MATERIAŁY POMOCNICZE DO ĆWICZEŃ

-1-

SPIS TREŚCI

1.Wstępne uwagi praktyczne................................................................................................................4
1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń...........................................................................................................4
1.2. Zasady BHP.................................................................................................................................4

2. Węglowodany.....................................................................................................................................5
2.1. Badanie własności monosacharydów, disacharydów i polisacharydów.....................................12
2.1.1. Reakcja Molischa z

- nafolem........................................................................................12

           2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy.....................................................................12
2.2. Wykrywanie pentoz........................................................................................................................13
           2.2.1. Próba Biala  z orcyną na pentozy......................................................................................13
    2.3. Reakcje redukcyjne.....................................................................................................................13
           2.3.1. Reakcja Trommera............................................................................................................13
           2.3.2. Reakcja  Fehlinga..............................................................................................................14
           2.3.3. Reakcja Bendedicta...........................................................................................................14
           2.3.3. Reakcja Tollensa...............................................................................................................14
    2.4. Disacharydy................................................................................................................................15
           2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy.............................................................................................15
    2.5. Polisacharydy..............................................................................................................................15
           2.5.1. Reakcja skrobi z jodem.....................................................................................................16
           2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem...............................................................................................17
           2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi...................................................................................................17
    2.6. Osazony.......................................................................................................................................17
    2.7. Identyfikacja cukrów..................................................................................................................19

3.  Aminokwasy....................................................................................................................................20
    3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów............................................................................21
           3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena.....................................................................21
           3.1.2. Reakcja van Slyke’a z kwasem  azotowym (III)..............................................................22
           3.1.3. Reakcja ninhydrynowa.....................................................................................................23
           3.1.4. Reakcja dla cysteiny.........................................................................................................23
           3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych........................................24
           3.1.6. Reakcja dla układu indolowego  w tryptofanie................................................................24
           3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie......................................25

4. Białka................................................................................................................................................26
    4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek.........................................................................................27
           4.1.1. Wykazanie amfoterycznego charakteru białek.................................................................27
           4.1.2. Zachowanie się białek w obecności kwasów....................................................................27
           4.1.3. Zachowanie się białek w obecności  zasad.......................................................................27
    4.2. Białka jako koloidy.....................................................................................................................27
    4.3. Denaturacja białek......................................................................................................................28
           4.3.1. Denaturacja cieplna..........................................................................................................29
           4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu..................................................................................29
           4.3.3. Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego...............................................29
           4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów..............................................................................29
           4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów...............................................................................30
    4.4. Reakcje barwne białek...............................................................................................................30
           4.4.4. Reakcja biuretowa............................................................................................................30
           4.4.5. Reakcja Libermana...........................................................................................................31
    4.5. Oczyszczanie białek metodą dializy...........................................................................................31
    4.6. Kolorymetria...............................................................................................................................33
           4.6.1. Ilościowe oznaczenie białka w surowicy krwi metodą Lowry’ego..................................35

-2-

5. Kwasy nukleinowe...........................................................................................................................36
    5.1. Badanie własności kwasów nukleinowych.................................................................................37
           5.1.1. Hydroliza kwasów nukleinowych , badanie produktów hydrolizy...................................37
  5.2. Odróżnienie RNA od DNA..........................................................................................................39
           5.2.1. Reakcja orcynolowa.........................................................................................................39
           5.2.2. Reakcja z difenyloaminą..................................................................................................39

6. Lipidy...............................................................................................................................................40
    6.1. Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych.......................................................................41
           6.1.1. Rozpuszczalność lipidów.................................................................................................41
           6.1.2. Badane składu lipidów prostych – próba akroleinowa....................................................41
           6.1.3. Reakcja zmydlania...........................................................................................................42
           6.1.4. Wykazane obecności w lipidach prostych nienasyconych kwasów tłuszczowych
                     – reakcja H

bla................................................................................................................44

           6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.....................................................................................44
    6.2. Tłuszcze złożone – badanie składu lecytyn...............................................................................44
           6.2.1. Wykrywanie glicerolu......................................................................................................45
           6.2.2. Wykrywanie kwasów tłuszczowych................................................................................45
           6.2.3.  Wykrywanie kwasu fosforowego....................................................................................45

7. Cholesterol........................................................................................................................................46
    7.1. Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu...............................................................................46
           7.1.1. Reakcja Salkowskiego......................................................................................................46
           7.1.2. Reakcja Libermana-Burcharda.........................................................................................46

8. Kwasy żółciowe................................................................................................................................47
    8.1. Reakcje charakterystyczne dla  kwasów żółciowych.................................................................47
           8.1.1. Próba Haya........................................................................................................................47
           8.1.2. Emulgujące działanie żółci...............................................................................................47
           8.1.3.. Próba Pettenkofera...........................................................................................................47

9. Hormony steroidowe........................................................................................................................48
    9.1. Reakcje charakterystyczne dla hormonów  steroidowych..........................................................50
           9.1.1. Reakcja Zimmermanna.....................................................................................................50
           9.1.2. Reakcja Kobera.................................................................................................................50
           9.1.3. Reakcja Portera-Silbera....................................................................................................50
           9.1.4. Reakcja z błękitem tetrazoliowym....................................................................................50

10. Hemoglobina...................................................................................................................................51
     10.1. Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych..................................................52
            10.1.1. Otrzymywanie methemoglobiny....................................................................................52
            10.1.2. Otrzymywanie hematyny kwasowej..............................................................................52
            10.1.3. Otrzymywanie hematyny zasadowej i hemochromogenu.............................................53

11. Produkty rozpadu hemu...............................................................................................................53
      11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych..........................................................55
             11.1.1. Próba Gmelina..............................................................................................................55
             11.1.2. Próba Rosina.................................................................................................................55
             11.1.3. Próba Cole’a..................................................................................................................55
             11.1.4. Próba Schlesingera........................................................................................................55

12. Witaminy........................................................................................................................................56
12.1. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie....................................60
12.1.1. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Jensena.............................................60

12.1.2. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Eulera i Adlera.................................60

-3-

12.1.3. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Greena.........................................................60

      12.2. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach................................60
              12.2.1. Wykrywanie obecności witaminy A –metoda Carra i Price’a....................................60
              12.2.2. Wykrywanie obecności witaminy D

w tranie............................................................61

12.2.3. Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe

..................................................61

12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty............................................................62
12.4. Ilościowe oznaczanie witaminy C w mleku.......................................................................... 62

13. Enzymy..........................................................................................................................................63
      13.1. Kinetyka reakcji enzymatycznych.........................................................................................64
               13.1.1. Badanie szybkości reakcji I- rzędu i wyznaczanie stałej K na przykładzie
                           hydrolizy sacharozy...................................................................................................65
      13.2. Enzymy reakcje barwne.........................................................................................................67
               13.2.1. Wykrywanie katalazy.................................................................................................67
               13.2.2. Wykrywanie peroksydazy..........................................................................................67
               13.2.3. Wykrywanie oksydazy fenolowej..............................................................................68
               13.2.4. Wykrywane oksydazy polifenolowej.........................................................................68
               13.2.5. Rozkład mocznika pod wpływem ureazy...................................................................68
               13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę.........................................................................69
               13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta.....................69
               13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt
                           gospodarskich.............................................................................................................71

-4-

1. WSTĘPNE UWAGII PRAKTYCZNE

1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń:

•

Obecności

- student obowiązany jest być na wszystkich zajęciach, w wyjątkowej sytuacji

może mieć 2 nieobecności podczas całego roku akademickiego – usprawiedliwione ( nie
ma możliwości odrobienia ćwiczeń).

•

Warunki zaliczenia

– warunkiem otrzymania zaliczenia jest otrzymanie pozytywnych ocen z

kolokwiów obejmujących zakres materiału ćwiczeń , obecności i aktywność studenta na
zajęciach. Student który nie otrzymał zaliczenia w pierwszym terminie, może otrzymać
zaliczenie w terminach poprawkowych ustalonych przez prowadzącego ćwiczenia.

•

Uwaga

!! – Na wszystkich ćwiczeniach konieczne jest posiadanie fartucha ochronnego.

W przypadku jego barku student nie zostanie wpuszczony na salę ćwiczeń.

1.2. Zasady BHP:

1.   Laboratorium   chemiczne   jest   miejscem   pracy   w   którym   należy   zachowywać   się   w   sposób
odpowiedzialny i poważny.
2.  W laboratorium znajdują się  płyny żrące  ,  łatwo palne , trujące  ,  barwiące, dlatego należy
pracować w fartuchu ochronnym.
3.  Na stołach laboratoryjnych znajdują się zestawy odczynników które są dokładnie opisane. Przed
opuszczeniem sali trzeba sprawdzić , czy  wszystkie odczynniki znajdują się na swoim  miejscu.
4. Korzystając z odczynników , należy  pamiętać iż otwierając butelkę trzeba odłożyć korek tak ,aby
nie   zabrudzić   stołu.   Po   użyciu     odczynnika   butelkę   zamknąć   korkiem     i   odstawić   na   właściwe
miejsce.
5.  Nie   wolno   używać   tej   samej   pipety  szklanej   lub   końcówki   pipety  automatycznej   do   różnych
roztworów. Nie wlewać raz pobranego roztworu ponownie do butelki.
6. Należy starannie usunąć rozlane na stół lub podłogę odczynniki.
7.  Przy   ogrzewaniu   cieczy   nad   palnikami   należy     zwrócić   uwagę   na   ustawienie   probówki   pod
odpowiednim kątem i zachować  bezpieczeństwo pracy.
8. Odczynniki stężone i żrące znajdują się pod digestorium. Podczas pracy z nimi należy zachować
szczególną   ostrożność   i   zabezpieczyć   się   ,   stosując     opuszczoną   szybę   wyciągu.   Wszystkie
odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie , szczególnie dla oczu oraz błon śluzowych jamy ustnej i
nosa.
9.  Nie   wolno   pipetować   ustami   stężonych   kwasów,   zasad,   bromu   i   roztworów   cyjanków.
Posługujemy  się w tym celu pipetami zaopatrzonymi w gruszki gumowe, pipetami automatycznymi,
lub biuretami.
10. Żadnej substancji nie bada się smakiem.
11.  W wypadku  oparzenia się kwasem  , należy natychmiast  przemyć  skórę roztworem węglanu
amonu  lub    węglanu sodu.  W  wypadku  poparzenia się  zasadą  -  przemyć   skórę  rozcieńczonym
roztworem kwasu octowego, a następnie spłukać wszystko wodą.
12. W razie dostania się kwasu  lub zasady do ust - natychmiast przepłukać je duża ilością wody , a
następnie wymienionymi w p. 11 roztworami. W przypadku połknięcia roztworu kwasu lub zasady -
wypić dużą ilość mleka lub wody z surowym białkiem jaja.
13. Jeżeli jakiś płyn dostanie się do oka ,natychmiast należy przemyć go dużą ilością wody.
14. Każdy wypadek np. poparzenia lub skaleczenia należy zgłosić osobie prowadzącej ćwiczenia.
15.  Wiele odczynników stosowanych w laboratorium biochemicznym jest truciznami , często więc
należy myć ręce, a bezwzględnie przed opuszczeniem laboratorium.
16. Po wykonaniu ćwiczeń laboratoryjnych  i sprawdzeniu ich przez osobę prowadząca ćwiczenia
zawartość probówek wylewa się do specjalnie przygotowanych  pojemników ,nigdy do zlewu!
17. Przed opuszczeniem laboratorium sprawdź czystość i porządek na swoim stanowisku pracy.

-5-

2. WĘGLOWODANY.

Węglowodany   (   cukry,   sacharydy   )   powstają   w   procesie   fotosyntezy   w   komórkach   roślin
zielonych i stanowią główne  źródło energii.
Ze względu na wielkość cząsteczki  można je podzielić na :

•

monosacharydy ( cukry proste i ich pochodne)

•

oligosacharydy (2,3 lub więcej do 6 cukrów prostych połączonych wiązaniami
o-glikozydowym

•

polisacharydy ( polimery o dużej masie cząsteczkowej zawierające dużą liczbę reszt
monosacharydów)

MONOSACHRYDY

- cukry proste o wzorze ogólnym C

to wielowodorotlenowe aldehydy lub

wielowodorotlenowe ketony . Stąd, jeśli posiadają grupę aldehydową (-CHO) nazywamy je
aldozami, a jeśli grupę ketonową (-C=O) to ketozami.
Natomiast w zależności od liczby atomów węgla w cząsteczce cukru prostego dzielimy je na:

Aldozy (grupa –CHO przy C

) Ketozy ( grupa –C=O przy C

)

Triozy

←

→

Tetrozy

←

→

terulozy

Pentozy

←

→

pentulozy

Heksozy

←

→

heksulozy

Szereg aldoz

-7-

Jeżeli grupa alkoholowa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest po stronie prawej to taki
cukier należy do szeregu D , jeśli jest po stronie lewej do szeregu L.

Formy D i L cukrów są izomerami optycznymi zwanymi enancjonomerami czyli odbiciami
lustrzanymi. Tak więc izomeria D i L to izomeria lustrzana.
.

Od ilości węgli asymetrycznych w cząsteczce cukrów zależy ilość jego odmian optycznych tzw.
stereoizomerów. Zgodnie z regułą La Bel-Van’t Haffa przy „n” asymetrycznych węgla istnieje 2

odmian stereoizomerów. np. 2

= 2 (triozy), 2

= 4 (terozy) itd.

Obecność węgli asymetrycznych nadaje również cukrom zdolność optyczną skręcania płaszczyzny
światła spolaryzowanego (monochromatycznego) , które przechodzi przez dany monocukier lub jego
roztwór. Jeśli cukier skręca   płaszczyznę światła spolaryzowanego w  prawo to jest to forma (+)  ,
gdy w lewo (-). Prawo – lub lewoskrętność danego związku zależy od asymetrii  wszystkich  grup
alkoholowych  (OH)  natomiast przynależność do szeregu D lub L od asymetrii tylko jednej grupy
alkoholowej, która znajduje się przy ostatnim  węglu asymetrycznym tj. węglu C

w pentozach i C

heksozach.

Aldehyd D- glicerynowy Aldehyd L- glicerynowy

Oznacza to, że przynależność monosacharydu do szeregu D lub L nie pozostaje w żadnym
związku z jego prawo- lub lewoskrętnością i dlatego istnieją cukry należące do szeregu D, które
skręcają płaszczyzną światła spolaryzowanego w lewo np. D-fruktoza (-92,3

Cechą   charakterystyczna   cukrów   prostych   jest   zdolność   tworzenia   form   cyklicznych
(pierścieniowych)  w środowisku obojętnym lub słabo kwaśnym. Podczas cyklizacji powstaje nowy
węgiel asymetryczny przy  C

w aldozach i C

w ketozach , przy czym cukry mogą cyklinować w

formy piranozowe lub furanozowe.

piran furan

Podczas cyklizacji powstaje wiązanie półacetalowe tj mostek tlenowy :

- w przypadku aldoz mostek tlenowy powstaje między: C

- C

(forma piranozowa)

– C

(forma furanozowa)

- w przypadku ketoz mostek tlenowy powstaje między: C

– C

(forma piranozowa)

- C

(forma furanozowa)

-8-

Nowopowstały węgiel asymetryczny C

w aldozach i C

w ketozach nosi nazwę węgla

anomerycznego, a zachodzące zjawisko anomerii. Utworzenie nowego węgla daje możliwość
różnego ułożenia podstawników tj. grupy OH i H przy tym węglu, powstają więc anomery

Anomer

- występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy

ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji cis tj. po tej samej stronie cząsteczki.

Anomer

- występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy

ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji trans tj. po przeciwnych stronach cząsteczki

Cyklizacja monosacharydów

Tworzenie formy piranozowej przez glukozę:

Przy przepisywaniu wzoru Fishera na pierścień wszystkie

grupy OH

będące po

prawej stronie

wzorze Fishera idą

pod pierścień

, a będące po stronie

lewej nad pierścień.!!!

Wzór łańcuchowy -Fishera

Wzór pierścieniowy (taflowy) Howortha

2. Tworzenie formy furanozowej przez fruktozę:

-9-

Wiele monosacharydów różni się między sobą jedynie przestrzennym ułożeniem atomów – są to
izomery . Na przykład glukoza, galaktoza, mannoza maja identyczny wzór sumaryczny , ale różnią się
przestrzennym ułożeniem grup OH i atomów wodoru przy jednym lub dwóch atomach węgla

Te niewielkie różnice konfiguracji mają jedynie znikomy wpływ na właściwości chemiczne tych
cukrów.

Pochodne monosacharydów

1. Estry cukrów:

Reszta fosforanowa -PO

(w poniższych wzorach przedstawiana będzie jako P) może być

przyłączana przy C

, C

lub C

i C

O - P

-D-glukopiranozo-6-fosforan

-D-glukopiranozylo-1-fosforan

-D-glukopiranozylo-1,6-bisfosforan

Aminocukry : wchodzą w skład wielocukrów . W połączeniu z białkami decydują o

swoistości antygenowej komórek i tkanek.

-10-

Kwasy cukrowe dzielimy je na:

•

Jednokarboksylowe :

Aldonowe – utlenienie do grupy COOH przy C

(kwas glukonowy, manannowy,

galaktanowy)

Uronowe – utlenienie końcowej grupy alkoholowej do COOH przy C

(kwas

glukuronowy, mannouronowy, galaktouronowy)

•

Dwukarboksylowe:

aldarowe , utlenienie obu skrajnych węgli C

i C

do COOH ( kwas

glukarowy mannarowy, galaktarowy)

OLIGOSACHRYDY

To związki których cząsteczki powstają przez połączenie od dwóch do dziesięciu reszt
monosacharydów wiązania o-glikozydowymi. W grupie tej najważniejsze są disacharydy (dwucukry).

2.1.1 Reakcja Molischa z

- naftolem

Zasada: jest to najbardziej ogólna reakcja na cukry zarówno wolne jak i związane. Ujemny jej wynik
wyklucza obecność cukru, dodatni zaś nie zawsze jest wystarczający do jego stwierdzenie ponieważ
podobną reakcję dają np. aldehydy ,acetony .Zasada próby polega na powstaniu czerwono-
fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z

- naftolem.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy
10% etanolowy roztwór

-naftolu

– stężony

Do 1ml roztworu glukozy dodać 1-2 kropli świeżo sporządzonego 10% etanolowego roztworu

naftolu. Po dokładnym zmieszaniu , bardzo ostrożnie! po ściance probówki wprowadzić 1 ml
stężonego roztworu H

tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia

się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Pierścień zielony określa negatywną reakcję
. Dla porównania przeprowadzić reakcję z wodą!

