MATERIAŁY POMOCNICZE DO ĆWICZEŃ

Z „BIOCHEMII ZWIERZĄT”

MARIA MIKA

KRAKÓW 2010

-1-

SPIS TREŚCI

1.Wstępne uwagi praktyczne................................................................................................................4
1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń...........................................................................................................4
1.2. Zasady BHP.................................................................................................................................4

2. Węglowodany.....................................................................................................................................5
2.1. Badanie własności monosacharydów, disacharydów i polisacharydów.....................................12
2.1.1. Reakcja Molischa z

- nafolem........................................................................................12

2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy.....................................................................12
2.2. Wykrywanie pentoz........................................................................................................................13
2.2.1. Próba Biala z orcyną na pentozy......................................................................................13
2.3. Reakcje redukcyjne.....................................................................................................................13
2.3.1. Reakcja Trommera............................................................................................................13
2.3.2. Reakcja Fehlinga..............................................................................................................14
2.3.3. Reakcja Bendedicta...........................................................................................................14
2.3.3. Reakcja Tollensa...............................................................................................................14
2.4. Disacharydy................................................................................................................................15
2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy.............................................................................................15
2.5. Polisacharydy..............................................................................................................................15
2.5.1. Reakcja skrobi z jodem.....................................................................................................16
2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem...............................................................................................17
2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi...................................................................................................17
2.6. Osazony.......................................................................................................................................17
2.7. Identyfikacja cukrów..................................................................................................................19

3. Aminokwasy....................................................................................................................................20
3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów............................................................................21
3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena.....................................................................21
3.1.2. Reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (III)..............................................................22
3.1.3. Reakcja ninhydrynowa.....................................................................................................23
3.1.4. Reakcja dla cysteiny.........................................................................................................23
3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych........................................24
3.1.6. Reakcja dla układu indolowego w tryptofanie................................................................24
3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie......................................25

4. Białka................................................................................................................................................26
4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek.........................................................................................27
4.1.1. Wykazanie amfoterycznego charakteru białek.................................................................27
4.1.2. Zachowanie się białek w obecności kwasów....................................................................27
4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasad.......................................................................27
4.2. Białka jako koloidy.....................................................................................................................27
4.3. Denaturacja białek......................................................................................................................28
4.3.1. Denaturacja cieplna..........................................................................................................29
4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu..................................................................................29
4.3.3. Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego...............................................29
4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów..............................................................................29
4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów...............................................................................30
4.4. Reakcje barwne białek...............................................................................................................30
4.4.4. Reakcja biuretowa............................................................................................................30
4.4.5. Reakcja Libermana...........................................................................................................31
4.5. Oczyszczanie białek metodą dializy...........................................................................................31
4.6. Kolorymetria...............................................................................................................................33
4.6.1. Ilościowe oznaczenie białka w surowicy krwi metodą Lowry’ego..................................35

-2-

5. Kwasy nukleinowe...........................................................................................................................36
5.1. Badanie własności kwasów nukleinowych.................................................................................37
5.1.1. Hydroliza kwasów nukleinowych , badanie produktów hydrolizy...................................37
5.2. Odróżnienie RNA od DNA..........................................................................................................39
5.2.1. Reakcja orcynolowa.........................................................................................................39
5.2.2. Reakcja z difenyloaminą..................................................................................................39

6. Lipidy...............................................................................................................................................40
6.1. Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych.......................................................................41
6.1.1. Rozpuszczalność lipidów.................................................................................................41
6.1.2. Badane składu lipidów prostych – próba akroleinowa....................................................41
6.1.3. Reakcja zmydlania...........................................................................................................42
6.1.4. Wykazane obecności w lipidach prostych nienasyconych kwasów tłuszczowych
– reakcja H

bla................................................................................................................44

6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.....................................................................................44
6.2. Tłuszcze złożone – badanie składu lecytyn...............................................................................44
6.2.1. Wykrywanie glicerolu......................................................................................................45
6.2.2. Wykrywanie kwasów tłuszczowych................................................................................45
6.2.3. Wykrywanie kwasu fosforowego....................................................................................45

7. Cholesterol........................................................................................................................................46
7.1. Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu...............................................................................46
7.1.1. Reakcja Salkowskiego......................................................................................................46
7.1.2. Reakcja Libermana-Burcharda.........................................................................................46

8. Kwasy żółciowe................................................................................................................................47
8.1. Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych.................................................................47
8.1.1. Próba Haya........................................................................................................................47
8.1.2. Emulgujące działanie żółci...............................................................................................47
8.1.3.. Próba Pettenkofera...........................................................................................................47

9. Hormony steroidowe........................................................................................................................48
9.1. Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych..........................................................50
9.1.1. Reakcja Zimmermanna.....................................................................................................50
9.1.2. Reakcja Kobera.................................................................................................................50
9.1.3. Reakcja Portera-Silbera....................................................................................................50
9.1.4. Reakcja z błękitem tetrazoliowym....................................................................................50

10. Hemoglobina...................................................................................................................................51
10.1. Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych..................................................52
10.1.1. Otrzymywanie methemoglobiny....................................................................................52
10.1.2. Otrzymywanie hematyny kwasowej..............................................................................52
10.1.3. Otrzymywanie hematyny zasadowej i hemochromogenu.............................................53

11. Produkty rozpadu hemu...............................................................................................................53
11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych..........................................................55
11.1.1. Próba Gmelina..............................................................................................................55
11.1.2. Próba Rosina.................................................................................................................55
11.1.3. Próba Cole’a..................................................................................................................55
11.1.4. Próba Schlesingera........................................................................................................55

12. Witaminy........................................................................................................................................56
12.1. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie....................................60
12.1.1. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Jensena.............................................60

12.1.2. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Eulera i Adlera.................................60

-3-

12.1.3. Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Greena.........................................................60

12.2. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach................................60
12.2.1. Wykrywanie obecności witaminy A –metoda Carra i Price’a....................................60
12.2.2. Wykrywanie obecności witaminy D

w tranie............................................................61

12.2.3. Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe

..................................................61

12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty............................................................62
12.4. Ilościowe oznaczanie witaminy C w mleku.......................................................................... 62

13. Enzymy..........................................................................................................................................63
13.1. Kinetyka reakcji enzymatycznych.........................................................................................64
13.1.1. Badanie szybkości reakcji I- rzędu i wyznaczanie stałej K na przykładzie
hydrolizy sacharozy...................................................................................................65
13.2. Enzymy reakcje barwne.........................................................................................................67
13.2.1. Wykrywanie katalazy.................................................................................................67
13.2.2. Wykrywanie peroksydazy..........................................................................................67
13.2.3. Wykrywanie oksydazy fenolowej..............................................................................68
13.2.4. Wykrywane oksydazy polifenolowej.........................................................................68
13.2.5. Rozkład mocznika pod wpływem ureazy...................................................................68
13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę.........................................................................69
13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta.....................69
13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt
gospodarskich.............................................................................................................71

-4-

1. WSTĘPNE UWAGII PRAKTYCZNE

1.1. Wprowadzenie do ćwiczeń:

•

Obecności

- student obowiązany jest być na wszystkich zajęciach, w wyjątkowej sytuacji

może mieć 2 nieobecności podczas całego roku akademickiego – usprawiedliwione ( nie
ma możliwości odrobienia ćwiczeń).

•

Warunki zaliczenia

– warunkiem otrzymania zaliczenia jest otrzymanie pozytywnych ocen z

kolokwiów obejmujących zakres materiału ćwiczeń , obecności i aktywność studenta na
zajęciach. Student który nie otrzymał zaliczenia w pierwszym terminie, może otrzymać
zaliczenie w terminach poprawkowych ustalonych przez prowadzącego ćwiczenia.

•

Uwaga

!! – Na wszystkich ćwiczeniach konieczne jest posiadanie fartucha ochronnego.

W przypadku jego barku student nie zostanie wpuszczony na salę ćwiczeń.

1.2. Zasady BHP:

1. Laboratorium chemiczne jest miejscem pracy w którym należy zachowywać się w sposób
odpowiedzialny i poważny.
2. W laboratorium znajdują się płyny żrące , łatwo palne , trujące , barwiące, dlatego należy
pracować w fartuchu ochronnym.
3. Na stołach laboratoryjnych znajdują się zestawy odczynników które są dokładnie opisane. Przed
opuszczeniem sali trzeba sprawdzić , czy wszystkie odczynniki znajdują się na swoim miejscu.
4. Korzystając z odczynników , należy pamiętać iż otwierając butelkę trzeba odłożyć korek tak ,aby
nie zabrudzić stołu. Po użyciu odczynnika butelkę zamknąć korkiem i odstawić na właściwe
miejsce.
5. Nie wolno używać tej samej pipety szklanej lub końcówki pipety automatycznej do różnych
roztworów. Nie wlewać raz pobranego roztworu ponownie do butelki.
6. Należy starannie usunąć rozlane na stół lub podłogę odczynniki.
7. Przy ogrzewaniu cieczy nad palnikami należy zwrócić uwagę na ustawienie probówki pod
odpowiednim kątem i zachować bezpieczeństwo pracy.
8. Odczynniki stężone i żrące znajdują się pod digestorium. Podczas pracy z nimi należy zachować
szczególną ostrożność i zabezpieczyć się , stosując opuszczoną szybę wyciągu. Wszystkie
odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie , szczególnie dla oczu oraz błon śluzowych jamy ustnej i
nosa.
9. Nie wolno pipetować ustami stężonych kwasów, zasad, bromu i roztworów cyjanków.
Posługujemy się w tym celu pipetami zaopatrzonymi w gruszki gumowe, pipetami automatycznymi,
lub biuretami.
10. Żadnej substancji nie bada się smakiem.
11. W wypadku oparzenia się kwasem , należy natychmiast przemyć skórę roztworem węglanu
amonu lub węglanu sodu. W wypadku poparzenia się zasadą - przemyć skórę rozcieńczonym
roztworem kwasu octowego, a następnie spłukać wszystko wodą.
12. W razie dostania się kwasu lub zasady do ust - natychmiast przepłukać je duża ilością wody , a
następnie wymienionymi w p. 11 roztworami. W przypadku połknięcia roztworu kwasu lub zasady -
wypić dużą ilość mleka lub wody z surowym białkiem jaja.
13. Jeżeli jakiś płyn dostanie się do oka ,natychmiast należy przemyć go dużą ilością wody.
14. Każdy wypadek np. poparzenia lub skaleczenia należy zgłosić osobie prowadzącej ćwiczenia.
15. Wiele odczynników stosowanych w laboratorium biochemicznym jest truciznami , często więc
należy myć ręce, a bezwzględnie przed opuszczeniem laboratorium.
16. Po wykonaniu ćwiczeń laboratoryjnych i sprawdzeniu ich przez osobę prowadząca ćwiczenia
zawartość probówek wylewa się do specjalnie przygotowanych pojemników ,nigdy do zlewu!
17. Przed opuszczeniem laboratorium sprawdź czystość i porządek na swoim stanowisku pracy.

