciał 
reagujących z przeciwciałem pierwotnym oraz 
kompleksem enzym-antyenzym 



  W trzecim etapie dodajemy H

2

O

2

 i związek 

chromogenny 



  W czwartym etapie odczytujemy wynik reakcji – 

obecność poszukiwanego antygenu oceniamy na 
podstawie wyniku badanej reakcji – obecności lub braku 
brązowego (lub innego koloru) barwnika (zależy od 
chromogenu). 

 
 
 

 
Zastosowanie metody to wykrywanie markerów nowotworowych w tkankach:

 

Typ nowotworu 

Marker wykrywany immunoenzymatycznie 

Mięsak gładkokomórkowy okrężnicy 

Przeciwciała przeciwaktynowe 

Łagodny przerost gruczołu krokowego 

Receptory androgenowe 

Rak przewodów żółciowych 

Receptory Bcl-X 

Chłoniak pochodzący z limf. T 

CD3 

Chłoniak Hodgkin’a 

CD15 

Rakowiak (nowotwór okresu płodowego) 

Chromogranina A 

Chłoniak 

CPP32 

Złośliwy międzybłoniak pochodzący z 
nowotworu błony surowiczej 

Cytokeratyna 5/6 

Rak piersi 

Receptor estrogenowy 

Czerniak złośliwy 

Kompleksy melaniny A 

 

 

Reakcja fosfataza alkaliczna – antyfosfataza alkaliczna (APAAP) 

 

 

Zasada metody jest podobna do reakcji PAP, różni się 
jedynie wykorzystywanym kompleksem. 
Zastosowanie metody jest bardzo podobne, służy ona 
do wykrywania obecności antygenów w tkankach. 
Barwne, czerwone produkty reakcji są dobrze 
widoczne w mikroskopie świetlnym. 
 
 
Zastosowanie metody: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

Reakcje z układem biotyna-awidyna 

 
 

W metodzie tej wykorzystuje się wysokie 

powinowactwo biotyny (nisko cząsteczkowej wit. 
H) do zasadowej glikoproteiny białka jaja kurzego 
– awidyny. Czasem zamiast awidyny wykorzystuje 
się streptawidynę, izolowaną z bakterii 
Streptomyces avidini. 
 
  
 

 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Typ nowotworu 

Marker wykrywany 
immunoenzymatycznie 

Anaplasyczny chłoniak 
olbrzymiokomórkowy 

CD30 

Łuskowaty rak skóry 

Nabłonkowy cz. wzrostu 
EGFR 

Chłoniak obwodowy 
wyw. z limfocytów T 

Granzym B 

 

Cytometria przepływowa 

 

Jest to nowoczesna metoda badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek układu 

krwiotwórczego. Pozwala ona na jednoczesne określenie: 



 

Komórek krwi na podstawie ich wielkości i granularności (populacje erytrocytów, granulocytów, 
limfocytów, monocytów i trombocytów) 



 

Różnych rodzajów antygenów różnicowania (CD) i innych poprzez użycie przeciwciał monoklonalnych 
znakowanych różnymi fluorochromami. 

Warunkiem wykonania analizy cytometrycznej jest doprowadzenie posiadanego materiału do zawiesiny 
pojedynczych komórek. Przy pobieraniu krwi do badań cytometrycznych stosujemy odpowiedni antykoagulant: 



 

EDTA i heparyna – dla pełnej krwi 



 

Hirudyna – dla szpiku kostnego 

Po dokonaniu analizy można komórki sortować na poszczególne frakcje stosując odpowiednie urządzenie 
pomiarowe, tzw. sorter komórek. 
 
 

Zasada metody polega na tym, że komórki kierowane są do kanału w strumieniu cieczy pojedynczo, po 

czym wiązka niebieskiego bądź ultrafioletowego światła oświetla przepływające komórki, ulegając ugięciu i 
rozproszeniu, a jeśli komórki zostały wyznakowane znacznikiem fluorescencyjnym, także wzbudzając 
fluorescencję. Źródłem światła są lasery lub rtęciowe lampy wysokociśnieniowe. Światło ugięte i rozproszone, a 
także fluorescencyjne zbierane jest przez odpowiednio dopasowany układ optyczny, przesyłający je poprzez 
filtry zaporowe do detektorów. Następnie dołączony system automatyki, sterowania oraz komputer zbiera i 
przetwarza uzyskane dane, co pozwala na ocenę parametrów co najmniej 100 komórek na sekundę. Liczba 
mierzonych parametrów zależy od rodzaju przyrządu. 

Wykorzystywane w tej metodzie barwniki to fikobiliproteiny: 



 

Fikoerytryna B, fikoerytryna R (światło czerwone) 



 

Fikocyjanina C, fikocyjanina R (światło fioletowe) 



 

Allofikocyjanina (światło zielone) 

Do oznaczania DNA w komórce stosowany jest jodek propidyny. 
 
Techniką cytometrii przepływowej możemy: 



 

Określić liczebność populacji komórek w badanym materiale 



 

Określić cechy morfologiczne (fenotyp) badanych komórek 



 

Ocenić stan czynnościowy komórek 



 

Oznaczyć stopień ekspresji antygenu na powierzchni komórek 



 

Oznaczać ilościowo niektóre białka (cytokiny) 

 
Wyznaczanie powyższych parametrów jest przydatne w diagnostyce klinicznej – umożliwia monitorowanie stanu 
immunologicznego w trakcie choroby i leczenia.  
 



 

Określić fenotyp komórek blastycznych w białaczkach ostrych 



 

Diagnozować: 

- chłoniaki 
- białaczki przewlekłe 
- zespoły mielodysplastyczne (MDS) 



 

Oceniać DNA w komórkach białaczkowych 



 

Poszukiwać choroby resztkowej (MRD) 



 

Oceniać molekułę lekooporności (MDR) 



 

Monitorować pacjentów po przeszczepach allogenicznych i szpiku 



 

Badać komórki krwiotwórcze, retikulocyty i erytrocyty 



 

Oceniać morfologicznie i czynnościowo płytki krwi 



 

Diagnozować AIDS przez ocenę limfocytów CD4 



 

Wykrywać erytrocyty płodu we krwi matki 



 

Oznaczać ilościowo cytokiny 

 
Najczęściej stosowane markery to: 



 

CD45 leukocytów 



 

CD3 limfocytów 



 

CD19 i CD20 limfocytów B 



 

CD15 neutrofili 



 

CD16 i CD56 komórek NK