2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy
Zasada:  W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający dużo
łatwiej   z   ketoz   niż   z   aldoz   pod   wpływem   działania   kwasu   solnego.   Próba   ta   pozwala   więc   na
odróżnienie ketoz od aldoz     ponieważ w obecności rozcieńczonego roztworu HCL tylko ketozy
ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w temp.100

C przez 30 sekund

Wykonanie oznaczenia :
Odczynniki : roztwór fruktozy
roztwór glukozy
odczynnik Seliwanowa (0,05%roztwór rezorcyny w 25%HCL)

-13-

Do dwóch probówek dać 1 ml odczynnika Seliwanowa. Do pierwszej dodać 2 krople roztworu
fruktozy a,do drugiej 2 krople glukozy. Po dokładnym zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej.
Wyjąć obie probówki po 30 sekundach i porównać zabarwienie. W obecności ketozy w ciągu 30
sekund powstaje czerwone zabarwienie. Roztwory aldoz krótko ogrzewane nie ulegają
zabarwieniu. Zabarwienie może wystąpić po dłuższym ogrzewaniu .

2.2. Wykrywanie pentoz

2.2.1  Próba Biala z orcyną na pentozy
Zasada:  W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl  daje z orcyną
kompleks o barwie zielonej

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór pentozy (np. ksylozy, rybozy)
0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
1% FeCl

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl

i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić

do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla
porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie )

2.3. Reakcje redukcyjne
W środowisku zasadowym formy pierścieniowe cukrów przekształcają się w formy łańcuchowe z
odtworzeniem wolnych grup aldehydowych lub ketonowych. Grupy te nadają cząsteczkom cukru
własności redukcyjne. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa lub ketonowa redukuje
niektóre jony metali ciężkich Szczególnie łatwo redukują jony metali takich jak : Cu

, Bi

+2,

Ponieważ w środowisku zasadowym wodorotlenki tych metali wytrącają się w postaci koloidalnych
osadów,   co   nie   pozwala   na   wykazanie   redukcyjności     cukrów   zwykle   wprowadza   się   związki
organiczne   (winian   sodowo-potasowy),   które     z   wodorotlenkami   metali   ciężkich   tworzą
rozpuszczalne kompleksy. Na wskutek dysocjacji takiego kompleksu  w roztworze pojawiają się jony

metali , które mogą ulec redukcji przez cukier redukujący. W reakcjach tych cukrowiec ulega
utlenieniu, przy czym produktu utlenienia są rozmaite w zależności od przebiegu reakcji.

2.3.1. Reakcja Trommera
Zasada: Próba ta polega na redukcji przez cukier jonu miedzi Cu

do Cu

Przebiega ona w

podwyższonej temperaturze w środowisku alkalicznym. Jeżeli ogrzewamy wodorotlenek miedzi w
roztworze alkalicznym to przechodzi on w czarny nierozpuszczalny tlenek miedzi (I) zgodnie z
reakcją:

CuSO

+ 2NaOH

→

Cu(OH)

+ Na

Cu(OH)

→

CuO + H

czarny osad

W obecności cukru-związku redukującego reakcja ta przebiega odmiennie:

2Cu(OH)

→

O + 2H

O + 1/2O

                                                                        osad czerwony
Powstają   nierozpuszczalne   kryształki   tlenku  miedzi   (I)   ,  które   w   zależności   od  swojej   wielkości
posiadają barwę od żółtej  przez pomarańczową do czerwonej. Reakcja ta jest bardzo czuła i pozwala
wykryć nawet ślady cukrów.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy (lub innego monosacharydu)
1M NaOH
0,2 N CuSO

Do 2 ml glukozy dodać 5 kropli 1M NaOH i kroplami 0,2N CuSO

aż do momentu pojawienia się

osadu Cu(OH)

(należy unikać nadmiaru siarczanu miedzi gdyż wytrąca się czarny tlenek miedzi (II)

maskujący właściwą barwę). Po podgrzaniu we wrzącej łaźni wodnej około 5 minut wytrąca się
pomarańczowo- czerwony osad Cu

O . Dla porównania reakcję wykonać na wodzie .

-14-

2.3.2 Reakcja Fehlinga
Zasada: jest to zmodyfikowana reakcja Trommera, w której zastosowano winian sodowo-potasowy
(sól Seignetta) jako odczynnik zapobiegający wytrącaniu się jonów Cu

+2.

tworzy on z jonami Cu

sól

kompleksową. W ten sposób nadmiar nie zredukowanych jonów Cu

pozostaje w roztworze nie

przechodząc w czarny tlenek miedzi (II) CuO. Dalszy przebieg reakcji jest identyczny jak w
przypadku reakcji Trommera.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy
Fehling I (roztwór CuSO

)

Fehling II (NaOH + winian sodowo-potasowy)

Do probówki wlać około     2 ml glukozy oraz   1 ml Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II .   Zawartość
probówki   bardzo  dokładnie  wymieszać,  a   następnie   ogrzewać   we  wrzącej   łaźni  wodnej   przez
około   10   minut   dla   uzyskania  czerwono-   pomarańczowego  osadu   tlenku   miedzi   (I)  Cu

O. Dla

porównania przeprowadzić reakcją na wodzie.

2.3.3.Reakcja Benedicta
Zasada: Podobnie jak w próbach Tromera i Fehlinga w tej reakcji redukcji ulegają jony Cu

do Cu

pod wpływem cukru. Odczynnikiem utrzymującym jony Cu

w roztworze jest cytrynian

sodowy ,pełniący rolę soli Seignetta

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:roztwór glukozy
odczynnik Benedicta(CuSO

+ Na

bezw. + cytrynian sodu)

Do około 2 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropli glukozy, wymieszać i ogrzać na łaźni wodnej
3 – 5 minut. Po oziębieniu wytrąca się czerwono-pomarańczowy osad tlenku miedzi (I) Cu

Dla porównania przeprowadzić reakcję na wodzie.

2.3.4 Reakcja Tollensa
Zasada:Redukcja soli srebra do srebra metalicznego w środowisku alkalicznym , w obecności
wolnych grup aldehydowych lub ketonowych cukrów. Reakcja przebiega następująco:

AgNO

+ NH

→

AgOH + NH

AgOH + 2NH

→

Ag(NH

)

2Ag(NH

)

OH + R-CHO

→

2Ag + R- COONH

+ NH

+ H

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki:roztwór glukozy (lub innego cukru)
roztwór azotanu srebra
amoniak

Do suchej i czystej probówki wlać 0,5 ml roztworu azotanu srebra , a następnie dodawać po kilka
kropli   amoniaku,   aż   powstający   osad   AgOH     rozpuści   się   w   nadmiarze.   Do   powstałej   soli
kompleksowej   dodać   2   ml   glukozy   lub   innego   cukry   redukującego   i   po   wymieszaniu   umieścić
probówkę we wrzącej łaźni wodnej .  Po około 10 minutach wydzieli się na ścianach probówki
metaliczne srebro w postaci lustra.

-15-

2.4. Disacharydy

Disacharydy (dwucukry) składają się z dwóch cząsteczek cukrów prostych połączonych wiązaniem
o- glikozydowym. Wiązanie glikozydowe nie odznacza się dużą trwałością szczególnie w obecności
jonów   wodorowych.   Hydrolizę   wiązania   glikozydowego   można   bardzo   łatwo   przeprowadzić   pod
wpływem   kwasów,   lub   enzymatycznie.   Enzymy   katalizujące   tę   reakcje   odznaczają   się   dużą
specyficznością działania , zależną  nie tylko od rodzaju składników ale i również od typu wiązania
glikozydowego (

Powszechnie   występującym   disacharydem   jest  sacharoza  popularny   cukier   spożywczy,   który
otrzymuje  się na skale przemysłową    z trzciny cukrowej i buraków cukrowych.  Disacharyd    ten
utworzony jest przez reszty glukozy i fruktozy połączone  anomerycznymi atomami węgla.
Hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy katalizuje sacharaza nazywana również inwertazą.

2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy
Zasada: pod wpływem kwasów mineralnych sacharoza ulega rozpadowi na glukozę i fruktozę.
Rozpad sacharozy zachodzi również wpływem enzymu - inwertazy.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór sacharozy
2M H

2M NaOH

Odmierzyć 20 ml sacharozy do erlemajerki i dodać 6 ml 2M H

Roztwór w zlewce podgrzać do

wrzenia i gotować przez 3 minuty. Po ostudzeniu zobojętnić 2 M NaOH , kontrolując proces
zobojętnienia papierkiem lakmusowym. Na produktach hydrolizy wykonać reakcję Fehlinga.

(str

14)

2.5. Polisacharydy

Polisacharydy (wielocukry) należą do związków organicznych najobficiej występujących w
przyrodzie. Są one produktami polikondensacji monosacharydów połączonych wiązaniami
glikozydowymi. Sumaryczny wzór wielocukrów jednoskładnikowych można wyrazić jako:
M

[

(n-1)H

]

, gdzie M oznacza dowolny monosacharyd , zaś n - liczbę jego cząsteczek. Masa

cząsteczkowa polisacharydów waha się w szerokich granicach tj. od kilku tysięcy do kilku milionów.
Ze względu na budowę chemiczną polisachrydy można podzielić na homoglikany (jednoskładnikowe:
np. skrobia, glikogen, celuloza) i heteroglikny (wieloskładnikowe: np. chondroityna, heparyna, kwas
hialuronowy).
Roślinną substancja zapasową jest skrobia składająca się z amylozy i amylopektyny. Amyloza nie ma
rozgałęzień i jest zbudowana z reszt glukozy połączonych wiązaniami

-1,4-glikozydowymi.

Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi, w której na jedno wiązanie

-1,6-glikozydowe

przypada około trzydzieści wiązań

-1,4- glikozydowych. Połowę węglowodanów spożywanych

przez ludzi stanowi skrobia. Zarówno amylopektyna jak i amyloza są hydrolizowane przez

-amylazę

wydzielaną przez gruczoły ślinowe i przez trzustkę.
Komórki zwierzęce magazynują glukozę w postaci glikogenu. Glikogen jest rozgałęzionym
polimerem o dużej masie cząsteczkowej , zbudowanym z reszt glukozy. Większość reszt glukozy jest
w glikogenie połączona wiązaniami

-1,4-glikozydowymi. Rozgałęzienia powstają w miejscach

wiązań

-1,6- glikozydowych występujących przeciętnie co dziesięć reszt glukozy.

Bardzo ważnym polisacharydem roślinnym jest celuloza pełniąca funkcje strukturalne , a nie
odżywcze. Jest ona nie rozgałęzionym polimerem reszt glukozy , połączonych wiązaniami

-1,4-

glikozydowymi. Konfiguracja

pozwala celulozie na tworzenie bardzo długich , prostych łańcuchów.

-16-

2.5.1.Reakcja skrobi z jodem
Zasada:  Cząsteczki   jodu   wchodzą   „do   kanału”   utworzonego   przez   spiralnie   skręcone   łańcuchy
polisacharydu i są  „przytrzymywane”  przez tlen przy  pierwszym i czwartym atomie węgla każdej
cząsteczki glukozy . Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu , wzdłuż którego mogą przesuwać się
elektrony , co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Skrobia na wskutek  adsorbcji
cząstek jodu barwi się na kolor niebieski.

Wiązanie

1,6-glikozydowe

Miedzy dwiema resztami glukozy

Wiązanie

1,4-glikozydowe między dwiema

resztami glukozy

Barwa kompleksu zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza daje z
jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna - fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie
jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem . Musi istnieć konfiguracja helisu, aby cząsteczki jodu
mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na 6 reszt glukozydowych czyli
na jeden skręt helisu co jest przyczyną znikania zabarwienia z jodem

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki:kleik skrobiowy
J

w KJ

1M NaOH
2 M HCL

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu J

w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie.

Probówkę w której powstała niebieska barwa ogrzać - niebieskie zabarwienie znika. Po
ochłodzeniu pod wodą zabarwienie powraca.

-17-

1. Wpływ zasad na zabarwienie z jodem.
W środowisku zasadowym zabarwienie nie powstaje ponieważ jod reaguje z zasadą według
równania:

+ 2NaOH

→

NaJ +Na JO + H

2. W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:
NaJO + NaJ + 2HCL

→

2NaCL + J

+ H

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1M roztworu NaOH i kroplę roztworu jodu w KJ.
Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym (2M HCL), barwa pojawia się.

2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem

Odczynniki: roztwór glikogenu
J

w KJ

Do roztworu glikogenu (1ml) dodać dwie krople J

w KJ. Powstaje jasno-czerwonobrunatne

zabarwienie.

2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi:
Zasa

da:

skrobia pod wpływem kwasów lub enzymów (

amylazy) ulega hydrolizie do dwucukru

maltozy poprzez stadium dekstryn.

Skrobia

→

skrobia rozpuszczalna

→

dekstryny

→

maltoza

W czasie hydrolizy skrobi tworzą się najpierw dekstryny o dużej cząsteczce - amylodekstryny
(zabarwienie z jodem -fioletowe), które ulegają dalszemu rozkładowi na erytrodekstryny

(zabarwienie z jodem- czerwone). Powstałe przy dalszej hydrolizie achrodekstryny nie dają
zabarwienia z jodem. Produktem końcowym jest maltoza.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kleik skrobiowy
2N H

w KJ

Do kolbki odmierzyć 30 ml kleiku skrobiowego dodać 12 ml 2N H

, ogrzewać do wrzenia na

płytce nad palnikiem. W statywie umieścić 10 probówek z dwoma kroplami J

w KJ. Od chwili

zagotowania skrobi należy zmniejszyć płomień palnika i pobierać z kolbki (która cały czas znajduje
się na płytce) co 1 minutę po około 1ml gotującej skrobi i wlewać ją do kolejnych przygotowanych w
statywie probówek z jodem. Po rozcieńczeniu próbek wodą (10 ml)   przy prawidłowo wykonanej
hydrolizie   otrzyma   się  skalę   barw   od   ciemnoniebieskiej   poprzez   fioletową,  czerwoną   do
bezbarwnej -  odpowiada to poszczególnym stadiom rozkładu skrobi.

2.6. Osazony

Monosachardy , zarówno aldozy jak i ketozy oraz disacharydy redukujące reagują z aminami  np.
z fenylohydrazyną. W pierwszym etapie kondensacji z fenylohydrazyną powstają fenylohydrazony,
które   następnie   utleniają   się   w   przypadku   aldoz   do   ketofenylohydrazonów   zaś   ketozy   do
aldofenylohydrazonów.   Powstałe   związki   kondensują   z   kolejną   cząsteczką   fernylohydrazyny,   co
prowadzi ostatecznie do wytworzenia difenylohydrazonów czyli osazonów , niezależnie od tego czy
cukrowcem była  aldoza czy ketoza. Na tym  etapie reakcja zatrzymuje  się na wskutek powstania
chelatowego wiązania między atomami azotu obydwóch reszt fenylohydrazyny.  Wytrąca się   żółty
osad o charakterystycznych kształtach. Reakcja przebiega według równania:

-18-

Na podstawie tej reakcji nie można jednak rozróżnić monosacharydów epimerycznych . Różnią się
one bowiem ułożeniem podstawników tylko przy dwóch kolejnych  (C-1i C-2) atomach węgla w
cząsteczce, przy których zachodzi właśnie reakcja kondensacji z fenylohydrazyną. Do takich  heksoz
należy glukoza , fruktoza i mannoza. Proces enolizacji umożliwiający zamianę tych heksoz , zachodzi
w środowisku rozcieńczonych wodorotlenków  następuje etapami i jest odwracalny. Otwarcie formy

kwasowy bądź zasadowy. W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton i staje się
kationem. Natomiast w środowisku zasadowym oddaje proton i zachowuje się jak anion.
W środowisku o pH obojętnym aminokwasy występują w formie zjonizowanej jak jony obojnacze
(jony dwubiegunowe) Aminokwas w postaci jonu obojnaczego ma protonową grupę aminową (NH

)

oraz zjonizowana grupę karboksylową (COO

)





COOH H



COO



                        R                                                              R
                  aminokwas                                              jon dwubiegunowy
           postać niezjonizowana                          ( obojnaczy , dipol aminokwasu)

Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu .W roztworze kwaśnym
(np. pH 1) cofa się dysocjacja grupy karboksylowej – staje się ona niezjonizowana (COOH) , a
zjonizowana pozostaje grupa aminowa (NH

) W roztworze zasadowym(np. pH 11) zjonizowana jest

grupa karboksylowa (COO

),a niezjonizowana - grupa aminowa (NH

)





COOH H



COO



COO



R R

forma przeważająca forma przeważająca forma przeważająca
w pH 1 w pH 7 w p H 11

Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) zawierają cztery różne podstawniki wokół węgla

(węgiel połączony z grupą karboksylową) . Ich steroizomery, należące do szeregu D lub L, są
optycznie czynne. W białkach występują tylko L-aminokwasy, a jonizacji ulegają jedynie grupy w
łańcuchach bocznych



R aminokwasów oraz końcowa grupa aminowa i karboksylowa, ponieważ

pozostałe grupy karboksylowe i aminowe są zablokowane wiązaniem peptydowym (



CO-NH



). Ze

wzglądu na to , że łańcuch boczny aminokwasu może posiadać ładunek ujemny lub dodatni, wyróżnia
się aminokwasy obojętne, kwaśne i zasadowe Ponadto wchodzące w skład białek aminokwasy, mogą
zawierać w łańcuchu bocznym niepolarne grupy hydrofobowe bądź polarne reszty hydrofilowe, które
nie ulegają jonizacji lub mogą dysocjować tylko przy odpowiednim pH roztworu.. Różne łańcuchy
boczne aminokwasów sprawiają, że związki te wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne.
Aminokwasy  mają różną wielkość i  różny charakter kwasowo-zasadowy.
W obrębie aminokwasów wchodzących w skład białek tradycyjnie wyróżnia się dwie grupy . Do
pierwszej z nich należą aminokwasy niepolarne, które mają     boczny łańcuch alifatyczny (glicyna,
alanina,   walina,   leucyna,   izoleucyna   i   metionina)   lub   pierścień   aromatyczny   (fenyloalaniana,
tyrozyna,  tryptofan).  Do tej grupy zalicza się  także prolinę  hydrofobowy iminokwas zawierający
drugorzędową grupę iminową.
W obrębie drugiej grupy znajdują się aminokwasy polarne, które w łańcuchu bocznym mają grupę
hydroksylową   niejonizującą   w   warunkach   fizjologicznych   (pH   ok.   7,4),   ale   uczestniczącą   w
tworzeniu wiązań wodorowych (seryna, treonina i tyrozyna) oraz nie jonizująca grupę sulfhydrylową
- cysteina, która może tworzyć wiązanie dwusiarczkowe z inną resztą cysteiny. Z kolei aminokwasy
dikarboksylowe   (kwas   asparaginowy   i   glutaminowy)   zawierające   dodatkową   jonizującą   grupę
karboksylową   oraz   aminokwasy   diaminowe   (arginina,   lizyna,   histydyna)   mające   dodatkowo
jonizującą grupę aminową , biorą udział w oddziaływaniach elektrostycznych.