-5-

2. WĘGLOWODANY.

Węglowodany ( cukry, sacharydy ) powstają w procesie fotosyntezy w komórkach roślin
zielonych i stanowią główne źródło energii.
Ze względu na wielkość cząsteczki można je podzielić na :

•

monosacharydy ( cukry proste i ich pochodne)

•

oligosacharydy (2,3 lub więcej do 6 cukrów prostych połączonych wiązaniami
o-glikozydowym

•

polisacharydy ( polimery o dużej masie cząsteczkowej zawierające dużą liczbę reszt
monosacharydów)

MONOSACHRYDY

- cukry proste o wzorze ogólnym C

to wielowodorotlenowe aldehydy lub

wielowodorotlenowe ketony . Stąd, jeśli posiadają grupę aldehydową (-CHO) nazywamy je
aldozami, a jeśli grupę ketonową (-C=O) to ketozami.
Natomiast w zależności od liczby atomów węgla w cząsteczce cukru prostego dzielimy je na:

Aldozy (grupa –CHO przy C

) Ketozy ( grupa –C=O przy C

)

Triozy

←

→

Tetrozy

←

→

terulozy

Pentozy

←

→

pentulozy

Heksozy

←

→

heksulozy

Szereg aldoz

-6-

Szereg ketoz

Cukry proste tworzą dwa szeregi konfiguracyjne D i L przy czym cukry które naturalne występują
w przyrodzie głównie należą do szeregu D. Przynależność danego cukru do szeregu D lub L zależy
od konfiguracji grupy OH i H przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla tj. C

dla pentoz i C

dla

heksoz. Węgiel asymetryczny to taki węgiel który posiada cztery różne podstawniki (w postaci
atomów lub grup atomów).

-7-

Jeżeli grupa alkoholowa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest po stronie prawej to taki
cukier należy do szeregu D , jeśli jest po stronie lewej do szeregu L.

Formy D i L cukrów są izomerami optycznymi zwanymi enancjonomerami czyli odbiciami
lustrzanymi. Tak więc izomeria D i L to izomeria lustrzana.
.

Od ilości węgli asymetrycznych w cząsteczce cukrów zależy ilość jego odmian optycznych tzw.
stereoizomerów. Zgodnie z regułą La Bel-Van’t Haffa przy „n” asymetrycznych węgla istnieje 2

odmian stereoizomerów. np. 2

= 2 (triozy), 2

= 4 (terozy) itd.

Obecność węgli asymetrycznych nadaje również cukrom zdolność optyczną skręcania płaszczyzny
światła spolaryzowanego (monochromatycznego) , które przechodzi przez dany monocukier lub jego
roztwór. Jeśli cukier skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w prawo to jest to forma (+) ,
gdy w lewo (-). Prawo – lub lewoskrętność danego związku zależy od asymetrii wszystkich grup
alkoholowych (OH) natomiast przynależność do szeregu D lub L od asymetrii tylko jednej grupy
alkoholowej, która znajduje się przy ostatnim węglu asymetrycznym tj. węglu C

w pentozach i C

heksozach.

Aldehyd D- glicerynowy Aldehyd L- glicerynowy

Oznacza to, że przynależność monosacharydu do szeregu D lub L nie pozostaje w żadnym
związku z jego prawo- lub lewoskrętnością i dlatego istnieją cukry należące do szeregu D, które
skręcają płaszczyzną światła spolaryzowanego w lewo np. D-fruktoza (-92,3

Cechą charakterystyczna cukrów prostych jest zdolność tworzenia form cyklicznych
(pierścieniowych) w środowisku obojętnym lub słabo kwaśnym. Podczas cyklizacji powstaje nowy
węgiel asymetryczny przy C

w aldozach i C

w ketozach , przy czym cukry mogą cyklinować w

formy piranozowe lub furanozowe.

piran furan

Podczas cyklizacji powstaje wiązanie półacetalowe tj mostek tlenowy :

- w przypadku aldoz mostek tlenowy powstaje między: C

- C

(forma piranozowa)

– C

(forma furanozowa)

- w przypadku ketoz mostek tlenowy powstaje między: C

– C

(forma piranozowa)

- C

(forma furanozowa)

-8-

Nowopowstały węgiel asymetryczny C

w aldozach i C

w ketozach nosi nazwę węgla

anomerycznego, a zachodzące zjawisko anomerii. Utworzenie nowego węgla daje możliwość
różnego ułożenia podstawników tj. grupy OH i H przy tym węglu, powstają więc anomery

Anomer

- występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy

ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji cis tj. po tej samej stronie cząsteczki.

Anomer

- występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy

ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji trans tj. po przeciwnych stronach cząsteczki

Cyklizacja monosacharydów

Tworzenie formy piranozowej przez glukozę:

Przy przepisywaniu wzoru Fishera na pierścień wszystkie

grupy OH

będące po

prawej stronie

wzorze Fishera idą

pod pierścień

, a będące po stronie

lewej nad pierścień.!!!

Wzór łańcuchowy -Fishera

Wzór pierścieniowy (taflowy) Howortha

2. Tworzenie formy furanozowej przez fruktozę:

-9-

Wiele monosacharydów różni się między sobą jedynie przestrzennym ułożeniem atomów – są to
izomery . Na przykład glukoza, galaktoza, mannoza maja identyczny wzór sumaryczny , ale różnią się
przestrzennym ułożeniem grup OH i atomów wodoru przy jednym lub dwóch atomach węgla

Te niewielkie różnice konfiguracji mają jedynie znikomy wpływ na właściwości chemiczne tych
cukrów.

Pochodne monosacharydów

1. Estry cukrów:

Reszta fosforanowa -PO

(w poniższych wzorach przedstawiana będzie jako P) może być

przyłączana przy C

, C

lub C

i C

O - P

-D-glukopiranozo-6-fosforan

-D-glukopiranozylo-1-fosforan

-D-glukopiranozylo-1,6-bisfosforan

Aminocukry : wchodzą w skład wielocukrów . W połączeniu z białkami decydują o

swoistości antygenowej komórek i tkanek.

-10-

Kwasy cukrowe dzielimy je na:

•

Jednokarboksylowe :

Aldonowe – utlenienie do grupy COOH przy C

(kwas glukonowy, manannowy,

galaktanowy)

Uronowe – utlenienie końcowej grupy alkoholowej do COOH przy C

(kwas

glukuronowy, mannouronowy, galaktouronowy)

•

Dwukarboksylowe:

aldarowe , utlenienie obu skrajnych węgli C

i C

do COOH ( kwas

glukarowy mannarowy, galaktarowy)

OLIGOSACHRYDY

To związki których cząsteczki powstają przez połączenie od dwóch do dziesięciu reszt
monosacharydów wiązania o-glikozydowymi. W grupie tej najważniejsze są disacharydy (dwucukry).

Powstanie wiązania glikozydowego pomiędzy dwoma monosacharydami.

-11-

Własności disacharydów zależą od sposobu powiązania monosacharydów. Jeżeli dwa monosacharydy
wytworzą wiązanie o-glikozydowe między węglami anomerycznymi to takie disacharydy nie mają
właściwości redukujących , nie tworzą osazonów ( form krystalicznych) i nie wykazują mutarotacji
(zmiana skręcalności właściwej cukrów spowodowana przechodzeniem formy

aż do ustalenia

między nimi stanu równowagi) gdyż ich grupy aldehydowe lub ketonowe są zablokowane.

Disacharydem nie redukującym jest

sacharoza :

Jeżeli między dwoma monosacharydami powstaje wiązanie o-glikozydowe przy udziale jednego
hydroksylu półacetalowego to takie disacharydy maja właściwości redukujące , tworzą osazony i
wykazują mutarotację są to np. maltoza i laktoza

POLISACHARYDY

Są polimerami o dużej masie cząsteczkowej , zawierające dużą liczbę reszt monosacharydów .
Polisacharydami są takie produkty roślinne jak: celuloza, skrobia , oraz wielocukier występujący w
organizmach zwierzęcych – glikogen. Ze względu na budowę chemiczną polisacharydy można
podzielić na homoglikany (wielocukry jednoskładnikowe) i heteroglikany (wielocukry
wieloskładnikowe).

-12-

2.1. Badanie właściwości monosacharydów, disacharydów i polisacharydów

Reakcje charakterystyczne

Cukry proste (monosacharydy) , zarówno aldozy jak i ketozy , ogrzewane ze stężonymi kwasami
solnym lub siarkowym ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów , przy czym z pentoz
powstaje furfural (aldehyd furylowy) natomiast z heksoz 5-hydroksymetylofurfural (aldehyd 5-
hydroksymetylofurylowy) zgodnie z podanymi reakcjami:

Oprócz wolnych monosacharydów reakcję te dają także monosacharydy powstające w wyniku
hydrolizy z disacharydów oraz z polisacharydów zarówno wolnych jak i występujących w połączeniu
z innymi związkami. Furfural oraz 5-hydroksymetylenofurfural mogą kondensować z fenolami i
aminami aromatycznymi lub ich pochodnymi takimi jak

-naftol, antron i tymol oraz floroglucyna,

orcyna i rezorcyna.
Do celów analitycznych stosuje się następujące reakcje oparte na powyższej zasadzie:

2.1.1 Reakcja Molischa z

- naftolem

Zasada: jest to najbardziej ogólna reakcja na cukry zarówno wolne jak i związane. Ujemny jej wynik
wyklucza obecność cukru, dodatni zaś nie zawsze jest wystarczający do jego stwierdzenie ponieważ
podobną reakcję dają np. aldehydy ,acetony .Zasada próby polega na powstaniu czerwono-
fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z

- naftolem.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy
10% etanolowy roztwór

-naftolu

– stężony

Do 1ml roztworu glukozy dodać 1-2 kropli świeżo sporządzonego 10% etanolowego roztworu

naftolu. Po dokładnym zmieszaniu , bardzo ostrożnie! po ściance probówki wprowadzić 1 ml
stężonego roztworu H

tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia

się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Pierścień zielony określa negatywną reakcję
. Dla porównania przeprowadzić reakcję z wodą!