-21-

W warunkach fizjologicznych łańcuch boczny wymienionych aminokwasów może być naładowany
ujemnie lub dodatnio. Ponadto aminokwasy z polarnym łańcuchem bocznym, ale nie posiadającym
ładunku, mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych w obrębie cząsteczki białka
(asparagina - amid kwasu asparaginowego oraz glutamina - amid kwasu glutaminowego).

3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

Reakcje   charakterystyczne   dla   aminokwasów   można   podzielić   na   dwa   typy.   Pierwsze   z   nich   to
reakcje wspólne dla wszystkich aminokwasów.  Wynikają  one z występowania  grup funkcyjnych:
karboksylowej i aminowej. Z kolei reakcje specyficzne dla poszczególnych  aminokwasów  wiążą się
z   występowaniem   charakterystycznego   układu   w   łańcuchu   bocznym   na   przykład   grupy
hydroksylowej  –OH   lub  sulfhydrylowej  –SH,   reszty fenylu   lub  fenolu,   bądź  układu  indolowego,
imidazolowego czy guanidynowego. Reakcje te pozwalają na odróżnienie niektórych aminokwasów.
Zależnie   od   charakteru   bocznego   łańcucha   poszczególne   aminokwasy   tworzą   różne   barwne
pochodne.

3.1.1. Miareczkowanie  glicyny metodą Sorensena
Zasada.Podczas miareczkowania aminokwasu , np.glicyny roztworem NaOH , z grupy aminowej



aminokwasu dysocjują jony H

. Wiążą się one z jonami OH

, tworząc słabo zdysocjowane

cząsteczki wody , zgodnie z równaniem:

COO





H + OH

→



H + H



R R

Odszczepienie protonów od wszystkich grup amoniowych



zachodzi dopiero przy wartościach

pH roztworu powyżej 12. Bark odpowiednich wskaźników alkacymetrycznych, które zmieniłyby
barwę w tym zakresie pH sprawia że uchwycenie końcowego punktu miareczkowania jest bardzo
trudne, a najczęściej nawet niemożliwe. Jeżeli podczas miareczkowania stosuje się fenoloftaleinę, to
zmiana barwy tego wskaźnika następuje wcześniej niż zostanie osiągnięty punkt równoważnikowy.
Zatem dla ilościowego oznaczenia aminokwasu (glicyny) grupa



musi być zablokowana.

-22-

W tym celu do roztworu aminokwasu dodaje się aldehyd mrówkowy (grupa



nie reaguje z

aldehydem) , co prowadzi do powstania połączenia N, N-dihydroksymetylowego danego aminokwasu
zgodnie z poniższą reakcją:

Wytworzenie takiej pochodnej aminokwasu powoduje, że uwolnione w warunkach doświadczenia
jony H

z grupy



, nie mogą być już wiązane z zablokowanymi grupami



COO

, natomiast

powodują   zakwaszenie   środowiska,   stąd   po   dodaniu   aldehydu   mrówkowego   znajdująca   się   w
roztworze fenoloftaleina  ulega odbarwieniu. Teraz aminokwas  zachowuje się jak słaby kwas, który
można już oznaczyć      przy użyciu NaOH w obecności fenoloftaleiny. Ilość grup karboksylowych
odpowiada ilości aminokwasu (glicyny)

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki::roztwór glicyny
0.2% roztwór fenoloftaleiny w etanolu
0,1M NaOH
aldehyd mrówkowy o pH 8,5

Do zlewki wlać 5 ml roztworu glicyny   dodać  2 krople fenoloftaleiny. Następnie z biurety dodawać
roztwór NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia . Oznacza to osiągnięcie  w roztworze
wartości pH wynoszącej około 8,3.  Wtedy dla  zablokowania grupy aminowej   dodać 5 ml 20%
roztworu   aldehydu   mrówkowego   o   pH   około   8,5.   Różowe  zabarwienie     roztworu   znika.
Dodawanie   NaOH     należy   kontynuować,   aż   do   ponownego  uzyskania   lekko   różowego
zabarwienia  miareczkowanego   roztworu.  Mnożąc   ilość   zużytego   NaOH   przez   równoważnik
glicyny (0,0075) można obliczyć ilość glicyny w roztworze.

3.1.2. Reakcja van Slyke’ a z kwasem azotowym (III)
Zasada: wolne

-aminokwasy zachowują się jak aminy I-rzędowe. Pod wpływem kwasu azotowego

(III) ulegają one dezaminacji, wydziela się wtedy wolny drobinowy azot, natomiast aminokwasy są
zamieniane w odpowiednie

-hydroksykwasy. Kwas azotowy (III), który jest czynnikiem

deaminującym, ze względu na jego nietrwałość otrzymujemy w reakcji z azotynem sodu , działając na
niego kwasem octowym:
NaNO

+ CH

COOH

→

HNO

+ CH

COONa

Otrzymany w ten sposób HNO

reaguje z aminokwasem , zgodnie z poniższym równaniem:

COOH COOH





H + HNO

→



H + H

O + N



R R

Wykonanie oznaczenia:
Odczynnik:i 10%NaNO

stężony CH

COOH

0,5mol/l glicyny

-23-

Do 1 ml roztworu glicyny dodać 1 ml NaNO

, a następnie 1 ml CH

COOH. Powstający w tej

reakcji HNO

nie ulega rozkładowi do tlenków, lecz reaguje z grupą aminową glicyny.

Obserwuje się wydzielenie pęcherzyków bezbarwnego , gazowego azotu.

3.1.3. Reakcja z ninhydryną
Zasada:Aminokwasy   pod   wpływem   ninhydryny   ulegają   utlenieniu   –   poprzez   iminokwasy   do
amoniaku,   dwutlenku   węgla   i   aldehydu   uboższego   o   1   atom   węgla.   W   wyniku   kondensacji   2
cząsteczek   ninhydryny:   zredukowanej   i   utlenionej   z   amoniakiem   powstaje   fioletowo   niebieskie
zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu

-amonowego aminokwasów.

Dodatni barwny odczyn ninhydrynowy dają oprócz aminokwasów, peptydów i białek , także sole
amonowe, aminocukry i amoniak. Oznaczana próba musi być wolna od tych związków.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 0,5 mol/l roztwór glicyny
0,1% roztwór ninhydryny

Do około 1 ml roztworu glicyny dodać 2 krople roztworu ninhydryny. Próbkę ogrzewać we wrzącej
łaźni wodnej przez około 3 minuty , pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.

3.1.4. Reakcja dla cysteiny (aminokwas siarkowy)
Zasada: ogrzewanie roztworu cysteiny w środowisku silnie zasadowym prowadzi do deaminacji , a
także powstania jonów siarczkowych. Podobnie reaguje cysteina zawarta w białku. Jony siarczkowe
reagują z octanem ołowiu (+2) . Powstaje wtedy czarny osad siarczku ołowiu (+2)

COOH COOH





H + 2 OH

→

O + NH

+ S

+ H





SH CH

Cysteina kwas pirogronowy

+ S

→

PbS

↓

czarny

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór cysteiny
30% NaOH
1 M Pb(CH

COO)

Do 1 ml roztworu cysteiny dodać 2 ml NaOH i ogrzewać około 15-20 minut we wrzącej łaźni
wodnej. Następnie dodać kilka kropel roztworu Pb(CH

COO)

i ponownie ogrzać powstaje

ciemnopopielaty roztwór z którego po około 10 minutach wytrąca się ciemny osad PbS.

-24-

3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych.
Zasada: Tyrozyna - aminokwas zawierający w łańcuchu bocznym pierścień aromatyczny podczas
ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym (V) ulega reakcji nitrowania, tworząc żółto zabarwioną
dinitrotyrozynę

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
HNO

NaOH stężony

Do 2 ml roztworu białka jaj kurzego dodać 2 ml HNO

i bardzo ostrożnie lekko podgrzać (2 min).

Uwaga ! reakcja silnie egzotermiczna. Roztwór zabarwia się na żółto. Po oziębieniu zawartość
probówki zalkalizować NaOH ( tzn. dodać 5- 10 kropli bardzo ostrożnie) powstaje
pomarańczowe zabarwienie.

3.1.6. Reakcje dla układu indolowego w tryptofanie.
Zasada: Związki zawierające układ indolowy, np. tryptofan lub białka zwierające ten aminokwas  w
roztworze stężonego kwasu np. siarkowego tworzą barwne produkty  kondensacji z aldehydami lub
ich pochodnymi. Reakcje te mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania tryptofanu zarówno
wolnego   jak   również   związanego   w   cząsteczce   białka.   Tryptofan,   kondensuje   z   kwasem
glioksalowym   (reakcja   Adamkiewicza   i   Hopkinsa)   oraz   aldehydem   mrówkowym  (reakcja
Voiseneta), tworzy  fiołkowo zabarwione produkty zgodnie z równaniem reakcji:

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
kwas glioksalowy
H

stężony

2.5% aldehyd mrówkowy
HCL stężony
0.05%NaNO

25-

1. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml kwasu glioksalowego, wymieszać i podwarstwić
stężonym H

( 1-2 ml), wlewając go bardzo ostrożnie!!! po ściance nachylonej probówki. Na

granicy zetknięcia obu warstw, tworzy się fiołkowy pierścień. Próbę należy wykonać pod
wyciągiem przy opuszczonej szybie!

2. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz
2 do 3 ml stężonego HCL. Zawartość probówki ostrożnie wymieszać i odstawić na 5 minut. Po
upływie tego czasu dodawać kroplami(5-10 kropel) ,0.05% roztwór NaNO

Odstawić na 20 minut.

Tworzy się zabarwienie fiołkowe.

3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie.
Zasada: Związki zawierające resztę guanidynową, w tym arginina i białka zawierające ten
aminokwas reagują z

-naftolem w środowisku zasadowym zawierającym bromian (I) Powstaje

wtedy pomarańczowo-czerwony barwnik. Reakcja ta jest bardzo czuła i może służyć do ilościowego
oznaczania argininy w białkach. Reakcji tej nie dają inne niskocząsteczkowe związki azotowe (np.
mocznik, kreatyna itp.) ponieważ w tej reakcji niezbędny jest odpowiedni układ , gdzie R jest grupa
alkilową:

N –C- R

॥

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
20% NaOH
2%

naftol

woda bromowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml NaOH i 2 do 3 kropli alkoholowego roztworu

naftolu i zawartość probówki dobrze wymieszać. Następnie dodać po kropli świeżo
przygotowanej wody bromowej ( w środowisku zasadowym powstaje bromian (I)) i ponownie
wymieszać . Tworzy się związek o pomarańczowo-czerwonym zabarwieniu.

-26-

4.BIAŁKA

Aminokwasy   połączone   wiązaniami   peptydowymi   tworzą   łańcuch   polipetydowy.   Wiązanie
peptydowe łączy grupę karboksylową jednego  aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu.
Powstanie dipeptydu  z dwu wolnych aminokwasów wiąże się z uwolnieniem jednej cząsteczki wody
zgodnie z  poniższą reakcją :

Równowaga   tej   reakcji   jest   znacznie   silniej   przesunięta     w   kierunku   hydrolizy   niż   w   kierunku
syntezy. W związku z tym biosynteza wiązań peptydowych wymaga dostarczenia energii swobodnej,
natomiast   hydroliza   wiązań   jest   termodynamicznie   korzystna.   Wiele   aminokwasów   połączonych
wiązaniami   peptydowymi   tworzy   liniową   strukturę   łańcucha   polipeptydowego.   W   łańcuchu
polipeptydowym możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce – z
jednej   strony   grupą   aminowa,   a   z   drugiej   grupę   karboksylową   .   Jako   początek   łańcucha
polipeptydowego   umownie   przyjęto   jego   koniec   aminowy   czyli   koniec  N    i   dlatego   sekwencje
aminokwasowe łańcucha polipeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną
(końcową) grupa

-aminową np:

Łańcuch   polipeptydowy   jest   złożony    z   powtarzających   się   regularnie   fragmentów   ,   tworzących
łańcuch główny oraz fragmentów zmiennych – charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych
aminokwasów. Większość naturalnych łańcuchów polipeptydowych – białek - zawiera od 50 – 2000
reszt aminokwasowych.
Omawiając   budowę   białek   często     wymienia   się   cztery   poziomy   ich   struktury.  Struktura
pierwszorzędowa  określa  po prostu sekwencję  aminokwasów.  Struktura  drugorzędowa  opisuje
wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej
Przykładem struktury drugorzędowej jest helisa

lub nić

. Struktura trzeciorzędowa odnosi się do

powiązań   przestrzennych   i   wzajemnego   ułożenia   reszt   aminokwasowych   oddalonych   od   siebie
sekwencji  liniowej  oraz  lokalizacji   mostków   dwusiarczkowych.     W  białkach składających   się     z
więcej niż jednego   łańcucha   polipeptydowego , można określić jeszcze jeden poziom organizacji
struktury. Każdy z tych łańcuchów nazywa się   w   takim przypadku podjednostką danego białka.
Struktura   czwartorzędowa    opisuje   wzajemne   ułożenie   przestrzenne   podjednostek   i   rodzaj   ich
kontaktu.

-27-

Badania konformacji, funkcji i ewolucji białek doprowadziły do wyróżnienia jeszcze dwu

tetrapeptyd

Końcowa reszta
aminowa
koniec N

Końcowa reszta
karboksylowa
koniec C

dodatkowych, ważnych poziomów ich organizacji. Naddrugorzędowa struktura odnosi się do
zespołów struktur drugorzędowych. W wielu białkach na przykład nić

jest oddzielona od drugiej

nici

helisą

, taki motyw nazywa się jednostką

βαβ

. .Niektóre łańcuchy polipeptydowi fałdują się,

tworząc dwa lub więcej ściśle zwiniętych rejonów. Te ściśle zwinięta jednostki globularne , nazywane
domenami, złożone są ze 100 do 400 reszt aminokwasowych.

4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek

4.1.1 Wykazanie amfoterycznego charakteru białek
Białka     są   polielektrolitami   zawierającymi   rozmaite   grupy   funkcyjne   w   bocznym   łańcuchu
aminokwasów. Niektóre z nich łatwo ulegają dysocjacji w roztworach wodnych.  Jony wodorowe
znajdujące się w roztworze mogą zmieniać jonizację tych grup i stąd całkowity ładunek cząsteczki
zależy od pH środowiska. Przy określonej wartości pH roztworu w wyniku jonizacji w cząsteczce
białka   powstaje   tyle   samo   ładunków   dodatnich   co   ujemnych,   czyli   białko   osiąga  punkt
izoelektryczny, który  podobnie jak w przypadku aminokwasów oznacza się  symbolem pI. W tych
warunkach   suma   ładunków   elektrycznych   danego   białka   jest   równa   zeru.   Białka   mają   charakter
amfoteryczny, wynikający przede wszystkim z występowania wolnych grup karboksylowych



COO

(kwasu asparaginowego, i glutaminowego oraz C-końcowej grupy cząsteczki) i amoniowej



( lizyny i argininy oraz N-końcowej grupy cząsteczki). W roztworach o pH powyżej wartości  pI
(punktu izoelektryczego) białko występuje w postaci anionu. Zachowuje się wtedy jak kwas, czyli
oddaje   jony   wodorowe.   Zaś   w   roztworach   o   pH   poniżej   punktu  pI  białko   występuje   w   postaci
kationu.   Zachowuje   się   wtedy   jak   zasada,   czyli   przyłącza   jony     wodorowe.   Wynika   z   tego   ,że
cząsteczka białka w pierwszym przypadku staje się silnie zdysocjowany zasadą polianionową podczas
gdy w drugim przypadku staje się coraz silniej zdysocjowanym kwasem polikationowym

4.1.2 Zachowanie się białek w obecności kwasów

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : 0,5% roztwór żelatyny
0,01mol/l HCL
zieleń bromokrezolowa

Przygotować dwie probówki. Do jednej nalać 2 ml wody destylowanej, a do drugiej 2 ml 0,5%
żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople zieleni bromokrezolowej i kroplami z pipety roztwór
HCL, aż do otrzymania barwy żółtej (pH około 3). Porównać ilość zużytego kwasu do otrzymania
barwy w wodzie destylowanej i w roztworze żelatyny.

4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasad

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: : 0,5% roztwór żelatyny
0,01mol/l NaOH
błękit tymolowy

Do 2 probówek nalać kolejno: do pierwszej 2 ml wody destylowanej a do drugiej 2 ml 0,5%
żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople błękitu tymolowego i miareczkować z pipety
roztworem NaOH aż do uzyskania barwy niebieskiej . Porównać ilość kropli zużytej zasady przy
miareczkowaniu wody i żelatyny.

4.2 Białka jako koloidy

Układy koloidalne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Wszystkie komórki są zespołami
mniej lub bardziej różnorodnych układów koloidowych. W przyrodzie ożywionej zasadniczą rolę
odgrywają ciekłe roztwory koloidowe – zole, których fazą dyspresyjną jest woda. Trwałość takich
roztworów zależy od wielu czynników np. ładunku elektrycznego cząsteczek rozproszonych, stopnia
uwodnienia i temperatury.