2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy
Zasada: W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylofurfural, powstający dużo
łatwiej z ketoz niż z aldoz pod wpływem działania kwasu solnego. Próba ta pozwala więc na
odróżnienie ketoz od aldoz ponieważ w obecności rozcieńczonego roztworu HCL tylko ketozy
ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w temp.100

C przez 30 sekund

Wykonanie oznaczenia :
Odczynniki : roztwór fruktozy
roztwór glukozy
odczynnik Seliwanowa (0,05%roztwór rezorcyny w 25%HCL)

-13-

Do dwóch probówek dać 1 ml odczynnika Seliwanowa. Do pierwszej dodać 2 krople roztworu
fruktozy a,do drugiej 2 krople glukozy. Po dokładnym zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej.
Wyjąć obie probówki po 30 sekundach i porównać zabarwienie. W obecności ketozy w ciągu 30
sekund powstaje czerwone zabarwienie. Roztwory aldoz krótko ogrzewane nie ulegają
zabarwieniu. Zabarwienie może wystąpić po dłuższym ogrzewaniu .

2.2. Wykrywanie pentoz

2.2.1 Próba Biala z orcyną na pentozy
Zasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną
kompleks o barwie zielonej

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór pentozy (np. ksylozy, rybozy)
0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
1% FeCl

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl

i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić

do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla
porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie )

2.3. Reakcje redukcyjne
W środowisku zasadowym formy pierścieniowe cukrów przekształcają się w formy łańcuchowe z
odtworzeniem wolnych grup aldehydowych lub ketonowych. Grupy te nadają cząsteczkom cukru
własności redukcyjne. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa lub ketonowa redukuje
niektóre jony metali ciężkich Szczególnie łatwo redukują jony metali takich jak : Cu

, Bi

+2,

Ponieważ w środowisku zasadowym wodorotlenki tych metali wytrącają się w postaci koloidalnych
osadów, co nie pozwala na wykazanie redukcyjności cukrów zwykle wprowadza się związki
organiczne (winian sodowo-potasowy), które z wodorotlenkami metali ciężkich tworzą
rozpuszczalne kompleksy. Na wskutek dysocjacji takiego kompleksu w roztworze pojawiają się jony

metali , które mogą ulec redukcji przez cukier redukujący. W reakcjach tych cukrowiec ulega
utlenieniu, przy czym produktu utlenienia są rozmaite w zależności od przebiegu reakcji.

2.3.1. Reakcja Trommera
Zasada: Próba ta polega na redukcji przez cukier jonu miedzi Cu

do Cu

Przebiega ona w

podwyższonej temperaturze w środowisku alkalicznym. Jeżeli ogrzewamy wodorotlenek miedzi w
roztworze alkalicznym to przechodzi on w czarny nierozpuszczalny tlenek miedzi (I) zgodnie z
reakcją:

CuSO

+ 2NaOH

→

Cu(OH)

+ Na

Cu(OH)

→

CuO + H

czarny osad

W obecności cukru-związku redukującego reakcja ta przebiega odmiennie:

2Cu(OH)

→

O + 2H

O + 1/2O

osad czerwony
Powstają nierozpuszczalne kryształki tlenku miedzi (I) , które w zależności od swojej wielkości
posiadają barwę od żółtej przez pomarańczową do czerwonej. Reakcja ta jest bardzo czuła i pozwala
wykryć nawet ślady cukrów.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy (lub innego monosacharydu)
1M NaOH
0,2 N CuSO

Do 2 ml glukozy dodać 5 kropli 1M NaOH i kroplami 0,2N CuSO

aż do momentu pojawienia się

osadu Cu(OH)

(należy unikać nadmiaru siarczanu miedzi gdyż wytrąca się czarny tlenek miedzi (II)

maskujący właściwą barwę). Po podgrzaniu we wrzącej łaźni wodnej około 5 minut wytrąca się
pomarańczowo- czerwony osad Cu

O . Dla porównania reakcję wykonać na wodzie .

-14-

2.3.2 Reakcja Fehlinga
Zasada: jest to zmodyfikowana reakcja Trommera, w której zastosowano winian sodowo-potasowy
(sól Seignetta) jako odczynnik zapobiegający wytrącaniu się jonów Cu

+2.

tworzy on z jonami Cu

sól

kompleksową. W ten sposób nadmiar nie zredukowanych jonów Cu

pozostaje w roztworze nie

przechodząc w czarny tlenek miedzi (II) CuO. Dalszy przebieg reakcji jest identyczny jak w
przypadku reakcji Trommera.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór glukozy
Fehling I (roztwór CuSO

)

Fehling II (NaOH + winian sodowo-potasowy)

Do probówki wlać około 2 ml glukozy oraz 1 ml Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II . Zawartość
probówki bardzo dokładnie wymieszać, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez
około 10 minut dla uzyskania czerwono- pomarańczowego osadu tlenku miedzi (I) Cu

O. Dla

porównania przeprowadzić reakcją na wodzie.

2.3.3.Reakcja Benedicta
Zasada: Podobnie jak w próbach Tromera i Fehlinga w tej reakcji redukcji ulegają jony Cu

do Cu

pod wpływem cukru. Odczynnikiem utrzymującym jony Cu

w roztworze jest cytrynian

sodowy ,pełniący rolę soli Seignetta

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:roztwór glukozy
odczynnik Benedicta(CuSO

+ Na

bezw. + cytrynian sodu)

Do około 2 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropli glukozy, wymieszać i ogrzać na łaźni wodnej
3 – 5 minut. Po oziębieniu wytrąca się czerwono-pomarańczowy osad tlenku miedzi (I) Cu

Dla porównania przeprowadzić reakcję na wodzie.

2.3.4 Reakcja Tollensa
Zasada:Redukcja soli srebra do srebra metalicznego w środowisku alkalicznym , w obecności
wolnych grup aldehydowych lub ketonowych cukrów. Reakcja przebiega następująco:

AgNO

+ NH

→

AgOH + NH

AgOH + 2NH

→

Ag(NH

)

2Ag(NH

)

OH + R-CHO

→

2Ag + R- COONH

+ NH

+ H

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki:roztwór glukozy (lub innego cukru)
roztwór azotanu srebra
amoniak

Do suchej i czystej probówki wlać 0,5 ml roztworu azotanu srebra , a następnie dodawać po kilka
kropli amoniaku, aż powstający osad AgOH rozpuści się w nadmiarze. Do powstałej soli
kompleksowej dodać 2 ml glukozy lub innego cukry redukującego i po wymieszaniu umieścić
probówkę we wrzącej łaźni wodnej . Po około 10 minutach wydzieli się na ścianach probówki
metaliczne srebro w postaci lustra.

-15-

2.4. Disacharydy

Disacharydy (dwucukry) składają się z dwóch cząsteczek cukrów prostych połączonych wiązaniem
o- glikozydowym. Wiązanie glikozydowe nie odznacza się dużą trwałością szczególnie w obecności
jonów wodorowych. Hydrolizę wiązania glikozydowego można bardzo łatwo przeprowadzić pod
wpływem kwasów, lub enzymatycznie. Enzymy katalizujące tę reakcje odznaczają się dużą
specyficznością działania , zależną nie tylko od rodzaju składników ale i również od typu wiązania
glikozydowego (

Powszechnie występującym disacharydem jest sacharoza popularny cukier spożywczy, który
otrzymuje się na skale przemysłową z trzciny cukrowej i buraków cukrowych. Disacharyd ten
utworzony jest przez reszty glukozy i fruktozy połączone anomerycznymi atomami węgla.
Hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy katalizuje sacharaza nazywana również inwertazą.

2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy
Zasada: pod wpływem kwasów mineralnych sacharoza ulega rozpadowi na glukozę i fruktozę.
Rozpad sacharozy zachodzi również wpływem enzymu - inwertazy.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór sacharozy
2M H

2M NaOH

Odmierzyć 20 ml sacharozy do erlemajerki i dodać 6 ml 2M H

Roztwór w zlewce podgrzać do

wrzenia i gotować przez 3 minuty. Po ostudzeniu zobojętnić 2 M NaOH , kontrolując proces
zobojętnienia papierkiem lakmusowym. Na produktach hydrolizy wykonać reakcję Fehlinga.

(str

14)

2.5. Polisacharydy

Polisacharydy (wielocukry) należą do związków organicznych najobficiej występujących w
przyrodzie. Są one produktami polikondensacji monosacharydów połączonych wiązaniami
glikozydowymi. Sumaryczny wzór wielocukrów jednoskładnikowych można wyrazić jako:
M

[

(n-1)H

]

, gdzie M oznacza dowolny monosacharyd , zaś n - liczbę jego cząsteczek. Masa

cząsteczkowa polisacharydów waha się w szerokich granicach tj. od kilku tysięcy do kilku milionów.
Ze względu na budowę chemiczną polisachrydy można podzielić na homoglikany (jednoskładnikowe:
np. skrobia, glikogen, celuloza) i heteroglikny (wieloskładnikowe: np. chondroityna, heparyna, kwas
hialuronowy).
Roślinną substancja zapasową jest skrobia składająca się z amylozy i amylopektyny. Amyloza nie ma
rozgałęzień i jest zbudowana z reszt glukozy połączonych wiązaniami

-1,4-glikozydowymi.

Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi, w której na jedno wiązanie

-1,6-glikozydowe

przypada około trzydzieści wiązań

-1,4- glikozydowych. Połowę węglowodanów spożywanych

przez ludzi stanowi skrobia. Zarówno amylopektyna jak i amyloza są hydrolizowane przez

-amylazę

wydzielaną przez gruczoły ślinowe i przez trzustkę.
Komórki zwierzęce magazynują glukozę w postaci glikogenu. Glikogen jest rozgałęzionym
polimerem o dużej masie cząsteczkowej , zbudowanym z reszt glukozy. Większość reszt glukozy jest
w glikogenie połączona wiązaniami

-1,4-glikozydowymi. Rozgałęzienia powstają w miejscach

wiązań

-1,6- glikozydowych występujących przeciętnie co dziesięć reszt glukozy.

Bardzo ważnym polisacharydem roślinnym jest celuloza pełniąca funkcje strukturalne , a nie
odżywcze. Jest ona nie rozgałęzionym polimerem reszt glukozy , połączonych wiązaniami

-1,4-

glikozydowymi. Konfiguracja

pozwala celulozie na tworzenie bardzo długich , prostych łańcuchów.

-16-

2.5.1.Reakcja skrobi z jodem
Zasada: Cząsteczki jodu wchodzą „do kanału” utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy
polisacharydu i są „przytrzymywane” przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej
cząsteczki glukozy . Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu , wzdłuż którego mogą przesuwać się
elektrony , co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Skrobia na wskutek adsorbcji
cząstek jodu barwi się na kolor niebieski.

Wiązanie

1,6-glikozydowe

Miedzy dwiema resztami glukozy

Wiązanie

1,4-glikozydowe między dwiema

resztami glukozy

Barwa kompleksu zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza daje z
jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna - fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie
jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem . Musi istnieć konfiguracja helisu, aby cząsteczki jodu
mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na 6 reszt glukozydowych czyli
na jeden skręt helisu co jest przyczyną znikania zabarwienia z jodem

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki:kleik skrobiowy
J

w KJ

1M NaOH
2 M HCL

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu J

w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie.

Probówkę w której powstała niebieska barwa ogrzać - niebieskie zabarwienie znika. Po
ochłodzeniu pod wodą zabarwienie powraca.

-17-

1. Wpływ zasad na zabarwienie z jodem.
W środowisku zasadowym zabarwienie nie powstaje ponieważ jod reaguje z zasadą według
równania:

+ 2NaOH

→

NaJ +Na JO + H

2. W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:
NaJO + NaJ + 2HCL

→

2NaCL + J

+ H

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1M roztworu NaOH i kroplę roztworu jodu w KJ.
Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym (2M HCL), barwa pojawia się.

2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem

Odczynniki: roztwór glikogenu
J

w KJ

Do roztworu glikogenu (1ml) dodać dwie krople J

w KJ. Powstaje jasno-czerwonobrunatne

zabarwienie.

2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi:
Zasa

da:

skrobia pod wpływem kwasów lub enzymów (

amylazy) ulega hydrolizie do dwucukru

maltozy poprzez stadium dekstryn.

Skrobia

→

skrobia rozpuszczalna

→

dekstryny

→

maltoza

W czasie hydrolizy skrobi tworzą się najpierw dekstryny o dużej cząsteczce - amylodekstryny
(zabarwienie z jodem -fioletowe), które ulegają dalszemu rozkładowi na erytrodekstryny

(zabarwienie z jodem- czerwone). Powstałe przy dalszej hydrolizie achrodekstryny nie dają
zabarwienia z jodem. Produktem końcowym jest maltoza.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kleik skrobiowy
2N H

w KJ

Do kolbki odmierzyć 30 ml kleiku skrobiowego dodać 12 ml 2N H

, ogrzewać do wrzenia na

płytce nad palnikiem. W statywie umieścić 10 probówek z dwoma kroplami J

w KJ. Od chwili

zagotowania skrobi należy zmniejszyć płomień palnika i pobierać z kolbki (która cały czas znajduje
się na płytce) co 1 minutę po około 1ml gotującej skrobi i wlewać ją do kolejnych przygotowanych w
statywie probówek z jodem. Po rozcieńczeniu próbek wodą (10 ml) przy prawidłowo wykonanej
hydrolizie otrzyma się skalę barw od ciemnoniebieskiej poprzez fioletową, czerwoną do
bezbarwnej - odpowiada to poszczególnym stadiom rozkładu skrobi.

2.6. Osazony

Monosachardy , zarówno aldozy jak i ketozy oraz disacharydy redukujące reagują z aminami np.
z fenylohydrazyną. W pierwszym etapie kondensacji z fenylohydrazyną powstają fenylohydrazony,
które następnie utleniają się w przypadku aldoz do ketofenylohydrazonów zaś ketozy do
aldofenylohydrazonów. Powstałe związki kondensują z kolejną cząsteczką fernylohydrazyny, co
prowadzi ostatecznie do wytworzenia difenylohydrazonów czyli osazonów , niezależnie od tego czy
cukrowcem była aldoza czy ketoza. Na tym etapie reakcja zatrzymuje się na wskutek powstania
chelatowego wiązania między atomami azotu obydwóch reszt fenylohydrazyny. Wytrąca się żółty
osad o charakterystycznych kształtach. Reakcja przebiega według równania:

-18-

Na podstawie tej reakcji nie można jednak rozróżnić monosacharydów epimerycznych . Różnią się
one bowiem ułożeniem podstawników tylko przy dwóch kolejnych (C-1i C-2) atomach węgla w
cząsteczce, przy których zachodzi właśnie reakcja kondensacji z fenylohydrazyną. Do takich heksoz
należy glukoza , fruktoza i mannoza. Proces enolizacji umożliwiający zamianę tych heksoz , zachodzi
w środowisku rozcieńczonych wodorotlenków następuje etapami i jest odwracalny. Otwarcie formy

pierścieniowej i przesunięcie równowagi w kierunku postaci łańcuchowej poprzez jego formę
enolową, prowadzi do wytworzenia cukrów epimerycznych. Enolizacja niweluje więc różnice
konfiguracji podstawników przy atomach C-1, C-2 , stąd osazony tych cukrowców mają identyczne
kryształy. Żółto zabarwione kryształy osazony poszczególnych mono- i disacharydów różnią się
temperaturą topnienia i kształtem kryształów co pozwala je łatwo identyfikować pod
mikroskopem

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : roztwory cukrowców
mieszanina - chlorowodorek fenylohydrazyny + krystaliczny octan sodu (1:2)

Do 10 ml roztworu cukrowca dodać szczyptę mieszaniny- (chlorowodorek fenylohydrazyny
i krystaliczny octanu sody ).Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 45 minut.
Po upływie tego czasu mieszaninę oziębić i oglądać utworzone osazony pod mikroskopem.

-19-

2.7. Identyfikacja cukrów

Korzystając z poprzednio wykonanych reakcji można zidentyfikować nieznany cukier. Postępuje się
według niżej przedstawionego schematu:

Osazon glukozy, mannozy i fruktozy

Osazon laktozy

Osazon maltozy

-20-

3. AMINOKWASY

Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Zbudowane są z grupy
karboksylowej , aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej grupy R (łańcuch boczny
aminokwasu), która wiąże się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel

. Ten atom

węgla nazwano

ponieważ sąsiaduje on z grupą karboksylową. W roztworach wodnych aminokwasy

występują tylko w znikomej ilości (0,1%) jako cząsteczki elektrycznie nie- naładowane , natomiast w
ogromnej większości są jonami. Jony te zależnie od oddziaływania środowiska mogą mieć charakter

r. Fehlinga (+)
(sacharoza)

kwasowy bądź zasadowy. W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton i staje się
kationem. Natomiast w środowisku zasadowym oddaje proton i zachowuje się jak anion.
W środowisku o pH obojętnym aminokwasy występują w formie zjonizowanej jak jony obojnacze
(jony dwubiegunowe) Aminokwas w postaci jonu obojnaczego ma protonową grupę aminową (NH

)

oraz zjonizowana grupę karboksylową (COO

)





COOH H



COO



R R
aminokwas jon dwubiegunowy
postać niezjonizowana ( obojnaczy , dipol aminokwasu)

Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu .W roztworze kwaśnym
(np. pH 1) cofa się dysocjacja grupy karboksylowej – staje się ona niezjonizowana (COOH) , a
zjonizowana pozostaje grupa aminowa (NH

) W roztworze zasadowym(np. pH 11) zjonizowana jest

grupa karboksylowa (COO

),a niezjonizowana - grupa aminowa (NH

)





COOH H



COO



COO



R R

forma przeważająca forma przeważająca forma przeważająca
w pH 1 w pH 7 w p H 11

Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) zawierają cztery różne podstawniki wokół węgla

(węgiel połączony z grupą karboksylową) . Ich steroizomery, należące do szeregu D lub L, są
optycznie czynne. W białkach występują tylko L-aminokwasy, a jonizacji ulegają jedynie grupy w
łańcuchach bocznych



R aminokwasów oraz końcowa grupa aminowa i karboksylowa, ponieważ

pozostałe grupy karboksylowe i aminowe są zablokowane wiązaniem peptydowym (



CO-NH



). Ze

wzglądu na to , że łańcuch boczny aminokwasu może posiadać ładunek ujemny lub dodatni, wyróżnia
się aminokwasy obojętne, kwaśne i zasadowe Ponadto wchodzące w skład białek aminokwasy, mogą
zawierać w łańcuchu bocznym niepolarne grupy hydrofobowe bądź polarne reszty hydrofilowe, które
nie ulegają jonizacji lub mogą dysocjować tylko przy odpowiednim pH roztworu.. Różne łańcuchy
boczne aminokwasów sprawiają, że związki te wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne.
Aminokwasy mają różną wielkość i różny charakter kwasowo-zasadowy.
W obrębie aminokwasów wchodzących w skład białek tradycyjnie wyróżnia się dwie grupy . Do
pierwszej z nich należą aminokwasy niepolarne, które mają boczny łańcuch alifatyczny (glicyna,
alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina) lub pierścień aromatyczny (fenyloalaniana,
tyrozyna, tryptofan). Do tej grupy zalicza się także prolinę hydrofobowy iminokwas zawierający
drugorzędową grupę iminową.
W obrębie drugiej grupy znajdują się aminokwasy polarne, które w łańcuchu bocznym mają grupę
hydroksylową niejonizującą w warunkach fizjologicznych (pH ok. 7,4), ale uczestniczącą w
tworzeniu wiązań wodorowych (seryna, treonina i tyrozyna) oraz nie jonizująca grupę sulfhydrylową
- cysteina, która może tworzyć wiązanie dwusiarczkowe z inną resztą cysteiny. Z kolei aminokwasy
dikarboksylowe (kwas asparaginowy i glutaminowy) zawierające dodatkową jonizującą grupę
karboksylową oraz aminokwasy diaminowe (arginina, lizyna, histydyna) mające dodatkowo
jonizującą grupę aminową , biorą udział w oddziaływaniach elektrostycznych.

-21-

W warunkach fizjologicznych łańcuch boczny wymienionych aminokwasów może być naładowany
ujemnie lub dodatnio. Ponadto aminokwasy z polarnym łańcuchem bocznym, ale nie posiadającym
ładunku, mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych w obrębie cząsteczki białka
(asparagina - amid kwasu asparaginowego oraz glutamina - amid kwasu glutaminowego).