-28-

Ze   względu   na   jakość   fazy   rozproszonej   można   wyróżnić   następujące   typy   układów
koloidowych:
A.roztwory wielkocząsteczkowych biopolimerów - białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów
(faza rozproszona skład się z cząsteczek o rozmiarach 5-100 nm)
B.roztwory  micelarne, których typowymi przedstawicielami są roztwory mydeł i detergentów
C. roztwory  substancji  nie polarnych , które nie wykazują powinowactwa do wody
Pierwsze  dwa  typy  układów  koloidowych  zalicza  się  do  hydrofilowych  (liofilowych)   a  trzeci  do
hydrofobowych (liofobowych). Koloidy hydrofilowe nazywa  się także emulsoidami lub koloidami
odwracalnymi. Koloidy hydrofobowe   natomiast – suspensoidami koloidami nieodwracalnymi  lub
zawiesiną   koloidową.   Te   dwa   typy   układów   koloidowych   różnią   się   znacznie   cechami
fizykochemicznymi.
Roztwory koloidów  hydrofilowych, zależnie od temperatury i stężenia, mogą występować w formie
ciekłej –jako zole lub w formie elastycznego ciała stałego – jako żele.  Przechodzenie zolu w żel
nazywa się żelatynowaniem (żelowaniem) i jest procesem odwracalnym

+ H

O + H

(pęcznienie) podniesienie temp.
Koloid suchy

←→

żel

←→

zol

(osuszenie) obniżenie temp.

−

O (osuszenie)

−

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: żelatyna (subst.)
skrobia (subst.)

1.Do 2 probówek odważyć  : do pierwszej 0,5 g skrobi  a do drugiej 0,5 g żelatyny . Dodać 1ml wody
i po bardzo dokładnym wymieszaniu pozostawić na 30 minut w celu napęcznienia. Następnie dodać
po 5 ml wody , wymieszać dokładnie do otrzymania jednorodnego roztworu a następnie wstawić
do wrzącej łaźni wodnej.  Wyjąć  po około 5 minutach   ostudzić  pod zimną wodą lub w lodzie.
Otrzymuje się  żele. Jeżeli ponownie wstawimy je do wrzącej łaźni wodnej  otrzymamy zole .

2. Skrobię i żelatynę w oddzielnych probówkach zalać 5 ml wrzącej wodą bez uprzedniego
napęcznienia. Zwrócić uwagą na różnicę w rozpuszczaniu się koloidu napęczniałego i suchego.

4.3 Denaturacja białek
Terminem tym obejmuje się zmiany w konformacji łańcucha polipetydowego, wskutek których białko
traci właściwości. Denaturacja występuje wówczas, kiedy pod wpływem czynników fizycznych lub
chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędowa. Czynniki denaturujące działają na
wiązania które stabilizują przestrzenną strukturę białek.
Do wiązań tych należy zaliczyć przede wszystkim wiązania wodorowe tworzące się między grupami

CO i

NH wiązań peptydowych (w tym samych lub różnych łańcuchach polipeptydowych), a

także między grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, takimi jak :

−

COOH,

−

OH,

−

, i

−

. W utrzymaniu konformacji cząsteczki białka współdziałają również wiązania jonowe, powstające
między grupami

−

COO

i NH

, a także oddziaływania hydrofobowe między aminokwasami

niepolarnymi.   Ważnym   czynnikiem   stabilizującym   konformację     łańcuchów   polipeptydowych   są
kowalencyjne  wiązania   disiarczkowe,   tworzące   się   między   resztami   cysteiny   tego   samego   lub
różnych   łańcuchów   polipeptydowych.   Istotną   rolę   odgrywają   ponadto   metale   łączące   ze   sobą
łańcuchy boczne aminokwasów wiązaniami koordynacyjnymi.
W   wyniku   rozerwania   wiązań   stabilizujących   strukturę   białka   uwolnione   grupy  funkcyjne   mogą
wytwarzać   inne   wiązania,   które   zmieniają   konfigurację   cząsteczki.   Taka   nowa,   zdeformowana
cząsteczka odznacza się zawsze zmianą, oraz utratą właściwości biologicznych  (enzymatycznych,
antygenowych, hormonalnych).

-29-

Denaturację   białka   wywołują   niektóre   czynniki   fizyczne   takie   jak:   ogrzewanie,   wysychanie,
ultradźwięki, promieniowanie  krótkofalowe. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady ,
jony  metali ciężkich, mocznik , detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą
jak : alkohol, aceton.

4.3.1.Denaturacja cieplna
Zasada: Ciepło powodując zrywanie wiązań wodorowych w  cząsteczce, prowadzi do nieodwracalnej
denaturacji   białek.   Proces   denaturacji   cieplnej   rozpoczyna   się   dla   różnych   białek   w   różnych
temperaturach   (między   40  a   100

C ). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie (np.

żelatyna , rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka
NaCL (in substancja) MgSO

Około 2 ml roztworu białka jaja kurzego zagotować do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty
osad wytrąconego białka. Osad staje się wyraźniejszy po dodaniu niewielkiej ilości NaCL lub
MgSO

4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu.
Zasada: Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton), dezorganizując warstwę wodną otaczającą
cząsteczki białek i osłabiając oddziaływania hydrofobowe, powodują wytrącenie białek. W temp.
poniżej 0

C nie denaturują białek. Działania takie ujawniają się w większych stężeniach i w wyższej

temperaturze (20-30

Wykonanie oznaczenia
odczynniki: roztwór białka
95% alkohol etylowy

Do 1ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml alkoholu etylowego. Po 10 minutach dodać 2 ml
wody . Strąt nie rozpuszcza się.

4.3.3.Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego

Wykonanie oznaczenia.:

Odczynniki: roztwór białka
stężony H

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać bardzo ostrożnie ! 3-5 kropel stężonego kwasu
siarkowego. Kwas ten mimo denaturacji nie wytrąca białka z roztworu.

4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów (sole metali ciężkich)
Zasada: jeśli wartość pH jest większa od pI (punktu izoelektrycznego) , cząsteczki białka stają się
anionami  i  mogą  reagować  z kationami.   Powstające  sole    zależnie  od rodzaju jonu  dysocjują   w
różnym stopniu. Kationy metali alkalicznych  dają sole bardzo dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w
wodzie , natomiast  kationy metali  ciężkich ( Fe

, Cu

2+,

, Pb

) tworzą sole o bardzo małej

dysocjacji i trudno rozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :roztwór białka
1% FeCL

1% CuSO

1.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli 1% roztworu FeCL

. Roztwór barwi się na

kolor brudnopomarańczowy. Po pewnym czasie wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego.

2.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu CuSO

. Powstaje jasnobłękitny

osad białczanu miedziowego.

-30-

4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów
Zasada: Po stronie kwasowej punktu izoelektrycznego cząsteczki białka maja ładunek dodatni oraz
zdolność reagowania z anionami. Niektóre kwasy organiczne dają trwałe, nierozpuszczalne
połączenia z białkami i są stosowane jako odczynniki odbiałczające płyny biologiczne. Związki te w
większych stężeniach powodują denaturację białka Podobnie stężone roztwory kwasów
nieorganicznych (HCL, H

) denaturują białko.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka
60% CCL

COOH

Do 1 ml roztworu białka kurzego dodać kilka kropel kwasu trichlorooctowego, wytrąca się białko w
postaci białego osadu.
4.4.Reakcje barwne białek

4.4.1 Reakcja biuretowa – wykrywanie białek
Zasada: reakcję biuretową dają białka oraz peptydy mające więcej niż dwa wiązania peptydowe. W
środowisku zasadowym układy wiązań peptydowych dają z jonami miedzi (+2)
barwne kompleksy. Aby reakcja przebiegała prawidłowo kationy Cu

muszą być związane w postaci

kompleksu , co chroni je przed wytrąceniem w postaci wodorotlenku miedzi. Wiązania peptydowe w
środowisku zasadowym ulegają enolizacji zgodnie z równaniem:

Białko lub peptyd , w którym wiązania peptydowe uległy enolizacji, reagują z jonami Cu     , dając
kompleks   barwy   niebiesko-fioletowej.   Nasilenie   barwy   kompleksu   zależy   od   ilości   wiązań
peptydowych   i   budowy   łańcucha   peptydowego,   a   więc   intensywność   barwy   roztworu   jest
proporcjonalna do stężenia białka. W przypadku peptydów o niezbyt długich łańcuchach powstaje
kompleks barwy czerwono-fioletowej

-31-

Tetrapeptyd – forma ketonowa

Tetrapeptyd – forma enolowa

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
10% NaOH
1% CuSO

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 10% NaOH, a następnie dodać parę kropel roztworu
CuSO

. Roztwór barwi się na niebiesko-fioletowo.

4.4.2 Reakcja Libermana
Zasada:  Reakcja ta wykazuje w białku obecność grupy węglowodanowej, a więc dają ją wszystkie
glikoproteidy.  W obecności HCL część węglowodanowa  cząsteczki białka przechodzi w furfural,
który  z fenolami wytworzonymi na skutek równoczesnej hydrolizy białka daje zabarwienie fiołkowe.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
HCL stężony

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 3 ml stężonego HCL (ostrożnie!) i ogrzewać
przez 5 minut w łaźni wodnej . Roztwór barwi się na kolor fiołkowy.
Białka dają ponadto reakcje barwne charakterystyczne dla zawartych w nich aminokwasów.

4.5.Oczyszczanie białek metodą dializy

Do zbadania struktury , a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą
być   wyizolowane   z   materiału   biologicznego,   a   następnie   poddane   procedurze   systematycznego
oczyszczania.   W   odróżnieniu   od   związków   niskocząseteczkowych,   białka   nie   przechodzą     przez
błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego
do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka nadmiaru soli
(odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do tego celu stosuje się dializę która
oparta jest na procesie dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego stężenia
substancji rozpuszczonej do niższego i prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości  roztworu
bez nakładu energii. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę
półprzepuszczalną   taką   jak   błona   celulozowa.   Cząsteczki   o   wymiarach     znacznie   większych   niż
średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym natomiast jony  i mniejsze cząsteczki  przechodzą
przez pory błony i pojawiają się dializacie na zewnątrz  woreczka.

-32-

W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych
niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także
stosuje się mieszanie.

Odczynniki:
mleko z dodatkiem NaCL ( 100 mg/25 ml mleka ) i glukozy (100 mg/25 ml mleka) = roztwór
przeznaczony do dializy (A)
10% NaOH
1%CuSO

10%

-naftol

stężony H

Fehling I
Fehling II
20 mmol/l AgNO

woreczek do dializy

Wykonanie oznaczenia:

•

1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu
przeddializacyjnego (A).

•

2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec.

•

3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej

•

4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi
koniec sznurkiem

•

5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną .

•

6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym.

•

7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu
przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1 godz.
Każdorazowo, do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu
przeprowadzenia analizy

•

8. Po upływie 1 godz. wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do
erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy
tego płynu.

Analiza  roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C)
  - sprawdzenie obecności białka (1)metodą biuretową ,(2) potwierdzenie występowania cukru
(glukoza   i   laktoza)   reakcją   Molischa,   (3)potwierdzenie   występowania   cukru   redukującego
rekacją  Fehlinga, (4)wykazanie występowania jonów chlorkowych.

1. Sprawdzenie obecności białka.
Reakcja biuretowa
do 1 ml roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) dodać 1 ml
10% NaOH oraz 3 krople 1% CuSO

W obecności białka roztwór barwi się na kolor fioletowy.

2. Sprawdzenie obecności cukru.
Reakcja Molischa
Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 2 krople

-naftolu. Po dokładnym zamieszaniu ostrożnie po

ściance probówki wlać 1 ml stężonego H

tak aby widoczna była granica między cieczami. W

miejscu zetknięcia się obu warstw powstaje czerwono-fioletowy pierścień w przypadku obecności
cukru.

3. Potwierdzenie  występowania cukrowca redukującego
Reakcja Fehlinga.
Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II. Zawartość probówek
dobrze wymieszać i ogrzać  we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut  W przypadku obecności cukru
redukującego powstaje pomarańczowy osad tlenku miedzi (I).

-33-

4. Potwierdzenie występowanie jonów chlorkowych.
Do 1ml roztworu A, B i C dodać 1 ml roztworu AgNO

. Wytrąca się osad chlorku srebra w

przypadku występowania jonów chlorkowych w badanych roztworach.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenie: porównać jak zmienia się zawartość
składników (białka, cukru, jonów chlorkowych roztworze przeznaczonym do dializy (A),
dializacyjnym (B) i dializowanym (C).

4.6. Kolorymetria

Kolorymetria  jest   działem   analizy   chemicznej,   w   którym   podstawą   ilościowego   oznaczania
substancji w roztworze stanowi prosta  zależność między intensywnością zabarwiania  roztworu
(absorpcja   światła   o   określonej   długości   fali   -

), a stężeniem zawartej w nim substancji.

Metodami kolorymetrycznymi można oznaczyć zarówno stężenia substancji mających własną barwę
jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych przeprowadza się
w   związki   barwne   .   W   tym   przypadku   reakcja   barwna   musi   przebiegać   do   końca,   a   powstałe
zabarwienie musi być  dostatecznie trwałe, niewrażliwe na działanie światła, mało zależne od pH,
temperatury, nadmiaru odczynnika
Metody kolorymetryczne   mają zastosowane tylko do oznaczenia ilościowego substancji dających
barwne połączenia, które pochłaniają światło o długości fali światła widzialnego , czyli w zakresie
długości od 360 do 770 nm.
W odróżnieniu od metod kolorymetrycznych  spektrofotometria pozwala na oznaczenie  stężenia
związków pochłaniających  światło nadfioletowe  (tzn. o długości   fali  od 220   do   360  nm ) oraz
podczerwone (tzn. o długości fali ponad 770 nm)
Tym     niemniej     metody   kolorymetryczne   należą   do   najszybszych   i   najłatwiejszych   technik
analitycznych. Odznaczają się one uniwersalnością , dokładnością i czułością przewyższającą   pod
tym względem  inne metody.
Zasady kolorymetrii
Barwa substancji zależy od aktywnego pochłaniania, czyli absorpcji światła przez tę substancję. W
czasie obserwacji światła przechodzącego przez daną substancję do oczu dochodzą promienie, które
nie   zostały   przez   nią   zaabsorbowane.   Widzi   się   więc   barwę   dopełniającą,   na   którą   składają   się
poszczególne   rodzaje   przepuszczonych   fal   elektromagnetycznych.   Na   przykład   barwa   niebieska
roztworu oznacza, że dana substancja pochłania światło żółte, przepuszczając te długości fal, które
tworzą   widzianą   przez   nas   barwę   dopełniającą   tj.,   niebieską,   roztwór   zabarwiony   na   czerwono
pochłania światło niebiesko- zielone, roztwór zabarwiony na żółto światło niebiesko-fioletowe.

Istnieje ścisły związek między zabarwieniem substancji a jej strukturą elektronową. Cząsteczka  (lub
jon)   wykazuje   absorpcję   w   części   widzialnej   widma   lub   w   nadfiolecie,   gdy   pod   wpływem
promieniowania elektrony   jej zostają przeniesione ze stanu podstawowego do jednego ze stanów
wzbudzonych.

-34-

Powstanie barwy  lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej elektronowej struktury
cząsteczki.   Zmiany   energii   elektronowej   pod   wpływem   naświetlania   występują   w   cząsteczkach
zawierających  grupy chromatoforowe,  ugrupowania z wielokrotnymi  wiązaniami nienasyconymi,
np.

Wzrost intensywności zabarwienia cząsteczki powoduje obecność tzw. grup auksochromowych, np.



OH,



SH,



Cl,



Br, pierścień fenylowy czy naftylowy.

Ilość   światła  pochłoniętego  po  przejściu  przez   barwny  roztwór   zależy   od   grubości   warstwy
barwnego   roztworu.  Zależność   tą   ujmuje  prawo  Lamberta.  Zgodnie   z   tym   prawem  logarytm
stosunku   natężenia   światła   padającego   do   natężenia   światła   przechodzącego   jest   wprost
proporcjonalny do grubości warstwy.
              I

Log



= k • d

I
I

- natężenie światła padającego

I    -   natężenie światła po przejściu przez barwny roztwór
k   -   współczynnik proporcjonalności
d   -   grubość warstwy barwnego roztworu przez który przechodzi światło (cm)

Ilość światła pochłoniętego zależy również od stężenia substancji barwnej, zależność tą podaje
prawo Beera. Zgodnie z tym prawem logarytm ze stosunku natężenia światła padającego do
natężenia światła przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia barwnej
substancji.

Log



= k • c

gdzie : I

Log —— - absorbancja = A
I
k - stała charakterystyczna dla danego ośrodka optycznego
c – stężenie substancji barwnej

Łącząc wzór określający prawo Lamberta z wzorem określającym prawo Beera otrzymuje się
nowe wyrażenie , ujmując matematycznie zależność pomiędzy gęstością optyczną a stężeniem
substancji i grubością warstwy roztworu

A = k • c • d

Absorbancja (A) jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór. Innym określeniem
absornbancji jest gęstość optyczna lub ekstynkcja

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia i
grubością warstwy barwnego roztworu.

Uzyskiwane wartości absorbancji powinny się znajdować w przedziale 0,1 -1,0 a najdokładniejsze
wyniki otrzymuje się przy wartościach od 0,2 – 0,6. Ponieważ na wartość absorbancji ma wpływ
grubość warstwy roztworu, należy oznaczenia przeprowadzać w kuwetach o takiej grubości warstwy,
która umożliwiłaby uzyskanie wartości absorbancji w optymalnych warunkach.

-35-

3.6.1.Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry’ego
Zasada:metoda Lowry opiera się na reakcji jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne
z odczynnikiem Folina Ciocaltou:
I etap

→

przyłączenie jonów miedzi (odczynnik Lowry C) do wiązań peptydowych

II etap

→

redukcja kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenianowego do odpowiednich

tlenków przez miedź związaną z białkiem, reakcja między odczynnikiem fenolowym, a tyrozyną i
tryptofanem
Metoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1

g/ml. Jest powszechnie stosowana do

oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych.