3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów można podzielić na dwa typy. Pierwsze z nich to
reakcje wspólne dla wszystkich aminokwasów. Wynikają one z występowania grup funkcyjnych:
karboksylowej i aminowej. Z kolei reakcje specyficzne dla poszczególnych aminokwasów wiążą się
z występowaniem charakterystycznego układu w łańcuchu bocznym na przykład grupy
hydroksylowej –OH lub sulfhydrylowej –SH, reszty fenylu lub fenolu, bądź układu indolowego,
imidazolowego czy guanidynowego. Reakcje te pozwalają na odróżnienie niektórych aminokwasów.
Zależnie od charakteru bocznego łańcucha poszczególne aminokwasy tworzą różne barwne
pochodne.

3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena
Zasada.Podczas miareczkowania aminokwasu , np.glicyny roztworem NaOH , z grupy aminowej



aminokwasu dysocjują jony H

. Wiążą się one z jonami OH

, tworząc słabo zdysocjowane

cząsteczki wody , zgodnie z równaniem:

COO





H + OH

→



H + H



R R

Odszczepienie protonów od wszystkich grup amoniowych



zachodzi dopiero przy wartościach

pH roztworu powyżej 12. Bark odpowiednich wskaźników alkacymetrycznych, które zmieniłyby
barwę w tym zakresie pH sprawia że uchwycenie końcowego punktu miareczkowania jest bardzo
trudne, a najczęściej nawet niemożliwe. Jeżeli podczas miareczkowania stosuje się fenoloftaleinę, to
zmiana barwy tego wskaźnika następuje wcześniej niż zostanie osiągnięty punkt równoważnikowy.
Zatem dla ilościowego oznaczenia aminokwasu (glicyny) grupa



musi być zablokowana.

-22-

W tym celu do roztworu aminokwasu dodaje się aldehyd mrówkowy (grupa



nie reaguje z

aldehydem) , co prowadzi do powstania połączenia N, N-dihydroksymetylowego danego aminokwasu
zgodnie z poniższą reakcją:

Wytworzenie takiej pochodnej aminokwasu powoduje, że uwolnione w warunkach doświadczenia
jony H

z grupy



, nie mogą być już wiązane z zablokowanymi grupami



COO

, natomiast

powodują zakwaszenie środowiska, stąd po dodaniu aldehydu mrówkowego znajdująca się w
roztworze fenoloftaleina ulega odbarwieniu. Teraz aminokwas zachowuje się jak słaby kwas, który
można już oznaczyć przy użyciu NaOH w obecności fenoloftaleiny. Ilość grup karboksylowych
odpowiada ilości aminokwasu (glicyny)

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki::roztwór glicyny
0.2% roztwór fenoloftaleiny w etanolu
0,1M NaOH
aldehyd mrówkowy o pH 8,5

Do zlewki wlać 5 ml roztworu glicyny dodać 2 krople fenoloftaleiny. Następnie z biurety dodawać
roztwór NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia . Oznacza to osiągnięcie w roztworze
wartości pH wynoszącej około 8,3. Wtedy dla zablokowania grupy aminowej dodać 5 ml 20%
roztworu aldehydu mrówkowego o pH około 8,5. Różowe zabarwienie roztworu znika.
Dodawanie NaOH należy kontynuować, aż do ponownego uzyskania lekko różowego
zabarwienia miareczkowanego roztworu. Mnożąc ilość zużytego NaOH przez równoważnik
glicyny (0,0075) można obliczyć ilość glicyny w roztworze.

3.1.2. Reakcja van Slyke’ a z kwasem azotowym (III)
Zasada: wolne

-aminokwasy zachowują się jak aminy I-rzędowe. Pod wpływem kwasu azotowego

(III) ulegają one dezaminacji, wydziela się wtedy wolny drobinowy azot, natomiast aminokwasy są
zamieniane w odpowiednie

-hydroksykwasy. Kwas azotowy (III), który jest czynnikiem

deaminującym, ze względu na jego nietrwałość otrzymujemy w reakcji z azotynem sodu , działając na
niego kwasem octowym:
NaNO

+ CH

COOH

→

HNO

+ CH

COONa

Otrzymany w ten sposób HNO

reaguje z aminokwasem , zgodnie z poniższym równaniem:

COOH COOH





H + HNO

→



H + H

O + N



R R

Wykonanie oznaczenia:
Odczynnik:i 10%NaNO

stężony CH

COOH

0,5mol/l glicyny

-23-

Do 1 ml roztworu glicyny dodać 1 ml NaNO

, a następnie 1 ml CH

COOH. Powstający w tej

reakcji HNO

nie ulega rozkładowi do tlenków, lecz reaguje z grupą aminową glicyny.

Obserwuje się wydzielenie pęcherzyków bezbarwnego , gazowego azotu.

3.1.3. Reakcja z ninhydryną
Zasada:Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu – poprzez iminokwasy do
amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji 2
cząsteczek ninhydryny: zredukowanej i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowo niebieskie
zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu

-amonowego aminokwasów.

Dodatni barwny odczyn ninhydrynowy dają oprócz aminokwasów, peptydów i białek , także sole
amonowe, aminocukry i amoniak. Oznaczana próba musi być wolna od tych związków.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 0,5 mol/l roztwór glicyny
0,1% roztwór ninhydryny

Do około 1 ml roztworu glicyny dodać 2 krople roztworu ninhydryny. Próbkę ogrzewać we wrzącej
łaźni wodnej przez około 3 minuty , pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.

3.1.4. Reakcja dla cysteiny (aminokwas siarkowy)
Zasada: ogrzewanie roztworu cysteiny w środowisku silnie zasadowym prowadzi do deaminacji , a
także powstania jonów siarczkowych. Podobnie reaguje cysteina zawarta w białku. Jony siarczkowe
reagują z octanem ołowiu (+2) . Powstaje wtedy czarny osad siarczku ołowiu (+2)

COOH COOH





H + 2 OH

→

O + NH

+ S

+ H





SH CH

Cysteina kwas pirogronowy

+ S

→

PbS

↓

czarny

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór cysteiny
30% NaOH
1 M Pb(CH

COO)

Do 1 ml roztworu cysteiny dodać 2 ml NaOH i ogrzewać około 15-20 minut we wrzącej łaźni
wodnej. Następnie dodać kilka kropel roztworu Pb(CH

COO)

i ponownie ogrzać powstaje

ciemnopopielaty roztwór z którego po około 10 minutach wytrąca się ciemny osad PbS.

-24-

3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych.
Zasada: Tyrozyna - aminokwas zawierający w łańcuchu bocznym pierścień aromatyczny podczas
ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym (V) ulega reakcji nitrowania, tworząc żółto zabarwioną
dinitrotyrozynę

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
HNO

NaOH stężony

Do 2 ml roztworu białka jaj kurzego dodać 2 ml HNO

i bardzo ostrożnie lekko podgrzać (2 min).

Uwaga ! reakcja silnie egzotermiczna. Roztwór zabarwia się na żółto. Po oziębieniu zawartość
probówki zalkalizować NaOH ( tzn. dodać 5- 10 kropli bardzo ostrożnie) powstaje
pomarańczowe zabarwienie.

3.1.6. Reakcje dla układu indolowego w tryptofanie.
Zasada: Związki zawierające układ indolowy, np. tryptofan lub białka zwierające ten aminokwas w
roztworze stężonego kwasu np. siarkowego tworzą barwne produkty kondensacji z aldehydami lub
ich pochodnymi. Reakcje te mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania tryptofanu zarówno
wolnego jak również związanego w cząsteczce białka. Tryptofan, kondensuje z kwasem
glioksalowym (reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa) oraz aldehydem mrówkowym (reakcja
Voiseneta), tworzy fiołkowo zabarwione produkty zgodnie z równaniem reakcji:

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
kwas glioksalowy
H

stężony

2.5% aldehyd mrówkowy
HCL stężony
0.05%NaNO

25-

1. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml kwasu glioksalowego, wymieszać i podwarstwić
stężonym H

( 1-2 ml), wlewając go bardzo ostrożnie!!! po ściance nachylonej probówki. Na

granicy zetknięcia obu warstw, tworzy się fiołkowy pierścień. Próbę należy wykonać pod
wyciągiem przy opuszczonej szybie!

2. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz
2 do 3 ml stężonego HCL. Zawartość probówki ostrożnie wymieszać i odstawić na 5 minut. Po
upływie tego czasu dodawać kroplami(5-10 kropel) ,0.05% roztwór NaNO

Odstawić na 20 minut.

Tworzy się zabarwienie fiołkowe.

3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie.
Zasada: Związki zawierające resztę guanidynową, w tym arginina i białka zawierające ten
aminokwas reagują z

-naftolem w środowisku zasadowym zawierającym bromian (I) Powstaje

wtedy pomarańczowo-czerwony barwnik. Reakcja ta jest bardzo czuła i może służyć do ilościowego
oznaczania argininy w białkach. Reakcji tej nie dają inne niskocząsteczkowe związki azotowe (np.
mocznik, kreatyna itp.) ponieważ w tej reakcji niezbędny jest odpowiedni układ , gdzie R jest grupa
alkilową:

N –C- R

॥

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
20% NaOH
2%

naftol

woda bromowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml NaOH i 2 do 3 kropli alkoholowego roztworu

naftolu i zawartość probówki dobrze wymieszać. Następnie dodać po kropli świeżo
przygotowanej wody bromowej ( w środowisku zasadowym powstaje bromian (I)) i ponownie
wymieszać . Tworzy się związek o pomarańczowo-czerwonym zabarwieniu.