Odczynniki: Standard – krystaliczna albumina wołowa BSA o stężeniu: 50

g/ml

  Lowry A 50 ml
Lowry B 1 ml
  Lowry C = 50 ml Lowry A + 1 ml Lowry B
Odczynnik Folina Ciocaltou

rozcieńczenie surowicy: 0,1 ml surowicy + 9,9 ml Lowry C

lub 0,05 ml surowicy + 4,95 ml Lowry C

Po inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (A) wobec próby odczynnikowej ”0”
przy fali o dł.

= 660 nm w kuwecie o grubości warstwy d = 1cm

Obliczenie stężenia białka:

(A) Absorbancja próby badanej
x 0.05 x 100 = (.x.) g/100ml
(A) Absorbancja standardu

Stężenie białka całkowitego w surowicy

Gatunek zwierząt

Wartości
g/100ml

Konie
Bydło
Owce
Kozy
Świnie
Psy
Koty
Króliki

6,0 -  7,8
5,1 -  7,1
6,5 -  7,0
5,9 – 7,8
5,9 -  7,4
5,5 – 7,0
6,0 –  8,0
6,0 –  8,3

-36-

5.KWASY NUKLEINOWE

Organizmy żywe mogą istnieć wyłącznie wtedy, gdy są zdolne przekazać swą informację genetyczną
organizmom potomnym . Podstawę tej informacji genetycznej stanowi kwas dezoksyrybonukleinowy
DNA

→

RNA

→

białka

→

komórka

→

organizm

Poniższy schemat przedstawia schemat przepływu informacji genetycznej

Synteza potomnej cząsteczki DNA to replikacja ( etap u na schemacie),przekazanie informacji  z
DNA  na RNA – transkrypcja ( etap v ) , a z  RNA dla syntezy białka – translacja Translacja
jest   związana   z   przetłumaczeniem   informacji   zapisanej   w   sekwencji   nukleotydów   na„język
aminokwasów.Istnieje możliwość przekazania informacji z RNA na DNA tj. odwrotna transkrypcja
(etap x)
DNA jest polimerem zbudowanym z jednostek monomerycznych – deoksyrybonukleotydów . Każdy
nukleotyd składa się z  zasady azotowej, cukru oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych. Cukrem
występującym w deoksyrybonukleotydach jest deoksyryboza.

Zasady azotowe to : pochodne puryny lub pirymidyny. Zasadami purynowymi w DNA są adenina
(A) i guanina (G), a pirymidynowymi – tymina (T) i cytozyna (C).

Związek   zasady   purynowej   lub   pirymidynowej   z   cukrem   nazywamy  nukleozydem.   W   DNA
występuje   4   rodzaje   nukleozydów:   deoksyadenozyna,   deoksyguanozyna,   deoksytymidyna   i
deoksycytydyna. W deoksyrybonukleotydach N-9 zasady purynowej lub N-1 zasady pirymidynowej
jest związany z
C-1 deoksyrybozy wiązaniem N-glikozydowym. Ester nukleozydu i kwasu fosforowego nazywamy
nukleotydem . Najczęstszym miejscem estryfikacji w nukleotydach występujących w przyrodzie jest
grupa hydroksylowa  związana z  C-5  cukru. Tego rodzaju związek jest nazywany nukleozydo-5

’

fosforanem lub 5

’

- nukleotydem. ( Cyfra ze znaczkiem prim

‘

określa atom w cząsteczce cukru).

-37-

Rdzeń DNA jest niezmienny, wzdłuż całej cząsteczki i składa się z reszt deoksyrybozy połączonych
resztami fosforanowymi. Grupa 3

’

-hydroksylowa reszt cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest

połączona z grupą 5

’

- hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.

Komórkowy DNA składa się z dwóch bardzo długich łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych
wokół jednej wspólnej osi. Każda z dwóch nici helisy jest zorientowana w przeciwnym kierunku. Na
zewnątrz   dwuniciowej   helisy  znajdują   się   rdzenie   cukrowo-fosforanowe   każdego    z  łańcuchów   ,
podczas gdy zasady purynowe i pirymidynowe  są skierowane do wnętrza helisy. Obydwa łańcuchy
są   połączone   wiązaniami   wodorowymi   między  zasadami   tworzącymi   pary.  Adenina   (A)   zawsze
tworzy parę z tyminą (T),  a  guanina (G) jest zawsze sparowana z cytozyną (C),  dzięki czemu
jeden łańcuch helisy jest zawsze komplementarny do drugiego. Informacje genetyczną koduje ściśle
określona sekwencja zasad w każdym z łańcuchów. Wiele cząsteczek DNA tworzy formy koliste.
Podczas   replikacji   obydwa   łańcuchy   helisy   DNA   ulegają   rozpleceniu   i   rozdzielają   się   w   miarę
postępu   syntezy     nowych   łańcuchów.  Każdy   łańcuch   rodzicielski   stanowi   matrycę  dla   nowo
powstającego   łańcuchu   komplementarnego.  Tak   więc   replikacja   DNA   jest   procesem
semikonserwtywnym   –   każda   potomna  cząsteczka   uzyskuje   jeden   łańcuch   z   rodzicielskiej
czasteczki DNA i drugi nowo syntetyzowany. Aktywnymi prekursorami w syntezie DNA są cztery 5

’

–trifosforany deoksyrybonukleozydów. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku 5

’

→

’

DNA   nie   jest   jednak   bezpośrednio   matrycą   do   syntezy   białek;   funkcje   takie   pełnią   natomiast
cząsteczki RNA  – kwasu rybonukleinowego.  RNA jest długą nierozgałęzioną  makrocząsteczką
złożoną z nukleotydów  połączonych  wiązaniami  fosfodiestrowymi 3

’

→

’

. Jednostką cukrową

w RNA jest ryboza. Głównymi zasadami w RNA są : adeina (A)
uracyl, (U) guanina (G) oraz cytozyna (C). Adenina może tworzyć parę z uracylem , a guanina z
cytozyną

Funkcję pośredników przenoszących informację w procesie biosyntezy białka pełni klasa cząsteczek
RNA nazywanych informacyjnymi RNA (mRNA). Inne cząsteczki RNA, jak transportujący RNA
(tRNA) i rybosomowy RNA (rRNA) stanowią część mechanizmu syntezy białka . Wszystkie
rodzaje komórkowych RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA zgodnie z instrukcjami
przekazywanymi przez matrycę DNA.

5.1.Badanie właściwości kwasów nukleinowych

5.1.1 Hydroliza kwasów nukleinowych, badanie produktów hydrolizy.
Zasada

: w czasie ogrzewania z kwasami, kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie rozpadając się na

zasady purynowe i pirymidynowe, kwas fosforowy i pentozę. Przez łagodną hydrolizę,
przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych,
mianowicie nukleotydy i nukleozydy.

-38-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: nukleinian sodu
2 M H

2 M NaOH

Do 2 ml nukleinianu sodu dodać 5 ml 2M

i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut.

Hydrolizat zobojętnić 10% NaOH wobec papierka lakmusowego.

↓

Następne reakcje wykonujemy na otrzymanym hydrolizacie kwasów nukleinowych !!!

1. Wykrywanie cukrów - reakcja Molischa

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

10% alkoholowy roztwór

- naftolu

stężony

Do około 1 ml hydrolizatu dodać 2 krople 10% alkoholowego roztworu

-naftolu i wymieszać.

Następnie ostrożnie !, po ściankach probówki dodać około 1 ml stężonego H

aby powstały dwie,

dobrze odgraniczone warstwy. Powstaje fioletowo-czerwony pierścień.

2. Próba Biala z orcyną na pentozy

Zasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną
kompleks o barwie zielonej
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat
0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
1% FeCl

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl

i 0,5 ml roztworu hydrolizatu

Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone
zabarwienie. przeprowadzić

3. Wykrywanie zasad purynowych:
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 5%NH

5% AgNO

Do probówki wlać około 1 ml hydrolizatu, a następnie zalkalizować go 5% NH

OH. Roztwór

przesączyć po czym przenieść go do zlewki i zalać 1 ml AgNO

. W obecności zasad

purynowych powstaje brązowy osad

4. Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

HNO

stężony

roztwór molibdenianu amonu

Do 0,5 ml hydrolizatu dodać amoniaku, aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić
stężonym HNO

i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia, pojawia się żółty osad

fosforomolibdenianu amonu.

-40-

6.LIPIDY

Lipidy występują w  komórkach wszystkich organizmów żywych. W organizmach zwierząt są one
obecne w większej ilości w różnych komórkach  narządach lub w postaci wyodrębnionej tkanki
tłuszczowej. Obecność lipidów w pożywieniu jest niezbędna . Pełnią one zarówno funkcje
energetyczne jak i strukturalne. Są one ponadto źródłem i nośnikiem wielu substancji biologicznie
czynnych i witamin. Lipidy (tłuszcze) występujące w przyrodzie dzieli się na proste (tłuszcze
właściwe, woski) i złożone (fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy) oraz prekursory  i pochodne
lipidów (kwasy tłuszczowe, glicerol , sfingozyna).

Lipidy proste (tłuszcze właściwe)  są estrami glicerolu i wyższych jednokarboksylowych  kwasów
tłuszczowych.   Glicerol   może   tworzyć   wiązanie   estrowe   z   jedną   ,   dwiema,   lub   trzema   resztami
kwasów   tłuszczowych.   Powstające   w   ten   sposób   związki   noszą   nazwę   monoacylo-,diacylo-,lub
triacylogliceroli:

Kwasy tłuszczowe występujące w lipidach nadają im   odpowiedni charakter fizykochemiczny.  Im
większa masa cząsteczkowa kwasów tłuszczowych , tym wyższa jest temperatura topnienia lipidów.
Temperatura   ta   będąca   jakościowym   wyrazem   stosunku   kwasów   tłuszczowych   nasyconych   do
nienasyconych w lipidach maleje wraz ze wzrostem procentowego udziału kwasów nienasyconych.
Lipidy o dużej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych są zazwyczaj ciekłe i oleiste.

Niektóre kwasy tłuszczowe występujące w organizmach zwierzęcych

Liczba

atomów

węgla

Liczba

wiązań

podwój-

nych

Nazwa

potoczna

Wzór

kwas laurynowy

kwa mirystynowy

kwas palmitynowy

kwas stearynowy

kwas arachidowy

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

kwas palmitooleinowy

kwas oleinowy

kwas linolowy

kwas linolenowy

kwas arachidonowy

(CH

)

CH=CH(CH

)

COO

(CH

)

CH=CH(CH

)

COO

(CH

)

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

(CH

)

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

monoacyloglicerol diacyloglicerol triacyloglicerol

-41-

Woski to estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol .Spełniają w przyrodzie
rolę   ochronną   alkohole   i   kwasy   tłuszczowe   wosków   są   związkami   nasyconymi   o   dłuższych
łańcuchach węglowych (od 26 do 42) niż kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach właściwych.
Lipidy złożone to materiał budulcowy wszystkich komórek, głównie błon plazmatycznych, a także
osłon włókien nerwowych. Występują szczególnie obficie w tkance nerwowej , krwi, limfie, wątrobie
żółtku jaj. Łączą je podobne właściwości fizykochemiczne i biologiczne.

I.   Fosfolipidy  –   składnikiem   alkoholowym   jest   glicerol   którego   dwie   grupy   hydroksylowe
zestryfikowane   są   kwasami   tłuszczowymi   nasyconymi   i   nienasyconymi   a   trzecia   kwasem
fosforowym. Przedstawicielami  są lecytyny  oraz kefaliny.

II. Sfingolipidy różnią się pod względem budowy od innych lipidów. Zamiast glicerolu występuje w
nienienasycony 18-węglowy aminoalkohol sfingozyna (np. ceramidy, sfingomieliny)

III. Glikolipidy występują we wszystkich tkankach na zewnętrznej stronie błony komórkowej. W
ich skład wchodzą sfingozyna, kwas tłuszczowy i reszta oligosacharydowa (cerebrozydy,
gangliozydy)

6.1.Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych

6.1.1. Rozpuszczalność lipidów
Zasada:  Lipidy-   tłuszcze   są   nierozpuszczalne   w   wodzie   ,   natomiast   rozpuszczają   się   w
rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform, aceton, gorący alkohol. Przy wytrąceniu
lipidów wodą powstaje emulsja, czyli zawiesina kuleczek tłuszczu, które szybko łączą się ze sobą tak,
że powstaje wyraźna granica między dolną fazą wodną  i górną fazą tłuszczową. Zawiesinę tłuszczu
w  wodzie można utrwalić przez  dodanie substancji absorbujących się na granicy obu faz. Substancje
takie, zwane emulgatorami, obniżają napięcie powierzchniowe i powodują rozdrobnienie cząsteczek
tłuszczu zawieszonych w wodzie. Działanie emulgujące posiadają białka, sole kwasów żółciowych
oraz mydła.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
alkohol
aceton
chloroform
woda

Do dwóch probówek wlać po 1 ml wody, jedną pozostawić zimną, drugą podgrzać nad palnikiem,
Do kolejnych probówek wlać w takiej samej ilości (tzn. po 1 ml) alkohol, chloroform i aceton, a
następnie do wszystkich probówek dodać po około 0,5 ml oleju. Obserwując roztwory stwierdzić
różnicę rozpuszczalności w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach.

6.1.2.Badanie składu lipidów prostych –próba akroleinowa
Zasada

: próba ta pozwala wykryć w cząsteczce lipidów prostych obecność glicerolu

(trójwodorotlenowy alkohol, dobrze rozpuszczalny w wodzie). Obecność jego wykrywa się
przeprowadzając go w nienasycony aldehyd – akroleinę

-42-

H
/
CH

— OH C = O



-2H



CH — OH

→



KHSO



— OH CH

Wynikiem reakcji jest ostra i nieprzyjemna woń będąca połączeniem zapachu SO

i spalonego

tłuszczu. Odwodnienie glicerolu zachodzi pod wpływem kwaśnego siarczanu potasu, który ulega przy
tym redukcji do SO

o charakterystycznym zapachu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
KHSO

krystaliczny

Do trzech kropli oleju w probówce dodać szczyptę krystalicznego KHSO

Podgrzać nad palnikiem.

Po podgrzaniu wytwarza się po pewnym czasie akroleina, którą poznaje się po charakterystycznym
dławiącym zapachu spalonego tłuszczu.

6.1.3. Reakcja zmydlania.
Zasada: hydroliza lipidów pozwala na wykazanie obecności kwasów tłuszczowych w cząsteczce
tłuszczu. Lipidy pod wpływem podgrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie dając glicerol i wolne
kwasy tłuszczowe zgodnie z poniższą reakcją:



OH R



COOH





+ 3H

O CH



OH + R



COOH





OH R



COOH

Triacyloglicerol glicerol kwasy tłuszczowe

Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH lub NaOH), z tym że
otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane mydłami, a sam proces
nosi miano zmydlania tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych dobrze rozpuszczają
się w wodzie , tworząc micelarne roztwory koloidowe.

-O- CO-(CH

)

— CH

- OH



CH-O- CO- (CH

)

— CH

+ 3NaOH

→

CH – OH + 3 CH

(CH

)

COONa



- O- CO- (CH

)

— CH

- OH

Trójstearynian glicerolu glicerol stearynian sodu

Mydła tworzą koloidy hydrofilowe lub hydrofobowe w zależności od środowiska. W roztworze
wodnym grupy polarne (



COONa) skierowane są na zewnątrz a rodniki hydrofobowe

(węglowodorowe)   do   wnętrza   micelarnych   kuleczek   mydła.   W   rozpuszczalnikach   organicznych
układ   tych   grup   jest   odwrotny   (mielca   odwrócona).   Grupy   hydrofilowe   i   hydrofobowe   mydła
ustawiają   się   zatem   w   charakterystyczny   sposób   na   granicy   faz   i   zmniejszają   napięcie
powierzchniowe. Związki zmniejszające napięcie powierzchniowe są dobrymi  emulgatorami  poza
mydłami należą do nich detergenty i kwasy żółciowe.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: margaryna
2 M NaOH
H

W erlenmajerce umieścić kawałek margaryny i ogrzewać na płytce nad palnikiem z 10 ml wody i 2
ml (2M) NaOH. Po pewnym czasie powstaje klarowny, lekko opalizujący i pieniący się roztwór: jest
to mydło sodowe .

-43-

Na otrzymanym roztworze mydła sodowego wykonać poniższe reakcje !!!!

a. wysalanie mydeł
Zasada:  jest to odwracalny proces fizyczny,  polegający na odwodnieniu koloidalnych cząsteczek
mydła.  Cząsteczki mydła  są otoczone warstewką wody związanej, dzięki czemu  utrzymują  się w
roztworze. Dodanie do roztworu   mydła dobrze rozpuszczalnej, obojętnej soli powoduje odwodnienie
koloidalnych  cząsteczek mydła,  zmniejsza ich rozpuszczalność i  następuje wytrącenie mydła w
postaci osadu. Po dodaniu wody mydło rozpuszcza się ponownie.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
NaCl in substantia

Do 2 ml mydła dodać NaCl in substantia, aż do nasycenia. Wytrąca się mydło wysolone w postaci
osadu. Płyn znad osadu odlać , a do osadu czyli wytrąconego mydła dodać wody. Mydło rozpuszcza
się.

b. wytrącanie wolnych kwasów tłuszczowych
Zasada : pod wpływem kwasów (siarkowego lub solnego) z mydeł zostają uwalniane kwasy
tłuszczowe:

2 CH

(CH

)

COONa + H

→

2CH

(CH

)

COOH

+ Na

mydło stearynowe kwas stearynowy

Wydzielone kwasy tłuszczowe po ogrzaniu do wrzenia zbierają się na powierzchni roztworu i po
oziębieniu tworzą „plaster”. Kwasy te są nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczają się jedynie w
alkoholu, eterze, chloroformie i chloroformie tłuszczach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
papierki lakmusowe
H

stężony

Do probówki nalać około 3 ml mydła, zakwasić go (wobec papierka lakmusowego) stężonym
kwasem siarkowym. Po ogrzaniu na powierzchni tworzy się warstwa wytrąconych kwasów
tłuszczowych, która po oziębieniu krzepnie.

c. działanie emulgujące mydeł
Zasada:  mydła  zawierają w swej cząsteczce grupę hydrofobową  ( łańcuch węglowodorowy),  nie
rozpuszczającą się w wodzie tylko w tłuszczach   oraz grupą hydrofilową (grupa karboksylowa  –
COOH) łatwo rozpuszczalną w wodzie. Mydła w roztworze umieszczają się na granicy fazy wodnej i
tłuszczowej, przy czym  ich dysocjowane  grupy COOH, naładowane ujemnie łączą się z wodą, a
grupy hydrofobowe rozpuszczają się w kuleczkach tłuszczu. W wyniku tego zostaje zniesiona granica
faz, poszczególne kuleczki tłuszczu nie łączą się z sobą i powstaje emulsja tłuszczowa. Emulsja jest
formą cieczy złożonej z dwu, nie mieszających się z sobą faz – rozproszonej i rozpraszającej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
olej
H

Do probówki wlać 1 ml oleju a następnie dodać 5 ml wody i 1 ml mydła. Po wytrząśnięciu w
probówce tworzy się trwała emulsja tłuszczowa. Do drugiej probówki wlać 1 ml oleju i tylko 5 ml
wody, a następnie mocno wytrząsnąć . Utworzy się nietrwała emulsja tłuszczowa.

-44-

6.1.4. Wykazanie obecności w lipidach nienasyconych kwasów tłuszczowych – reakcja H

ü bla

Zasada: podwójne wiązania nienasyconych kwasów tłuszczowych nadają im specyficzne cechy
chemiczne. W miejscach „nienasycenia” kwasy tłuszczowe przyłączają łatwo atomy wodoru, tlenu i
innych pierwiastków , np., chlorowców ulegając przy tym przekształceniu w pochodne kwasów
nienasyconych. Specjalne znaczenie ma przyłączenie J

, ponieważ reakcja jodowania jest kryterium

jakościowej charakterystyki lipidów. Reakcja ta pozwala na oznaczenie liczby wiązań podwójnych
w lipidach i kwasach tłuszczowych.

(CH

)

– CH=CH(CH

)

COOH + J

→

(CH

)

- CH- CH – (CH

)

COOH



J J
kwas tłuszczowy kwas dwujodotłuszczowy

Reakcja powyższa została wykorzystana w próbie H

übla, w której w obecności chlorku rtęciowego

HgCl

następuje przyłączenie jodu w miejscu podwójnego wiązania kwasu tłuszczowego. Po dodaniu

do kwasu tłuszczowego roztworu H

übla I (alkoholowy roztwór jodu), roztwór zabarwia się na kolor

brunatno-brązowy. Pod wpływem roztworu H

übla II (alkoholowy roztwór HgCl

) następuje

wbudowanie jodu w cząsteczkę kwasów tłuszczowych i mieszanina odbarwia się.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
odczynnik H

übla I (2,6% alkoholowy roztwór jodu)

odczynnik H

übla II (3% alkoholowy roztwór HgCl

)

Do 2 ml oliwy dodać kroplami odczynnik H

übla I. Roztwór zabarwia się na kolor brunatno-

brązowy. Następnie wkropić odczynnik H

übla II. Następuje odbarwienie roztworu.

6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.
Zasada:   Jeżeli   na   lipidy   zawierające   kwasy   tłuszczowe   nienasycone   podziała   się   substancją
utleniającą   ,   dochodzi   do   rozerwania   wiązania   podwójnego   z   równoczesnym   utlenieniem
znajdujących się w jego sąsiedztwie atomów węgla, kwas rozpada się na krótsze związki – w ten
sposób można określić miejsce położenia wiązania podwójnego cząsteczce kwasu.
Jako  substancję   utleniającą  używa   się   nadmanganian   potasu   (KMnO

) , w którym mangan w

środowisku obojętnym przechodzi ze stopnia utlenienia +7 na stopień utlenienia +4

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
1 mol/l Na

0,01 mol/l KMnO

Do probówki wlać parę kropli oleju a następnie dodać 3 ml Na

Mieszaninę lekko podgrzać. Po

czym dodać kroplami KMno

, aż do utworzenia brunatnego osadu dwutlenku manganu (MnO

6.2.Tłuszcze złożone-  badanie  składu lecytyn
Lecytyny  (fosfatydylocholiny)     zbudowane   są   z   cząsteczki   glicerolu   estryfikowanego   dwoma
cząsteczkami  kwasów  tłuszczowych (nasyconego i nienasyconego) oraz z jednej cząsteczki kwasu
fosforowego   estryfikowanego   aminoalkoholem   choliną   (trimetyloetanolamina).   Istnieje   szereg
odmian lecytyn, różniących się między sobą rodnikami kwasów tłuszczowych oraz położeniem kwasu
fosforowego.

fosfatydylocholina

-45-

Lecytyny są substancjami żółtymi, woskowatymi. Na powietrzu łatwo się utleniają . Są to związki
higroskopijne, łatwo rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych oraz w wodnych roztworach
kwasów żółciowych. Nie rozpuszczają się w acetonie i wodzie z którą tworzą lepkie koloidalne
roztwory.

6.2.1.Wykrywanie glicerolu
Na suchej lecytynie wykonać reakcje akroleinową na obecność glicerolu.

6.2.2.Wykrywanie kwasów tłuszczowych:
Zasada: pod wpływem NaOH lecytyna ulega hydrolizie i tworzą się sole sodowe kwasów
tłuszczowych oraz powstająca z choliny trimetyloamina N(CH

)

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: lecytyna
20% NaOH

Umieścić kilka granulek lecytyny w probówce i nalać około 3 ml 20% NaOH. Ogrzewać przez kilka
minut. Podczas ogrzewania czuć woń trimetyloaminy. W roztworze tworzą się mydła.

6.2.3.Wykrywanie kwasu fosforowego
Zasada: podczas utleniania lecytyny w wysokiej temperaturze wszystkie jej składniki ulegaja
utlenieniu na substancje lotne. Fosfor jako ciało stałe pozostaje na dnie probówki, a po rozpuszczeniu
w rozcieńczonym HNO

można go wykryć molibdenianem amonu, z którym tworzy żółty osad

fosforomolibdenianu amonu

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki: lecytyna
mieszanina do spalań (KNO

+ K

w stosunku. 2:3)

HNO

rozcieńczony

molibdenian amonu

Do probówki wsypać kilka granulek lecytyny  dodać dwukrotnie większą ilość mieszaniny do spalań
i trzymać nad płomieniem palnika tak długo, aż zawartość probówki przyjmie czarne zabarwienie.
Pozostałość   w   probówce   rozpuścić   w   rozcieńczonym   kwasie   azotowym     Zawartość   probówki
przesączyć.  Do otrzymanego przesączu wlać niewielką ilość molibdenianu amonu, aż do uzyskania
żółtego zabarwienia.

-46-

7. CHOLESTEROL

Cholesterol ( 5 cholesten-3-

-ol) wchodzi w skład lipidów budulcowych ustroju . Jest głównym

sterolem zwierzęcym. Wywodzi się on z 27-węglowego układu cholestenu i posiada jedno wiązanie
podwójne w pozycji 5 oraz grupę hydroksylową w pozycji 3.

Cholesterol występuje w komórkach wszystkich tkanek i narządów, przeważnie jako wolny, ale także
może być związany estrowo z kwasami tłuszczowymi. Wolny cholesterol stanowi niezbędny składnik
błon   cytoplazmatycznych   i   błon   organellowych.W   obrębie   cytoplazmy     cholesterol   może   być
magazynowany   w   postaci   pęcherzyków   zawierających   estry   cholesterolu.   Najwięcej   tych
pęcherzyków   jest   w   komórkach   kory   nadnerczy   oraz   gonad   gdzie   cholesterol   jest   substratem
koniecznym   do   syntezy   hormonów   steroidowych.   W   wątrobie     z   cholesterolu     powstają   kwasy
żółciowe.

7.1.Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu

7.1.1 Reakcja  Salkowskiego
Zasada: Po podwarstwieniu chloroformowego roztworu cholesterolu  stężonym kwasem siarkowym,
faza   dolna   kwasu   fluoryzuje   na   zielono,   natomiast   warstwa   górna   chloroformowa   barwi   się   na
czerwono.   .Przypuszcza   się   ,   że   barwa     reakcji   pochodzi   od   utworzonych   dodatkowo   wiązań
podwójnych  lub kondensacji dwu cząsteczek cholesterolu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: cholesterol
chloroform
H

stężony

Niewielką ilość cholesterolu wsypać do suchej probówki (obecność wody przeszkadza w reakcji !) i
dodać 2 ml chloroformu , a następnie bardzo ostrożnie po ściankach probówki wlać 2 ml stężonego
kwasu siarkowego tak , aby płyny nie zmieszały się. Otrzymaną reakcję oglądać pod lampa
kwarcową !. Warstwa dolna kwasu siarkowego wykazuje zabarwienie żółte z zieloną fluorescencją,
natomiast warstwa górna , chloroformowa jest zabarwiona na czerwono.

6.1.2.Reakcja Libermana – Burcharda

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: cholesterol
chloroform
bezwodnik kwasu octowego
H

stężony

W suchej probówce szczyptę cholesterolu rozpuścić w 2 ml chloroformu i dodać 10 kropli
bezwodnika kwasu octowego, następnie bardzo ostrożnie wlać po ściankach probówki 1-2 kropli
stężonego kwasu siarkowego. Roztwór zabarwia się kolejno na czerwono- fiołkowo- niebiesko-
zielono.

47-

8 .KWASY ŻÓŁCIOWE.

Sole kwasów żółciowych są polarnymi pochodnymi cholesterolu. Związki te są wysoce efektywnymi
detergentami,  ponieważ ich cząsteczki  zawierają zarówno polarne,    jak i niepolarne  rejony.  Sole
kwasów   żółciowych   są   syntetyzowane   w   wątrobie,   magazynowane,   zagęszczane   w   pęcherzyku
żółciowym  i uwalniane  stamtąd  do jelita  cienkiego. Sole te,  będące  głównym  składnikiem żółci,
działają   emulgująco   na   tłuszcze   pokarmowe.   Skuteczne   zwiększenie   powierzchni   cząsteczek
lipidów ma dwie konsekwencje: ułatwia hydrolizę tłuszczów przez lipazy i ich wnikanie do ściany
jelita. Sole kwasów żółciowych są również głównym produktem rozpadu cholesterolu.

8.1.Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych:

8.1.1.Próba Haya
Zasada: kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy – siarka lub talk w obecności żółci
nie utrzymuje się na powierzchni , lecz szybko opada na dno

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
talk
H

Do 2 probówek wlać po 5 ml wody. Do jednej dodać kroplę żółci i dokładnie wymieszać. Do obu
probówek wsypać szczyptę talku. W probówce do której dodano żółć (czyli kwasy żółciowe) talk
szybko opada na dno, natomiast probówce gdzie jest tylko woda talk utrzymuje się na powierzchni.

8.1.2.Emulgujące działanie żółci
Zasada: obniżenie napięcia powierzchniowego w obecności kwasów żółciowych umożliwia
tworzenie się emulsji.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
olej
H

Do 2 probówek nalać po 5 ml wody i 5 kropli oliwy. Do jednej z nich dodać 3 krople żółci – obie
probówki silnie wstrząsnąć i odstawić. Po paru minutach w probówce bez żółci nastąpi rozdzielenie
warstw wody i oliwy, natomiast w probówce drugiej powstaje zawiesina tłuszczu.

8.1.3. Próba Pettenkofera

Zasada: w środowisku silnie kwaśnym fruktoza tworzy 5-hydroksymetyelenofurfural, który
kondensuje z kwasami żółciowymi na barwne pochodne

Sole kwasów żółciowych

Kwas glikocholowy

Kwas taurocholowy

-48-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
fruktoza lub sacharoza
H

stężony

Do 1 ml rozcieńczonej żółci dodać kilka kryształków fruktozy lub sacharozy i po rozpuszczeniu cukru
ostrożnie po ściankach probówki wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego Na pograniczu obu
warstw tworzy się czerwony pierścień.

9.HORMONY STEROIDOWE

Cholesterol jest prekursorem pięciu głównych klas hormonów steroidowych: progestagenów,
glukokorykoidów, mineralokortykoidów, androgenów i estrogenów.

cholesterol (C

)

↓

pregnenolon (C

)

↓

progestageny (C

)

glikokortykoidy (C

) androgeny (C

)

mineralokorykoidy (C

)

estrogeny (C

)

Progesteron,  hormon grupy progestagenów, przygotowuje  podłoże macicy do  umiejscowienia jaja.
Progesteron   jest   również   niezbędny   do   utrzymania   ciąży.  Androgeny  (testosteron,   androsteron,
androstendion) są odpowiedzialne   za rozwój drugorzędowych męskich cech płciowych, natomiast
estrogeny  (estradiol, estron,   estriol)konieczne do wytworzenia drugorzędowych cech   płciowych
żeńskich. Estrogeny wspólnie z progesteronem uczestniczą również w cyklu owulacyjnym.
Glikokorykoidy  (kortyzol,  kortyzon,   kortykosteron)   pobudzają     glukoneogenezę     i   tworzenie
glikogenu   oraz   wzmagają   rozkład   tłuszczu   i   białka.   Umożliwiają   reakcję   zwierząt   na   stres   .
Mineralokortykoidy (głównie aldosteron) powodują zwiększenie resorpcji Na

i wydzielanie K

i H

przez kanaliki nerkowe, co prowadzi do wzrostu objętości i ciśnienia krwi.

Głównymi miejscami syntezy tych grup hormonów są dla : progestegenów – ciałko żółte, estrogenów
– jajnik, androgenów – jądra, glukokortykoidów i mineralokortykoidów – kora nadnerczy.

Synteza progesteronu i kortykoidów.

Progesteron jest syntetyzowany z pregnenolonu w dwóch etapach. Grupa 3-hydroksylowa
pregnenolonu jest utleniania do grupy 3-ketonowej i wiązanie r

izomeryzuje do wiązania r

Koryzol , główny glukokortykoid tworzy się z progesteronu przez hydroksylację przy C-17, C-21, i
C-11.
Początkowym     etapem   syntezy   aldosteronu,   głównego   mineralokortykoidu   jest   hydroksylacja
progesteronu   przy  C-21.   Powstały  deoksykortykosteron   jest   hydroksylowany   przy   C-11.   Kątowa
grupa metylowa C-18  zostaje utleniona  do aldehydu i powstaje aldosteron.

-50-

9.1.Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych:

9.1.1.Reakcja Zimmermanna
Zasada:

w środowisku alkalicznym

17-ketosteroidy

(androsteron, androstendion,

dehydroepiandrosteron) kondensują z m-dwunitrobenzenem na pochodne o barwie fiołkowo-
różowej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :alkohol etylowy absolutny (100%)
96% alkohol etylowy
2% m-dwunitrobenzen
2,5 mol/l KOH w alkoholu etylowym

Do probówki wsypać około 10

g androsteronu, a następnie dodać kolejno przy pomocy pipety

automatycznej (200

0,2 ml alkoholu etylowego absolutnego (100%)

2. 0,2 ml 2% m-dwunitrobenzenu
3. 0,2 ml 2,5mol/lKOH,

po czym inkubować roztwór przez okres minimum 30 minut w ciemności w temperaturze
pokojowej. Po tym okresie w celu zahamowania reakcji dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego.
Powstaje zabarwienie fiołkowo-różowe.

9.1.2.Reakcja Kobera
Zasada: w obecności stężonego kwasu siarkowego, estrogeny z hydrochinonem tworzą różowo-żółte
zabarwienie o zielonej fluorescencji. Jest to reakcja specyficzna dla aromatycznego pierścienia A
estrogenów.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: estradiol
odczynnik Kobera (70%H

+ hydrochinon)

Do probówki wlać około 10

l estradiolu i dodać 2 ml odczynnika Kobera. Następnie ogrzewać we

wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut. Po tym okresie oziębić probówkę pod bieżącą zimną wodą.
Po oziębieniu dodać 0,2 ml H

O i ponownie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na okres 10 minut. Po

oziębieniu powstaje żółto- kremowe zabarwienie które pod lampa kwarcową daje zieloną
fluorescencję .

9.1.3.Reakcja Portera-Silbera
Zasada: jest to reakcja charakterystyczna tylko dla 17-hydroksykortykosteroidów, czyli
posiadających grupę hydroksylową przy C

(kortyzon, kortyzol). Z chlowodorkiem

fenylohydrazyny, w obecności kwasu siarkowego powstaje żółty hydrazyn.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kortyzol lub kortyzon
odczynnik Portera-Silbera (chlorowodorek fenylohydrazyny + kwas siarkowy)

Do probówki wlać około 10

l kortyzolu a następnie dodać 1 ml odczynnika Portera_Silbera.

Probówkę wstawić do gorącej łaźni wodnej na około 5 minut, powstaje żółte zabarwienie.

9.1.4.Reakcja z błękitem tetrazoliowym.
Zasada: reakcję tę dają wszystkie kortykosteroidy posiadające ugrupowanie

-ketalowe w łańcuchu

bocznym przy C

( kortyzol, kortyzon, aldosteron). Redukują one błękit tetrazoliowy do różowego , a

przy dużych ilościach sterydu do niebieskiego formazonu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kortyzol lub kortyzon
roztwór błękitu tetrazoliowego (1mg błękitu w 1ml 2mol/l NaOH)

Do probówki wlać 10

l kortyzolu po czym dodać 1 ml roztworu błękitu tetrazoliowego. Powstaje

różowe zabarwienie.

-51

10.HEMOGLOBINA

Warunkiem   wiązania   tlenu   przez   hemoglobinę,   białka   należącego   do   grupy   hemoprotein   jest
obecność jednostki niebiałkowej, a mianowicie grupy hemowej. Składa się ona z części organicznej i
atomu żelaza. Część organiczna   protoporfiryna, zbudowana jest z czterech pierścieni pirolowych,
połączonych mostkami metanowymi  w pierścień tetrapirolowy. Do tego pierścienia przyłączone są
łańcuchy boczne, z których cztery są grupami metylowymi,  dwa – grupami winylowymi  i dwa –
resztami kwasu propionowego.

Atom żelaza w grupie hemowej , umieszczony w centrum   pierścienia   protoporfiryny, wiąże się z
czterema atomami azotu  wiązaniami koordynacyjnymi, piąte wiązanie  – z tlenem (zachodzi proces
utlenowania),   a   szóste   wiązanie   koordynacyjne   służy   do   połączenia   z   białkiem   przez   pierścień
imidazolowy histydyny.