-26-

4.BIAŁKA

Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzą łańcuch polipetydowy. Wiązanie
peptydowe łączy grupę karboksylową jednego aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu.
Powstanie dipeptydu z dwu wolnych aminokwasów wiąże się z uwolnieniem jednej cząsteczki wody
zgodnie z poniższą reakcją :

Równowaga tej reakcji jest znacznie silniej przesunięta w kierunku hydrolizy niż w kierunku
syntezy. W związku z tym biosynteza wiązań peptydowych wymaga dostarczenia energii swobodnej,
natomiast hydroliza wiązań jest termodynamicznie korzystna. Wiele aminokwasów połączonych
wiązaniami peptydowymi tworzy liniową strukturę łańcucha polipeptydowego. W łańcuchu
polipeptydowym możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce – z
jednej strony grupą aminowa, a z drugiej grupę karboksylową . Jako początek łańcucha
polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy czyli koniec N i dlatego sekwencje
aminokwasowe łańcucha polipeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną
(końcową) grupa

-aminową np:

Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie fragmentów , tworzących
łańcuch główny oraz fragmentów zmiennych – charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych
aminokwasów. Większość naturalnych łańcuchów polipeptydowych – białek - zawiera od 50 – 2000
reszt aminokwasowych.
Omawiając budowę białek często wymienia się cztery poziomy ich struktury. Struktura
pierwszorzędowa określa po prostu sekwencję aminokwasów. Struktura drugorzędowa opisuje
wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej
Przykładem struktury drugorzędowej jest helisa

lub nić

. Struktura trzeciorzędowa odnosi się do

powiązań przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych oddalonych od siebie
sekwencji liniowej oraz lokalizacji mostków dwusiarczkowych. W białkach składających się z
więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego , można określić jeszcze jeden poziom organizacji
struktury. Każdy z tych łańcuchów nazywa się w takim przypadku podjednostką danego białka.
Struktura czwartorzędowa opisuje wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek i rodzaj ich
kontaktu.

-27-

Badania konformacji, funkcji i ewolucji białek doprowadziły do wyróżnienia jeszcze dwu

tetrapeptyd

Końcowa reszta
aminowa
koniec N

Końcowa reszta
karboksylowa
koniec C

dodatkowych, ważnych poziomów ich organizacji. Naddrugorzędowa struktura odnosi się do
zespołów struktur drugorzędowych. W wielu białkach na przykład nić

jest oddzielona od drugiej

nici

helisą

, taki motyw nazywa się jednostką

βαβ

. .Niektóre łańcuchy polipeptydowi fałdują się,

tworząc dwa lub więcej ściśle zwiniętych rejonów. Te ściśle zwinięta jednostki globularne , nazywane
domenami, złożone są ze 100 do 400 reszt aminokwasowych.

4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek

4.1.1 Wykazanie amfoterycznego charakteru białek
Białka są polielektrolitami zawierającymi rozmaite grupy funkcyjne w bocznym łańcuchu
aminokwasów. Niektóre z nich łatwo ulegają dysocjacji w roztworach wodnych. Jony wodorowe
znajdujące się w roztworze mogą zmieniać jonizację tych grup i stąd całkowity ładunek cząsteczki
zależy od pH środowiska. Przy określonej wartości pH roztworu w wyniku jonizacji w cząsteczce
białka powstaje tyle samo ładunków dodatnich co ujemnych, czyli białko osiąga punkt
izoelektryczny, który podobnie jak w przypadku aminokwasów oznacza się symbolem pI. W tych
warunkach suma ładunków elektrycznych danego białka jest równa zeru. Białka mają charakter
amfoteryczny, wynikający przede wszystkim z występowania wolnych grup karboksylowych



COO

(kwasu asparaginowego, i glutaminowego oraz C-końcowej grupy cząsteczki) i amoniowej



( lizyny i argininy oraz N-końcowej grupy cząsteczki). W roztworach o pH powyżej wartości pI
(punktu izoelektryczego) białko występuje w postaci anionu. Zachowuje się wtedy jak kwas, czyli
oddaje jony wodorowe. Zaś w roztworach o pH poniżej punktu pI białko występuje w postaci
kationu. Zachowuje się wtedy jak zasada, czyli przyłącza jony wodorowe. Wynika z tego ,że
cząsteczka białka w pierwszym przypadku staje się silnie zdysocjowany zasadą polianionową podczas
gdy w drugim przypadku staje się coraz silniej zdysocjowanym kwasem polikationowym

4.1.2 Zachowanie się białek w obecności kwasów

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : 0,5% roztwór żelatyny
0,01mol/l HCL
zieleń bromokrezolowa

Przygotować dwie probówki. Do jednej nalać 2 ml wody destylowanej, a do drugiej 2 ml 0,5%
żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople zieleni bromokrezolowej i kroplami z pipety roztwór
HCL, aż do otrzymania barwy żółtej (pH około 3). Porównać ilość zużytego kwasu do otrzymania
barwy w wodzie destylowanej i w roztworze żelatyny.

4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasad

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: : 0,5% roztwór żelatyny
0,01mol/l NaOH
błękit tymolowy

Do 2 probówek nalać kolejno: do pierwszej 2 ml wody destylowanej a do drugiej 2 ml 0,5%
żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople błękitu tymolowego i miareczkować z pipety
roztworem NaOH aż do uzyskania barwy niebieskiej . Porównać ilość kropli zużytej zasady przy
miareczkowaniu wody i żelatyny.

4.2 Białka jako koloidy

Układy koloidalne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Wszystkie komórki są zespołami
mniej lub bardziej różnorodnych układów koloidowych. W przyrodzie ożywionej zasadniczą rolę
odgrywają ciekłe roztwory koloidowe – zole, których fazą dyspresyjną jest woda. Trwałość takich
roztworów zależy od wielu czynników np. ładunku elektrycznego cząsteczek rozproszonych, stopnia
uwodnienia i temperatury.

-28-

Ze względu na jakość fazy rozproszonej można wyróżnić następujące typy układów
koloidowych:
A.roztwory wielkocząsteczkowych biopolimerów - białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów
(faza rozproszona skład się z cząsteczek o rozmiarach 5-100 nm)
B.roztwory micelarne, których typowymi przedstawicielami są roztwory mydeł i detergentów
C. roztwory substancji nie polarnych , które nie wykazują powinowactwa do wody
Pierwsze dwa typy układów koloidowych zalicza się do hydrofilowych (liofilowych) a trzeci do
hydrofobowych (liofobowych). Koloidy hydrofilowe nazywa się także emulsoidami lub koloidami
odwracalnymi. Koloidy hydrofobowe natomiast – suspensoidami koloidami nieodwracalnymi lub
zawiesiną koloidową. Te dwa typy układów koloidowych różnią się znacznie cechami
fizykochemicznymi.
Roztwory koloidów hydrofilowych, zależnie od temperatury i stężenia, mogą występować w formie
ciekłej –jako zole lub w formie elastycznego ciała stałego – jako żele. Przechodzenie zolu w żel
nazywa się żelatynowaniem (żelowaniem) i jest procesem odwracalnym

+ H

O + H

(pęcznienie) podniesienie temp.
Koloid suchy

←→

żel

←→

zol

(osuszenie) obniżenie temp.

−

O (osuszenie)

−

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: żelatyna (subst.)
skrobia (subst.)

1.Do 2 probówek odważyć : do pierwszej 0,5 g skrobi a do drugiej 0,5 g żelatyny . Dodać 1ml wody
i po bardzo dokładnym wymieszaniu pozostawić na 30 minut w celu napęcznienia. Następnie dodać
po 5 ml wody , wymieszać dokładnie do otrzymania jednorodnego roztworu a następnie wstawić
do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć po około 5 minutach ostudzić pod zimną wodą lub w lodzie.
Otrzymuje się żele. Jeżeli ponownie wstawimy je do wrzącej łaźni wodnej otrzymamy zole .

2. Skrobię i żelatynę w oddzielnych probówkach zalać 5 ml wrzącej wodą bez uprzedniego
napęcznienia. Zwrócić uwagą na różnicę w rozpuszczaniu się koloidu napęczniałego i suchego.

4.3 Denaturacja białek
Terminem tym obejmuje się zmiany w konformacji łańcucha polipetydowego, wskutek których białko
traci właściwości. Denaturacja występuje wówczas, kiedy pod wpływem czynników fizycznych lub
chemicznych ulega zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędowa. Czynniki denaturujące działają na
wiązania które stabilizują przestrzenną strukturę białek.
Do wiązań tych należy zaliczyć przede wszystkim wiązania wodorowe tworzące się między grupami

CO i

NH wiązań peptydowych (w tym samych lub różnych łańcuchach polipeptydowych), a

także między grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, takimi jak :

−

COOH,

−

OH,

−

, i

−

. W utrzymaniu konformacji cząsteczki białka współdziałają również wiązania jonowe, powstające
między grupami

−

COO

i NH

, a także oddziaływania hydrofobowe między aminokwasami

niepolarnymi. Ważnym czynnikiem stabilizującym konformację łańcuchów polipeptydowych są
kowalencyjne wiązania disiarczkowe, tworzące się między resztami cysteiny tego samego lub
różnych łańcuchów polipeptydowych. Istotną rolę odgrywają ponadto metale łączące ze sobą
łańcuchy boczne aminokwasów wiązaniami koordynacyjnymi.
W wyniku rozerwania wiązań stabilizujących strukturę białka uwolnione grupy funkcyjne mogą
wytwarzać inne wiązania, które zmieniają konfigurację cząsteczki. Taka nowa, zdeformowana
cząsteczka odznacza się zawsze zmianą, oraz utratą właściwości biologicznych (enzymatycznych,
antygenowych, hormonalnych).

-29-

Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie, wysychanie,
ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady ,
jony metali ciężkich, mocznik , detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą
jak : alkohol, aceton.

4.3.1.Denaturacja cieplna
Zasada: Ciepło powodując zrywanie wiązań wodorowych w cząsteczce, prowadzi do nieodwracalnej
denaturacji białek. Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się dla różnych białek w różnych
temperaturach (między 40 a 100

C ). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie (np.

żelatyna , rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka
NaCL (in substancja) MgSO

Około 2 ml roztworu białka jaja kurzego zagotować do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty
osad wytrąconego białka. Osad staje się wyraźniejszy po dodaniu niewielkiej ilości NaCL lub
MgSO

4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu.
Zasada: Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton), dezorganizując warstwę wodną otaczającą
cząsteczki białek i osłabiając oddziaływania hydrofobowe, powodują wytrącenie białek. W temp.
poniżej 0

C nie denaturują białek. Działania takie ujawniają się w większych stężeniach i w wyższej

temperaturze (20-30

Wykonanie oznaczenia
odczynniki: roztwór białka
95% alkohol etylowy

Do 1ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml alkoholu etylowego. Po 10 minutach dodać 2 ml
wody . Strąt nie rozpuszcza się.

4.3.3.Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego

Wykonanie oznaczenia.:

Odczynniki: roztwór białka
stężony H

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać bardzo ostrożnie ! 3-5 kropel stężonego kwasu
siarkowego. Kwas ten mimo denaturacji nie wytrąca białka z roztworu.

4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów (sole metali ciężkich)
Zasada: jeśli wartość pH jest większa od pI (punktu izoelektrycznego) , cząsteczki białka stają się
anionami i mogą reagować z kationami. Powstające sole zależnie od rodzaju jonu dysocjują w
różnym stopniu. Kationy metali alkalicznych dają sole bardzo dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w
wodzie , natomiast kationy metali ciężkich ( Fe

, Cu

2+,

, Pb

) tworzą sole o bardzo małej

dysocjacji i trudno rozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :roztwór białka
1% FeCL

1% CuSO

1.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli 1% roztworu FeCL

. Roztwór barwi się na

kolor brudnopomarańczowy. Po pewnym czasie wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego.

2.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu CuSO

. Powstaje jasnobłękitny

osad białczanu miedziowego.

-30-

4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów
Zasada: Po stronie kwasowej punktu izoelektrycznego cząsteczki białka maja ładunek dodatni oraz
zdolność reagowania z anionami. Niektóre kwasy organiczne dają trwałe, nierozpuszczalne
połączenia z białkami i są stosowane jako odczynniki odbiałczające płyny biologiczne. Związki te w
większych stężeniach powodują denaturację białka Podobnie stężone roztwory kwasów
nieorganicznych (HCL, H

) denaturują białko.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka
60% CCL

COOH

Do 1 ml roztworu białka kurzego dodać kilka kropel kwasu trichlorooctowego, wytrąca się białko w
postaci białego osadu.
4.4.Reakcje barwne białek

4.4.1 Reakcja biuretowa – wykrywanie białek
Zasada: reakcję biuretową dają białka oraz peptydy mające więcej niż dwa wiązania peptydowe. W
środowisku zasadowym układy wiązań peptydowych dają z jonami miedzi (+2)
barwne kompleksy. Aby reakcja przebiegała prawidłowo kationy Cu

muszą być związane w postaci

kompleksu , co chroni je przed wytrąceniem w postaci wodorotlenku miedzi. Wiązania peptydowe w
środowisku zasadowym ulegają enolizacji zgodnie z równaniem:

Białko lub peptyd , w którym wiązania peptydowe uległy enolizacji, reagują z jonami Cu , dając
kompleks barwy niebiesko-fioletowej. Nasilenie barwy kompleksu zależy od ilości wiązań
peptydowych i budowy łańcucha peptydowego, a więc intensywność barwy roztworu jest
proporcjonalna do stężenia białka. W przypadku peptydów o niezbyt długich łańcuchach powstaje
kompleks barwy czerwono-fioletowej

-31-

Tetrapeptyd – forma ketonowa

Tetrapeptyd – forma enolowa

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
10% NaOH
1% CuSO

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 10% NaOH, a następnie dodać parę kropel roztworu
CuSO

. Roztwór barwi się na niebiesko-fioletowo.

4.4.2 Reakcja Libermana
Zasada: Reakcja ta wykazuje w białku obecność grupy węglowodanowej, a więc dają ją wszystkie
glikoproteidy. W obecności HCL część węglowodanowa cząsteczki białka przechodzi w furfural,
który z fenolami wytworzonymi na skutek równoczesnej hydrolizy białka daje zabarwienie fiołkowe.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
HCL stężony

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 3 ml stężonego HCL (ostrożnie!) i ogrzewać
przez 5 minut w łaźni wodnej . Roztwór barwi się na kolor fiołkowy.
Białka dają ponadto reakcje barwne charakterystyczne dla zawartych w nich aminokwasów.

4.5.Oczyszczanie białek metodą dializy

Do zbadania struktury , a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą
być wyizolowane z materiału biologicznego, a następnie poddane procedurze systematycznego
oczyszczania. W odróżnieniu od związków niskocząseteczkowych, białka nie przechodzą przez
błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego
do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka nadmiaru soli
(odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do tego celu stosuje się dializę która
oparta jest na procesie dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego stężenia
substancji rozpuszczonej do niższego i prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości roztworu
bez nakładu energii. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę
półprzepuszczalną taką jak błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach znacznie większych niż
średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym natomiast jony i mniejsze cząsteczki przechodzą
przez pory błony i pojawiają się dializacie na zewnątrz woreczka.

-32-

W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych
niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także
stosuje się mieszanie.

Odczynniki:
mleko z dodatkiem NaCL ( 100 mg/25 ml mleka ) i glukozy (100 mg/25 ml mleka) = roztwór
przeznaczony do dializy (A)
10% NaOH
1%CuSO

10%

-naftol

stężony H

Fehling I
Fehling II
20 mmol/l AgNO

woreczek do dializy

Wykonanie oznaczenia:

•

1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu
przeddializacyjnego (A).

•

2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec.

•

3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej

•

4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi
koniec sznurkiem

•

5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną .

•

6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym.

•

7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu
przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1 godz.
Każdorazowo, do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu
przeprowadzenia analizy

•

8. Po upływie 1 godz. wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do
erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy
tego płynu.

Analiza roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C)
- sprawdzenie obecności białka (1)metodą biuretową ,(2) potwierdzenie występowania cukru
(glukoza i laktoza) reakcją Molischa, (3)potwierdzenie występowania cukru redukującego
rekacją Fehlinga, (4)wykazanie występowania jonów chlorkowych.

1. Sprawdzenie obecności białka.
Reakcja biuretowa
do 1 ml roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) dodać 1 ml
10% NaOH oraz 3 krople 1% CuSO

W obecności białka roztwór barwi się na kolor fioletowy.

2. Sprawdzenie obecności cukru.
Reakcja Molischa
Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 2 krople

-naftolu. Po dokładnym zamieszaniu ostrożnie po

ściance probówki wlać 1 ml stężonego H

tak aby widoczna była granica między cieczami. W

miejscu zetknięcia się obu warstw powstaje czerwono-fioletowy pierścień w przypadku obecności
cukru.

3. Potwierdzenie występowania cukrowca redukującego
Reakcja Fehlinga.
Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II. Zawartość probówek
dobrze wymieszać i ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut W przypadku obecności cukru
redukującego powstaje pomarańczowy osad tlenku miedzi (I).

-33-

4. Potwierdzenie występowanie jonów chlorkowych.
Do 1ml roztworu A, B i C dodać 1 ml roztworu AgNO

. Wytrąca się osad chlorku srebra w

przypadku występowania jonów chlorkowych w badanych roztworach.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenie: porównać jak zmienia się zawartość
składników (białka, cukru, jonów chlorkowych roztworze przeznaczonym do dializy (A),
dializacyjnym (B) i dializowanym (C).

4.6. Kolorymetria

Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawą ilościowego oznaczania
substancji w roztworze stanowi prosta zależność między intensywnością zabarwiania roztworu
(absorpcja światła o określonej długości fali -

), a stężeniem zawartej w nim substancji.

Metodami kolorymetrycznymi można oznaczyć zarówno stężenia substancji mających własną barwę
jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych przeprowadza się
w związki barwne . W tym przypadku reakcja barwna musi przebiegać do końca, a powstałe
zabarwienie musi być dostatecznie trwałe, niewrażliwe na działanie światła, mało zależne od pH,
temperatury, nadmiaru odczynnika
Metody kolorymetryczne mają zastosowane tylko do oznaczenia ilościowego substancji dających
barwne połączenia, które pochłaniają światło o długości fali światła widzialnego , czyli w zakresie
długości od 360 do 770 nm.
W odróżnieniu od metod kolorymetrycznych spektrofotometria pozwala na oznaczenie stężenia
związków pochłaniających światło nadfioletowe (tzn. o długości fali od 220 do 360 nm ) oraz
podczerwone (tzn. o długości fali ponad 770 nm)
Tym niemniej metody kolorymetryczne należą do najszybszych i najłatwiejszych technik
analitycznych. Odznaczają się one uniwersalnością , dokładnością i czułością przewyższającą pod
tym względem inne metody.
Zasady kolorymetrii
Barwa substancji zależy od aktywnego pochłaniania, czyli absorpcji światła przez tę substancję. W
czasie obserwacji światła przechodzącego przez daną substancję do oczu dochodzą promienie, które
nie zostały przez nią zaabsorbowane. Widzi się więc barwę dopełniającą, na którą składają się
poszczególne rodzaje przepuszczonych fal elektromagnetycznych. Na przykład barwa niebieska
roztworu oznacza, że dana substancja pochłania światło żółte, przepuszczając te długości fal, które
tworzą widzianą przez nas barwę dopełniającą tj., niebieską, roztwór zabarwiony na czerwono
pochłania światło niebiesko- zielone, roztwór zabarwiony na żółto światło niebiesko-fioletowe.

Istnieje ścisły związek między zabarwieniem substancji a jej strukturą elektronową. Cząsteczka (lub
jon) wykazuje absorpcję w części widzialnej widma lub w nadfiolecie, gdy pod wpływem
promieniowania elektrony jej zostają przeniesione ze stanu podstawowego do jednego ze stanów
wzbudzonych.

-34-

Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej elektronowej struktury
cząsteczki. Zmiany energii elektronowej pod wpływem naświetlania występują w cząsteczkach
zawierających grupy chromatoforowe, ugrupowania z wielokrotnymi wiązaniami nienasyconymi,
np.

Wzrost intensywności zabarwienia cząsteczki powoduje obecność tzw. grup auksochromowych, np.



OH,



SH,



Cl,



Br, pierścień fenylowy czy naftylowy.

Ilość światła pochłoniętego po przejściu przez barwny roztwór zależy od grubości warstwy
barwnego roztworu. Zależność tą ujmuje prawo Lamberta. Zgodnie z tym prawem logarytm
stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego jest wprost
proporcjonalny do grubości warstwy.
I

Log



= k • d

I
I

- natężenie światła padającego

I - natężenie światła po przejściu przez barwny roztwór
k - współczynnik proporcjonalności
d - grubość warstwy barwnego roztworu przez który przechodzi światło (cm)

Ilość światła pochłoniętego zależy również od stężenia substancji barwnej, zależność tą podaje
prawo Beera. Zgodnie z tym prawem logarytm ze stosunku natężenia światła padającego do
natężenia światła przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia barwnej
substancji.