W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-
O

). W przypadku utleniania żelazo zmienia swój stopień utlenienie z Fe

do Fe

z jednoczesnym

przyłączeniem cząsteczki H

O, powstaje methemoglobina (Met-Hb).

Hemoglobina jest przenośnikiem tlenu w organiźmie w postaci oksyhemoglobiny. tj. hemoglobiny
utlenowanej.   Cząsteczka   hemoglobiny   może   przyłączyć   4   cząsteczki   tlenu   atmosferycznego,   1g
hemoglobiny   wiąże   1,36   ml   tlenu.   Proces   utlenowania   hemoglobiny     i   trwałość   powstałej
oksyhemoglobiny zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu, tzn. od jego stężenia.
Oksyhemoglobina pod działaniem   kwasów, zasad i rozpuszczalników organicznych, jak etanol lub
aceton, przechodzi w parahematynę, inaczej nazywaną hemichromogenem. Część białkowa jest tu
zdenaturowana, a żelazo – w postaci Fe

. Redukując hemichromogen otrzymuje się hemochromogen,

zbudowany z hemu i zdenaturowanej globiny .

Grupa winylowa

Grupa metylowa

Reszta kwasu propionowego

Sposób połączenia hemu z białkiem

-52-

Hematyna może powstać z hemoglobiny przez działanie na nią zasadą (hematyna zasadowa) lub
kwasem (hematyna kwasowa), w warunkach tlenowych, zawiera ona Fe

i nie ma części białkowej.

Zarówno kwasy, jak i zasady rozbijają hemoglobinę, przy czym uwolniony hem utlenia się tlenem z
Hb-O

na hematynę, a globina ulega denaturacji. Oksyhemoglobina pod działaniem gorącego

stężonego roztworu CH

COOH i NaCl traci białko i w ten sposób powstaje hemina z żelazem Fe

+3.

Hemina rozpuszczona w wodorotlenku przechodzi w hematyną zasadową.
Łagodne, nie denaturujące globinę, środki utleniające hemoglobinę, jak H

2,, ,

[Fe(CN)

KMnO

, zmieniaja ją w methemoglobinę (Met-Hb), w której zamiast hemu występuje hematyna z

żelazem Fe

HbO

+ [Fe(CN)

]

→

Met-Hb + [Fe(CN)

]

+ O

Barwniki   hematynowe   nie   wiążą   tlenu,   CO   i   dają   barwne   pochodne   z   cyjankami
(cyjanomethemoglobina).   Trujące   działanie   cyjanków   polega   na   blokowaniu   układu   hemowego
enzymów biorących udział w utlenieniach tkankowych.
Z   hemoglobiną   300-krotnie   silniej   niż   tlen   łączy   się   tlenek   węgla,   w   wyniku   czego   powstaje
hemoglobina   tlenkowowęglową,-   karboksyhemoglobina  (Hb-CO).   Zdolność   wiązania   CO   mają
chromoproteiny   zawierające hem,  natomiast proteiny hemetynowe  właściwości tej nie wykazują.
Silne   toksyczne   działanie   tlenku   węgla   wiąże   się   z   wyłączeniem   hemoglobiny   z   udziału   w
transportowaniu tlenu i blokadą oksydazy cytochromowej, uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.

10.1.Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych:

10.1.1.Otrzymywanie methemoglobiny

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: krew (nie rozcieńczona)
K

[Fe(CN)

]

Do probówki wlewamy około 0,5 ml krwi nie rozcieńconej a następnie dodajemy parę kropli
roztworu heksacyjanożelazianu (żelazicyjanku) potasowego K

[Fe(CN)

]. Pod działaniem tego środka

utleniającego Hb-O

przechodzi w Met-Hb. Krew przybiera zabarwienie brunatne.

10.1.2.Otrzymanie hematyny kwasowej

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 10-krotnie rozcieńczona krew
2 MHCL

-53-

Do probówki wlać 2 ml rozcieńczonej krwi , następnie dodać 3-4 krople 2M HCl. Roztwór zmienia
barwę na brunatną ponieważ hemoglobina ulega rozkładowi na globinę i hematyną kwasową. Z
hematyny w obecności jonów Cl

tworzy się chlorowodorek hematyny – hemina.

10.1.3.Otrzymanie hematyny zasadowej i hemochromogenu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:10-krotnie rozcieńczona krew
5%NaOH
Na

krystaliczny

Do probówki wlać około 2 ml rozcieńczonej krwi dodać 5 kropli 5% NaOH i łagodnie podgrzać.
Zawartość probówki przybiera zabarwienie brunatne wskutek utworzenia hematyny zasadowej. Po
dodaniu kilku kryształków Na

barwa zmienia się na czerwoną w wyniku powstania

hemochromogenu. Reakcję oglądać pod światłem!. Dwutionian sodu redukuje hematynę do hemu ,
który ze zdenaturowaną globiną tworzy hemochromogen.

10. PRODUKRY ROZKŁADU HEMU

Normalne krwinki czerwone (erytrocyty) człowieka żyją około 120 dni. Stare komórki są usuwane z
obiegu i rozkładane przez śledzionę. Część białkowa hemoglobiny ulega hydrolizie do składników –
aminokwasów. Pierwszy etap rozpadu grupy hemowej do bilirubiny to rozszczepienie jej mostka

-metinowego i utworzenie biliwerdyny, łańcuchowego tetrapirolu. Powstająca biliwerdyna (o barwie

zielononiebieskiej) występuje w dwóch formach tautomerycznych ; jedna z nich zawiera dwie grupy
–OH na końcu układu, zaś druga dwie grupy karbonylowe. W następnej reakcji biliwerdyna pod
wpływem specyficznej reduktazy biliwerdyny współdziałającej z NADPH + H

, jest zredukowana

do bilirubiny ( o barwie pomarańczowo-żółtej).

Degradacja hemu do bilirubiny

-55-

11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych

11.1.1.Próba Gmelina
Zasada: stężony kwas azotowy utlenia barwniki żółciowe na pochodne o zmieniającej się barwie od
zielonej, poprzez niebieską, fioletową, czerwoną do żółtej. Barwy te odpowiadają kolejnym
produktom utlenienia bilirubiny.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki rozcieńczona żółć
HNO

stężony

Do  probówki   wlać  około 1  ml  rozcieńczonej   żółci,  a   następnie  bardzo   ostrożnie!  po ściankach
probówki   wlać   1   ml     stężonego   kwasu   azotowego.   Ostrożnie   ,ale   bardzo   dokładnie   wymieszać
zawartość     probówki..  Po   5   do   10   minutach   na   pograniczu   obu   płynów   powstaje   warstwa
czerwona i zielona.

11.1.2 .Próba Rosina
Zasada: próba polega na utlenieniu barwników żółciowych barwnikiem utleniającym w tej reakcji
jest roztwór jodu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
5% roztwór jodu

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie ostrożnie dodać 2-3 kropli jodu.
Bilirubina utlenia się na zieloną biliwerdynę.

11.1.3 Próba Cole’a

Zasada: barwniki żółciowe mogą zostać zaadsorbowane przez siarczan baru (BaSO

w kwaśnym,

etanolowym roztworze. Dodając chloran potasu (KClO

), można utlenić bilirubinę i biliwerdynę na

połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
MgSO

nasycony

10%BaCl

etanol
H

stężony

2%KClO

W erlenmajerce zagotować 5 ml żółci, następnie dodać 2 krople nasyconego MgSO

i około 1ml

10% chlorku baru (BaCl

)

Wytrąca się osad. Roztwór z osadem ponownie zagotować. Po

zagotowaniu przesączyć roztwór do probówki. Pobrać trochę osadu z sączka przy pomocy bagietki
szklanej lub metalowej do kolejnej probówki , dodać 4 ml etanolu oraz 3 krople stężonego H

kroplę KCLO

. Nie mieszać!!!!.

Gotować na płytce nad palnikiem przez 30 sek., po czym odstawić probówkę na 2 -5 minut. Po
opadnięciu osadu BaSO

warstwa etanolu zabarwia się na kolor zielono –niebieski. Jest to

utleniona bilirubina i biliwerdyna.

11.1.4.Próba Schlesingera
Zasada: jest to próba pozwalająca wykryć obecność urobiliny w moczu, jako produkt utleniania
urobilinogenu. Urobilina z solami cynku daje zieloną fluorescencję.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocz
5 % roztwór J

10% alkoholowy roztwór octanu cynku

Do probówki wlać około 3 ml moczu a następnie dodać 1-3 kropel 5% roztworu jodu. Odstawić na 5
minut , po czym dodać 3 ml 10% roztworu octanu cynku. Wymieszać i pozostawić do opadnięcia

osadu .Oglądać zieloną fluorescencję pod lampą kwarcową !

-56-

12.WITAMINY

Witaminy są cząsteczkami organicznymi, niezbędnymi w małych ilościach w pożywieniu zwierząt
wyższych.  Spełniają one prawie taka sama rolę we wszystkich organizmach , ale tylko zwierzęta
wyższe utraciły zdolność ich syntezy. Witaminy dzielimy na rozpuszczalne  w wodzie i rozpuszczalne
w tłuszczach
Rozpuszczalnymi w wodzie są: witamina C,  grupa związków znana jako witaminy B kompleks oraz
witamina H.
Witamina   C  to   zjonizowana   forma   kwasu   askorbinowego.   Objawem   awitaminozy   kwasu
askorbinowego   jest   schorzenie   nazywane   szkorbutem   (gnilecem).   Są   to   uszkodzenia   naczyń
włosowatych   i   związane   z   tym   krwawienie   dziąseł   i   wypadaniem   zębów.   Występuje   głownie   w
świeżych   owocach   i   warzywach.   Kwas   askorbinowy   spełnia   w   organizmie   funkcje   czynnika
redukujcego w wielu reakcjach do których zalicza się syntezę kolagenu, amin katecholowych  oraz
biosyntezę kwasów żółciowych.

Tiamina (witamina B

aneuryna) Pirofosforan tiaminy jej ufosforylowana forma jest koenzymem

transferaz. Awitaminoza witaminy B

nosi nazwę beri-beri i występuje przy odżywianiu się

wyłącznie odtłuszczonym ryżem. Jest poważnym problemem w krajach Dalekiego Wschodu. Podczas
tej choroby występują schorzenia neurologiczne i kardiologiczne, które objawiają się uszkodzeniami
obwodowego układu nerwowego, bólem nóg i rąk, osłabieniem mięśni i zmianami wrażliwości skóry
Serce może być powiększone i występuje niewydolność krążenia. Beri-beri jest schorzeniem które
spotkać można u chronicznie niedożywionych alkoholików.

Ryboflawina (witamina B

) jest grupa czynną koenzymów oksydoredukcyjnych (FMN, FAD)

Awitaminoza tej witaminy powoduje u zwierząt zahamowanie wzrostu i schorzenia skórne, u
człowieka są to zapalenia skóry oraz zmiany zapalne w okolicy warg.

-57-

Amid kwasu nikotynowego (niacyna, witamina PP) to amid kwasu pirydyno-3-karboksylowego
jest grupą czynną koenzymów osydoredukcyjnych (NAD

, NADP

). Niedobór kwasu nikotynowego

prowadzi do zmian skórnych zwanych pelegrą oraz do biegunki i delirium.

Kwas pantotenowy (kompleks B

jest dwupeptydem , który w połączeniu z cysteaminą tworzy

pantoteinę będącą składnikiem koenzymu A. Pełni funkcję jego prekursora. Brak kwasu
pantotenowego powoduje siwienie włosów u szczurów, pelagrę u drobiu. U człowieka jednak
objawy nie są znane.

Folian (kompleks B

) jest pochodną pterydyny, a formą czynną biochemicznie jest kwas

tetrahydrfoliowy , który jest koenzymem transferaz. U człowieka niedobór folianu objawia się
przede wszystkim zamianami obrazu krwi – anemią. Przyczyną tych zmian patologicznych jest nie
tyle niedobór folianu w pokarmie , ile zaburzenia w jego wykorzystaniu..

Pirydoksyna (witamina B

) jest pochodną pirydyny i stanowi składnik fosforanu pirydoksalu,

będącego ważnym koenzymem w przemianie aminokwasów .Niedobór witaminy B

nie daje

typowego obrazu chorobowego. U dzieci obserwowane są drgawki epileptyczne, które spowodowane
są zaburzeniami w przemianie kwasu glutaminowego. Niekiedy występują również objawy łojotoku .

-60-

12.1.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie:

12.1.1.Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Jensena

Zasada: jest to metoda tiochromu polegająca na łagodnym utlenieniu witaminy B

żelazicyjankiem

potasu K

Fe(CN)

w środowisku alkalicznym. Powstały produkt utlenienia tiaminy – tiochrom silnie

fluoryzuje na niebiesko w świetle nadfiołkowym.
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór witaminy B

metanol
1%K

Fe(CN)

30% NaOH
alkohol izobutylowy

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

a następnie dodać 1 ml metanolu oraz przy ciągłym

mieszaniu 0,1ml 1% roztworu K

Fe(CN)

i 1 ml NaOH. Tak przygotowaną mieszaninę odstawić do

statywu na około 1 minutę. Po upływie tego czasu dodać 6 ml alkoholu izobutylowego i silnie
wytrząsnąć. Po oddzieleniu warstwy alkoholowej oglądać reakcję pod lampą kwarcową

11.1.2.Wykrywanie obecności witaminy B

2 –

metoda Eulera i Adlera

Zasada: roztwory wodne witaminy B

, w środowisku obojętnym dają żółto-zieloną fluorescencję

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór wodny witaminy B

mieszanina pirydyny, wody i metanolu

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

dodać 2 ml mieszaniny pirydyny , wody i metanolu.

Reakcję oglądać pod lampą kwarcową – widoczna jest żółto-zielona fluorescencja witaminy B

12.1.3.Wykrywanie witaminy B

– metoda Greena

Zasada: Witamina B

z chlorkiem żelazowym tworzy połączenia o barwie czerwonej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór witaminy B

10% FeCl

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

dodać kilka kropel 10 % FeCl

- powstaje czerwone

zabarwienie.

12.2.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach;

12.2.1. Wykrywanie witaminy A - metoda Carra i Price’a
Zasada: chloroformowy roztwór witaminy A z odczynnikiem Cara i Price’a (chloroformowy roztwór
trójchlorku antymonu SbCl

) daje niebieskie zabarwienie.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: chloroformowy roztwór witaminy A
odczynnik Cara i Price’a

Do probówki nalać 1 ml odczynnika Carra i Price’a a następnie 3 do 5 kropel witaminy A – pojawia
się niebieskie zabarwienie.

-61-

12.2.2.Wykrywanie witaminy D

w tranie

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: chloroformowy roztwór tranu (1:1)
chloroformowy roztwór bromu (1: 60)

Do suchej probówki wlać 1 ml chloroformowego roztworu tranu i 1 ml roztworu bromu. Przez krótki
okres czasu utrzymuje się zielone zabarwienie.

12.2.3.Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe

Zasada: podczas utleniania tokoferolu za pomocą Fe

przechodzi on w tokoferolochinon o

zabarwieniu czerwonym.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: etanolowy roztwór witaminy E
0,2% FeCl

(w bezwodnym etanolu)

Do probówki wlać 2 ml roztworu witaminy E dodać 0,5 ml roztworu FeCl

. Po dokładnym

wymieszaniu pojawia się czerwone zabarwienie.

-62-

12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty

Zasada: Metoda oznaczania oparta jest na wykorzystaniu własności redukujących kwasu
askorbinowego. Ilość kwasu askorbinowego w analizowanym materiale biologicznym oznacza się
przez miareczkowanie mianowanym roztworem soli sodowej 2,6-dichlorofenoloindofenolem. Jest to
barwnik będący równocześnie wskaźnikiem końcowego punktu miareczkowania. W środowisku
kwaśnym przybiera on barwę różową , a w zasadowym – niebieską.

Barwnik utlenia kwas askorbinowy do 2,3-dehydroaskorbinowego, a sam redukuje się do
bezbarwnego związku. Analizowana próbka pozostaje bezbarwna, dopóki zawiera kwas askorbinowy.
Nadmiar barwnika, nie ulegający redukcji, powoduje wystąpienie różowego zabarwienia
roztworu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: liście kapusty
2% kwas szczawiowy
2,6 –dichlorofenoloindofenol

Odważyć 12,5 g  pokrojonych liści kapusty. Rozetrzeć    bardzo dokładnie  odważoną kapustę w
moździerzu porcelanowym   z 20 ml  2 %  roztworu kwasu szczawiowego. Rozdrobniony materiał
przenieść ilościowo do 50 ml cylindra miarowego   i    uzupełnić do objętości 50 ml
2% roztworem kwasu szczawiowego. Wymieszać bardzo dokładnie  i przesączyć przez sączek do
suchej  zlewki.
Z  przesączu  odpipetować do dwóch 50 ml kolbek po 5 ml przesączu  i szybko !!!!! miareczkować
roztworem barwnika do momentu wystąpienia różowego trwałego zabarwienia.
Wiedząc,     że   1   ml   barwnika   utlenia   88

g kwasu askorbinowego , obliczyć stężenie kwasu

askorbinowego w analizowanym materiale. Wyniki podać w mg/100mg

12.4.Ilościowe oznaczenie witaminy C w mleku

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : mleko
CH

COOH lodowaty

2,6 –dichlorofenoloindofenol

Do 200 ml kolbki odpipetować 10 ml mleka , dodać 1 ml kwasu octowego lodowatego i 40
ml wody destylowanej. Wymieszać i natychmiast miareczkować roztworem 2,6-
dichlorofenoloindofenolem aż do uzyskania różowego zabarwienia analizowanej próbki.
Wyniki podać w mg/100ml mleka.

Sprawozdanie z ćwiczeń:

Napisać sprawozdanie z ćwiczeń w którym przedstawić obliczenia stężenie witaminy C w kapuście i

w mleku.

-63-

13.ENZYMY

Enzymy to białka o własnościach katalitycznych, które posiadają zdolność zwiększania szybkości
reakcji chemicznej. Obniżają energie aktywacji , same jednak nie ulegają przemianie , dlatego też nie
zużywają się bezpośrednio w wyniku reakcji. Większość enzymów składa się z części białkowej
czyli apoenzymu oraz z części niebiałkowej czyli grupy prostetycznej lub koenzymu. Na powierzchni
enzymu znajduje się zagłębienie będące miejscem wiązania substratu nazywane centrum aktywnym.
Przestrzenne dopasowanie substratu do centrum aktywnego enzymu umożliwia ich związanie i
wytworzenie kompleksu enzym substrat (ES)
Ogólnie równanie reakcji enzymatycznej można przedstawić w następujący sposób:

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu
reakcji katalizowanej:
Klasa 1: Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji (np. dehydrogenaza,
reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza, peroksydaza)
Klasa 2: Transferazy- enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi
związkami (np. transaldolaza, transketolaza, , amino-, petptydylo-,acylo-, metylo-, glukozylo-, fosfo-
transferaza, kinaza)
Klasa   3:   Hydrolazy   –   enzymy   katalizujące   rozkład   różnych   wiązań   chemicznych   z   udziałem
cząsteczki wody ( np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, lipaza, amylaza,
peptydaza)
Klasa 4: Liazy (syntazy) – enzymy katalizujavce odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczki
wody   lub   dołączenie   grup   do   wiązań   podwójnych   (np.   dekarboksylaza,   aldolaza,   hydrataza,
dehydrtataza)
Klasa 5: Izomerazy – enzymy katalizujące reakacje  izomeracji ( np.racemaza, epimeraza)
Klasa   6:   Ligazy  (   syntetazy)   –   enzymy   katalizujące   wytworzenie   wiązań   pomiędzy   atomami   w
cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)
Aktywność enzymu:

Międzynarodowa jednostka enzymu (U)– jest to aktywność enzymu która katalizuje

przemianę 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w temp. 30

C w optymalnych warunkach

Katal (kat)- aktywność enzymu który przekształca 1 mol substratu w casie 1 sekundy w

temperaturze 30

C w optymalnych warunkach.

Stężenie enzymu wyraża się jako stężenie aktywności w płynie biologicznym czyli liczbę zawartych
w 1 l roztworu (U/l lub kat/l) bądź w mol/l (M) . W celach diagnostycznych w płynach biologicznych
(surowica, mocz) oznacza się stężenie enzymów takich jak fosfataza alkaliczna, kwaśna, amylaza,
dehydrogenza mleczanowa, aminonotransferaza asparaginowa i alaninowa)

Mechanizm katalizowanej reakcji z udziałem jednego substratu

E - enzym, S - substrat, P - produkt, k

i k

- stałe szybkości reakcji przebiegających w prawą stronę,

-1

i k

-2

- stałe szybkości reakcji zachodzących w lewą stronę. W założeniach modelu kinetyki

Michaelis-Mentena zakłada się, że produkt (P) nie może ulec powrotnemu przekształceniu w
wyjściowy substrat, w reakcji ze stałą szybkości k

-2

-64-

13.1.Kinetyka reakcji enzymatycznych
Badaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności
pozwala  na podanie  szybkości  reakcji w dowolnym  czasie   i przy dowolnym  stężeniu substratu.
Szybkość   reakcji   zależy   od   wielu     różnych   czynników,   a   mianowicie   od   chemicznej   struktury
reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska  w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu)
od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.
Zadaniem kinetyki jest  ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między
szybkością  reakcji  , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji
w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.
Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i
oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten
przyrost (ubytek) nastąpił.

                                              r x
                           V =
                                              r t
V =  szybkość reakcji enzymatycznej
x  = stężenie produktu
t  = czas (min. sek)

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić
następująco:

rx
V = = k (a –x)
rt
r = przyrost
v = prędkość
t = czas
a = stężenie substratu
x = stężenie produktu
k = stała reakcji

powyższy wzór można zapisać jako równanie :
rx/ rt = k( a-x )
aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

k = 1 ln a = 2.303 x log a
t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303
                                       a
                         log       a - x
      k   =                                                        x    2.303

-1

t
k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min

-1

, sek

-1

itd.

-65-

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

13.1.1. Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy
sacharozy
Zasada

: sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością

cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość
powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża
się w dowolnych jednostkach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony)
6 M HCL
10% NaOH
0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy)
1% kwas pikrynowy

Przygotować 7 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml
6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z
roztworem NaOH  ( czas t = O).  Do kolejnych probówek z 10% NaOH   wprowadzać   po  1 ml
hydrolizatu po  upływie: 5,  10,  15,  20,  25,  i 30 minut.
Następnie dodać do wszystkich probówek po  2ml  1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i
wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić  i dodać do każdej po
4 ml wody, próbki są gotowe do pomiaru absorbancji.
Wartość absorbancji   oznaczyć przy

= 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).

Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu
sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowej
Standardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5
– 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą

↓

Nr .

probówki

Standard

(ml)

10%NaOH

(ml)

6M HCL

(ml)

1% kwas

pikrynowy

(ml)

Łaźnia

Wodna

100

(ml)

„0”

0,5

5 min.

0,1

0,4

0,5

0,2

0,3

0,5

0,3

0,2

0,5

0,4

0,1

0,5

-66-

0znaczyć wartość absorbancji przy

= 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a

następnie: wykreślić krzywą standardową na papierze milimetrowym na podstawie podanego
poniżej przykładu

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas

(t)

( min.)

Stężenie

produktu

(x)

Stężenie

substratu

(a – x)

a-x

Log

a - x

Wykonać sprawozdanie z przeprowadzonych ćwiczeń:

Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu
2. stałą k dla reakcji I rzędu

-67-

13.2 .Enzymy - reakcje barwne

I. Oksydoreduktazy:
Katalaza i peroksydaza
Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w
erytrocytach, a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H

ze środowiska

reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych   form
tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą
(donorem),   zaś   druga   biorcą   (akceptorem   )   elektronów.   Reakcja   utleniania   i   redukcji   przebiega
zgodnie z równaniem
                     H

+ H

→

+ 2H

Peroksydaza występuje  w  erytrocytach, a  także  komórkach  tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym
ten   podobnie   jak   katalaza   uczestniczy   w   usuwaniu   reaktywnych   form   tlenu.   W   reakcjach
katalizowanych   przez   ten   enzym     substratami   oddającymi     elektrony  i   protony  mogą   być   różne
związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru .

+ H

→

A + 2H

13.2.1. Wykrywanie katalazy
Zasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru
po dodaniu kilku kropli krwi

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10
3% H

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej
probówki wlewamy około 1 ml 3% H

.Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie

tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod
kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H

Banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ

enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

13.2.2. Wykrywanie peroksydazy
Zasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z
nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10
CH

COOH

3% H

benzydyna – nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli
3% H

i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

II.Oksydazy
Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i
elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie
komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce
śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi
do powstania wody zgodnie z równaniem:

+ ½ O

→

A + H

-68-

13.2.3.Wykrywanie oksydazy fenolowej
Zasada: enzym ten katalizuje proces utleniania fenolu. Fenol utlenia się najpierw do pirokatcholu, a
następnie do chinonu, który daje pochodne o barwie brązowej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: sok – miąższ ziemniaczany
1% roztwór fenolu

Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie
dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie
brązowe, które z czasem nasila się.

13.2.4. Wykrywanie oksydazy polifenolowej
Zasada: oksydaza polifenolowa katalizuje utlenianie wielofenoli do barwnych chinonów, które dalej
kondensują na pochodne, zabarwione żółto lub brązowo. Z pirogallolu powstaje żółta purpurogallina.
Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym Cu

+2.

. Występuje w wielu warzywach i owocach.

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany
1% roztwór pirogallolu

Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W
wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.

III. Hydrolazy
Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w
wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej.

13.2.5.Rozkład mocznika pod wpływem ureazy.
Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH
7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO

i NH

ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego.

Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy:

CO + H



+ 2NH

→

(NH

)

+ H

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocznik
ureaza
fenoloftaleina

Do probówki wlać 1 ml mocznika ,a następnie dodać 1 ml roztworu urazy oraz 2 krople
fenoloftaleiny. Bezbarwny początkowo roztwór czerwienieje po paru minutach.

-69-

13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę
Zasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy
wiązania pomiędzy

-D-glukopiranozą i

-D-fruktofuranozą w sacharozie, która jest nieredukującym

disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: świeże drożdże
1% roztwór sacharozy
Fehling I i I

Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech
probówek (1,2,3)

Probówka – 1

Probówka - 2

Probówka - 3

1ml zawiesiny drożdży

2 ml sacharozy

2 ml wody

zagotować nad palnikiem

Łaźnia wodna 37

C -2 min

Odstawić do statywu

2 ml sacharozy; odstawić

Reakcja Fehlinga

Reakcja dodatnia

Reakcja Fehlinga
Reakcja ujemna

Reakcja Fehlinga: do probówki wlać 1 ml Fehlinga I i 1ml Fehlinga II oraz 1 ml z zawartość

probówki -1, powtórzyć tę samą czynność z probówkami 2 i 3 . Następnie probówki umieścić we
wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. O obecności cukrów redukujących świadczy pomarańczowo
ceglasty osad. Jest to dodatni wynik reakcji Fehlinga.

Reakcja     i   zabarwienie   pierwszej  probówki   (1)  wskazuje   na   obecność   enzymu  inwertazy   w
drożdżach ponieważ nastąpiła hydroliza sacharozy na cukry proste posiadające własności redukujące.
W probówce drugiej (2)  wykazano ,że  sam roztwór drożdży nie zawiera substancji redukujących
.Reakcja w  próbówce trzeciej (3) wykazała że drożdże posiadają zdolność hydrolizy sacharozy, lecz
enzymy biorące udział w tej reakcji  są nieczynne pod wpływem wysokiej temperatury.

13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta
Zasada: amylaza śliny to enzym zaliczany do hydrolaz (podklasa glikozydazy) jest aktywowana
jonami chlorkowymi. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych typu

-1,4 wewnątrz cząsteczek

łańcucha polisacharydowego skrobi.
Wyróżniamy:

- amylazy

α−

amylaza (endoamylaza dekstrynotwórcza) hydrolizuje cząsteczkę skrobi od środka łańcucha,

rozrywając wiązania

-1-4-glikozydowe z pominięciem

-1-6 glikozydowych. Powstają wówczas

nisko-
cząsteczkowe dekstryny oraz

-maltoza, nie dająca zabarwienia z jodem

β−

amylaza (egzoamylaza dekstyrnotwórcza) hydrolizuje co drugie wiązanie

-1-4 glikozydowe,

począwszy od końca nie aldehydowego, w wyniku czego następuje hydroliza łańcucha skrobi i
powstaje

-maltoza i wysoko-cząsteczkowe dekstryny dające zabarwienie z jodem

Oprócz śliny amylaza występuje również w trzustce.

Za jednostkę wzorcową  aktywności  amylazy przyjmuje się w metodzie Wolghemuta
taką ilość enzymu, które w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn  (nie dających
zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi
Wynik podaje się w ml  1% skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 ml śliny

-70-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5
1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl
0,02 mol/l J

w KJ

ślina

Do probówki wlać 1 ml śliny (nie sączonej), a następnie dodać 4 ml buforu cytrynianowo-
fosforanowego i wymieszać. Uzyskuje się w ten sposób 5-cio krotne rozcieńczenie śliny.
W statywie przygotować 10 probówek, do pierwszej wlać 4 ml przygotowanej mieszaniny (ślina z
buforem) a do następnych po 2 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego. Z probówki pierwszej pobrać
2 ml mieszaniny i przenieść do probówki drugiej (wymieszać!). Z drugiej probówki pobrać 2 ml i
przenieść do probówki trzeciej i wymieszać! itd. Z probówki dziesiątej odrzucić 2 ml roztworu.

Uzyskuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny probówkach:
1 : 5; 1: 10; 1:20; 1 : 40; 1 : 80; 1: 160 itd.
Odpowiadają one następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4 ; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012 ml
itd.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 38

C na 5 minut, po czym do każdej

probówki dodać po 2 ml 1 % roztworu skrobi w 0,9% NaCl. Zawartość probówek bardzo
dokładnie wymieszać!!!!, i wstawić do łaźni wodnej (38

C) na okres 30 minut. Po upływie tego

czasy do każdej probówki wlać po 3 krople J

w KJ.( zacząć dodawać od probówki w której ślina jest

najbardziej rozcieńczona).
Zaobserwować w której probówce reakcja z jodem jest ujemna (stadium dekstryn nie dających
zabarwienia za jodem)
Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 1 % roztworu skrobi
rozłożonej w ciągu 30 minut.

Obliczenie wyników  - przykład
Przypuśćmy , ze stadium dekstryn nie dających zabarwienia z jodem , wystąpił   już w probówce
trzeciej. Ilość skrobi 1% w tej probówce  równa jest 2 ml, czyli w probówce 3-ciej po 30 minutach
nastąpił   rozkład   2-ch   ml   1%   roztworu   skrobi.   Ponieważ   ta   probówka   zawierała   0,1   ml   śliny
otrzymujemy proporcję:

0,1 ml śliny rozkłada po 30 minutach

→

2 ml 1% skrobi

1 ml śliny rozkłada po 30 minutach

→

x ml skrobi

                                       2 ml
                         X    =                         =  20 ml  1 % skrobi
                                      0,1ml

czyli 1 ml śliny rozłożył 20 ml 1% skrobi = 20 mg skrobi w czasie 30 minut.
Aktywność amylazy wynosi więc 20 jednostek.

-71-

13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt
gospodarskich

Fosfatazy   stanowią   w   organizmie     ssaków   grupę   szeroko   rozpowszechnionych   enzymów   które
katalizują   reakcje   hydrolizy   estrów   fosforanowych.   Różnią   się   one   właściwościami
fizykochemicznymi , a przede wszystkim optimum pH, dlatego wyróżnia się fosfatazy kwaśne
(pH 4-6) i zasadowe (pH 8-9). Fosfatazy kwaśne występują w większych ilościach w kościach, jelicie
oraz w  wątrobie. Fosfataza zasadowa występuje w wątrobie , nerkach  a także w śledzionie , łożysku
i erytrocytach. W obrębie komórek fosfatazy znajdują się przede wszystkim w lizosomach, siateczce
śródplazmatycznej, aparacie Goldiego oraz w cytoplaźmie.
Aktywność   fosfataz   oznacza   się   za   pomocą   syntetycznych   substratów   jak   β-glicerofosforan,
fenylofosforan. W zależności od stosowanego substratu oznaczenie aktywności enzymu opiera się
na  określeniu   ilości   uwolnionego   po   hydrolizie   fosforu    (metoda   Bodeńskiego)   lub   ilości
odszczepionego fenolu (metoda Folina Ciocaltou).

W metodzie Bodańskiego fosfatazy surowicy krwi rozkładają β-glicerfosforan na glicerol i
nieorganiczny fosforan. Przebieg reakcji jest następujący:

Zasada: po inkubacji w temp. 37

C w środowisku zasadowym oznacza się ilość odszczepionego

fosforu nieorganicznego. Po dodaniu molibdenianu amonu w środowisku kwaśnym powstaje kwas
fosfomolibdenianowy , który redukuje się . Po dodaniu kwasu 1,2,4 –aminonaftosulfonowego
powstaje związek o niebieskim zabarwieniu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: surowica
KH

(zawiera 8μg fosforu w 1 ml)

0,5% β- glicerofosforan sodu
60% CCL

COOH

2,5% molibdenian amonu
0,25% eikonogen (kwas 1,2,4 –aminonaftosulfonowy)

Sporządzenie krzywe standardowej:



(ml)

Stężenie P w
probówkach

Probówka 1

0,5

2,5

→ 4 μg P /3 ml

Probówka 2

1,0

2,0

→ 8 μg P /3ml

Probówka 3

2,0

1,0

→ 16 μg P/3 ml

Probówka 4

3,0

→ 24 μg P/ 3ml

72-

Ślepa próba odczynnikowa:

Do probówki odmierzyć 500μl H

O , a następnie 4 ml β-glicerofosforanu i 500 μl 60%

CCl

COOH. Po dokładnym wymieszaniu odpipetować 1ml mieszaniny do probówki nr 5

a następnie dodać 2 ml H

Ślepa próba surowicy:
Służy do oznaczenia ilości fosforu występującego w stanie wolny w surowicy.

Do probówki dajemy 500μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu i natychmiast!!!! 500μl
CCl

COOH (w celu przerwania reakcji enzymatycznej). Próbkę przesączamy do kolejnej probówki

a następnie odpipetowujemy 1ml przesączu do probówki nr 6

i dodajemy 2ml H

Właściwe oznaczenie fosfatazy zasadowej w surowicy

Do probówki odmierzyć 500 μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu , a następnie umieścić
probówkę w łaźni wodnej (37

C) na okres 30 minut. Po upływie tego czasu reakcję przerywamy

dodając 500

l CCl

COOH. Następnie próbkę przesączamy. 1ml przesączu odpipetowujemy do

probówki nr 7 i dodajemy 2 ml H

Ustawiamy probówki od 1-7 w statywie i w celu wywołania  reakcji barwnej dodajemy do wszystkich
probówek  800 μl   roztworu molibdenianu amonu i  200 μl eikonogenu.  Bardzo dokładnie próbki
mieszamy  i   pozostawiamy  na  10  minut  w   temperaturze   pokojowej.  Po  tym  okresie   mierzymy
absorbancję  próbek  przy fali o długości λ = 660nm wobec próby  ślepej odczynnikowej

Na   podstawie   odczytanych   wartości   absorbancji     wykreślić   na   papierze   milimetrowym   krzywą
standardową i odczytać ilość μg P znajdującego się w ślepej próbie surowicy i próbie właściwej. Od
ilości fosforu w badanej próbce odjąć wartość uzyskaną  dla ślepej próby surowicy (ilość fosforu
występująca w stanie wolnym  w surowicy).  Różnica odpowiada ilości μg fosforu odszczepionego
czasie inkubacji przez enzymatyczną hydrolizę β-glicerofosfaranu pod wpływem alkalicznej fosfatazy
zawartej w 100μl surowicy

Stwierdzona ilość μg P/ 100 μl surowicy  ilość mg P/ 100ml surowicy = ilość jednostek
Bodeńskiego

Jednostka Bodeńskiego - jest to ilość fosfatazy zasadowej ,która powoduje odszczepienie
1 mg fosforu z β-glicerofosforanu w środowisku o pH 8,6 w ciągu godziny w temp. 37

Document Outline