Log



= k • c

gdzie : I

Log —— - absorbancja = A
I
k - stała charakterystyczna dla danego ośrodka optycznego
c – stężenie substancji barwnej

Łącząc wzór określający prawo Lamberta z wzorem określającym prawo Beera otrzymuje się
nowe wyrażenie , ujmując matematycznie zależność pomiędzy gęstością optyczną a stężeniem
substancji i grubością warstwy roztworu

A = k • c • d

Absorbancja (A) jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór. Innym określeniem
absornbancji jest gęstość optyczna lub ekstynkcja

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia i
grubością warstwy barwnego roztworu.

Uzyskiwane wartości absorbancji powinny się znajdować w przedziale 0,1 -1,0 a najdokładniejsze
wyniki otrzymuje się przy wartościach od 0,2 – 0,6. Ponieważ na wartość absorbancji ma wpływ
grubość warstwy roztworu, należy oznaczenia przeprowadzać w kuwetach o takiej grubości warstwy,
która umożliwiłaby uzyskanie wartości absorbancji w optymalnych warunkach.

-35-

3.6.1.Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry’ego
Zasada:metoda Lowry opiera się na reakcji jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne
z odczynnikiem Folina Ciocaltou:
I etap

→

przyłączenie jonów miedzi (odczynnik Lowry C) do wiązań peptydowych

II etap

→

redukcja kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenianowego do odpowiednich

tlenków przez miedź związaną z białkiem, reakcja między odczynnikiem fenolowym, a tyrozyną i
tryptofanem
Metoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1

g/ml. Jest powszechnie stosowana do

oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych.

Odczynniki: Standard – krystaliczna albumina wołowa BSA o stężeniu: 50

g/ml

Lowry A 50 ml
Lowry B 1 ml
Lowry C = 50 ml Lowry A + 1 ml Lowry B
Odczynnik Folina Ciocaltou

rozcieńczenie surowicy: 0,1 ml surowicy + 9,9 ml Lowry C

lub 0,05 ml surowicy + 4,95 ml Lowry C

Po inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (A) wobec próby odczynnikowej ”0”
przy fali o dł.

= 660 nm w kuwecie o grubości warstwy d = 1cm

Obliczenie stężenia białka:

(A) Absorbancja próby badanej
x 0.05 x 100 = (.x.) g/100ml
(A) Absorbancja standardu

Stężenie białka całkowitego w surowicy

Gatunek zwierząt

Wartości
g/100ml

Konie
Bydło
Owce
Kozy
Świnie
Psy
Koty
Króliki

6,0 - 7,8
5,1 - 7,1
6,5 - 7,0
5,9 – 7,8
5,9 - 7,4
5,5 – 7,0
6,0 – 8,0
6,0 – 8,3

-36-

5.KWASY NUKLEINOWE

Organizmy żywe mogą istnieć wyłącznie wtedy, gdy są zdolne przekazać swą informację genetyczną
organizmom potomnym . Podstawę tej informacji genetycznej stanowi kwas dezoksyrybonukleinowy
DNA

→

RNA

→

białka

→

komórka

→

organizm

Poniższy schemat przedstawia schemat przepływu informacji genetycznej

Synteza potomnej cząsteczki DNA to replikacja ( etap u na schemacie),przekazanie informacji z
DNA na RNA – transkrypcja ( etap v ) , a z RNA dla syntezy białka – translacja Translacja
jest związana z przetłumaczeniem informacji zapisanej w sekwencji nukleotydów na„język
aminokwasów.Istnieje możliwość przekazania informacji z RNA na DNA tj. odwrotna transkrypcja
(etap x)
DNA jest polimerem zbudowanym z jednostek monomerycznych – deoksyrybonukleotydów . Każdy
nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych. Cukrem
występującym w deoksyrybonukleotydach jest deoksyryboza.

Zasady azotowe to : pochodne puryny lub pirymidyny. Zasadami purynowymi w DNA są adenina
(A) i guanina (G), a pirymidynowymi – tymina (T) i cytozyna (C).

Związek zasady purynowej lub pirymidynowej z cukrem nazywamy nukleozydem. W DNA
występuje 4 rodzaje nukleozydów: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna, deoksytymidyna i
deoksycytydyna. W deoksyrybonukleotydach N-9 zasady purynowej lub N-1 zasady pirymidynowej
jest związany z
C-1 deoksyrybozy wiązaniem N-glikozydowym. Ester nukleozydu i kwasu fosforowego nazywamy
nukleotydem . Najczęstszym miejscem estryfikacji w nukleotydach występujących w przyrodzie jest
grupa hydroksylowa związana z C-5 cukru. Tego rodzaju związek jest nazywany nukleozydo-5

’

fosforanem lub 5

’

- nukleotydem. ( Cyfra ze znaczkiem prim

‘

określa atom w cząsteczce cukru).

-37-

Rdzeń DNA jest niezmienny, wzdłuż całej cząsteczki i składa się z reszt deoksyrybozy połączonych
resztami fosforanowymi. Grupa 3

’

-hydroksylowa reszt cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest

połączona z grupą 5

’

- hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.

Komórkowy DNA składa się z dwóch bardzo długich łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych
wokół jednej wspólnej osi. Każda z dwóch nici helisy jest zorientowana w przeciwnym kierunku. Na
zewnątrz dwuniciowej helisy znajdują się rdzenie cukrowo-fosforanowe każdego z łańcuchów ,
podczas gdy zasady purynowe i pirymidynowe są skierowane do wnętrza helisy. Obydwa łańcuchy
są połączone wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi pary. Adenina (A) zawsze
tworzy parę z tyminą (T), a guanina (G) jest zawsze sparowana z cytozyną (C), dzięki czemu
jeden łańcuch helisy jest zawsze komplementarny do drugiego. Informacje genetyczną koduje ściśle
określona sekwencja zasad w każdym z łańcuchów. Wiele cząsteczek DNA tworzy formy koliste.
Podczas replikacji obydwa łańcuchy helisy DNA ulegają rozpleceniu i rozdzielają się w miarę
postępu syntezy nowych łańcuchów. Każdy łańcuch rodzicielski stanowi matrycę dla nowo
powstającego łańcuchu komplementarnego. Tak więc replikacja DNA jest procesem
semikonserwtywnym – każda potomna cząsteczka uzyskuje jeden łańcuch z rodzicielskiej
czasteczki DNA i drugi nowo syntetyzowany. Aktywnymi prekursorami w syntezie DNA są cztery 5

’

–trifosforany deoksyrybonukleozydów. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku 5

’

→

’

DNA nie jest jednak bezpośrednio matrycą do syntezy białek; funkcje takie pełnią natomiast
cząsteczki RNA – kwasu rybonukleinowego. RNA jest długą nierozgałęzioną makrocząsteczką
złożoną z nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi 3

’

→

’

. Jednostką cukrową

w RNA jest ryboza. Głównymi zasadami w RNA są : adeina (A)
uracyl, (U) guanina (G) oraz cytozyna (C). Adenina może tworzyć parę z uracylem , a guanina z
cytozyną

Funkcję pośredników przenoszących informację w procesie biosyntezy białka pełni klasa cząsteczek
RNA nazywanych informacyjnymi RNA (mRNA). Inne cząsteczki RNA, jak transportujący RNA
(tRNA) i rybosomowy RNA (rRNA) stanowią część mechanizmu syntezy białka . Wszystkie
rodzaje komórkowych RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA zgodnie z instrukcjami
przekazywanymi przez matrycę DNA.

5.1.Badanie właściwości kwasów nukleinowych

5.1.1 Hydroliza kwasów nukleinowych, badanie produktów hydrolizy.
Zasada

: w czasie ogrzewania z kwasami, kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie rozpadając się na

zasady purynowe i pirymidynowe, kwas fosforowy i pentozę. Przez łagodną hydrolizę,
przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych,
mianowicie nukleotydy i nukleozydy.

-38-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: nukleinian sodu
2 M H

2 M NaOH

Do 2 ml nukleinianu sodu dodać 5 ml 2M

i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut.

Hydrolizat zobojętnić 10% NaOH wobec papierka lakmusowego.

↓

Następne reakcje wykonujemy na otrzymanym hydrolizacie kwasów nukleinowych !!!

1. Wykrywanie cukrów - reakcja Molischa

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

10% alkoholowy roztwór

- naftolu

stężony

Do około 1 ml hydrolizatu dodać 2 krople 10% alkoholowego roztworu

-naftolu i wymieszać.

Następnie ostrożnie !, po ściankach probówki dodać około 1 ml stężonego H

aby powstały dwie,

dobrze odgraniczone warstwy. Powstaje fioletowo-czerwony pierścień.

2. Próba Biala z orcyną na pentozy

Zasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną
kompleks o barwie zielonej
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat
0,2% roztwór orcyny w 20% HCl
1% FeCl

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl

i 0,5 ml roztworu hydrolizatu

Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone
zabarwienie. przeprowadzić

3. Wykrywanie zasad purynowych:
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 5%NH

5% AgNO

Do probówki wlać około 1 ml hydrolizatu, a następnie zalkalizować go 5% NH

OH. Roztwór

przesączyć po czym przenieść go do zlewki i zalać 1 ml AgNO

. W obecności zasad

purynowych powstaje brązowy osad

4. Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

HNO

stężony

roztwór molibdenianu amonu

Do 0,5 ml hydrolizatu dodać amoniaku, aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić
stężonym HNO

i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia, pojawia się żółty osad

fosforomolibdenianu amonu.

-39-

5.2.Odróżnienie RNA od DNA

5.2.1. Reakcja orcynolowa
Zasada: ryboza wolna oraz związana w nukleozydach i nukleotydach ogrzewana ze stężonym
roztworem HCL przechodzi w furfural, który z orcyną i jonami F

tworzy trwały kompleks o

ciemno- zielonej barwie.

Wykonanie oznaczenia :
Odczynnik : 0.1%roztwór RNA
0,1%roztwór DNA
odczynnik orcynolowy

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA , a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po 1 ml
odczynnika orcynolowego i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na około 15 minut. W
probówce zawierającej RNA powstaje ciemno-zielone zabarwienie, probówka z DNA pozostaje
jasnozielona (reakcja negatywna).

5.2.2. Reakcja z difenyloaminą.
Zasada : difenyloamina daje barwny kompleks z deoksyrybozą

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:0,1% roztwór RNA
0,1% roztwór DNA
odczynnik difenyloaminowy

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po dodać
po 2 ml odczynniki difenyloaminowego. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
W probówce zawierającej DNA powstaje niebieskie zabarwienie. RNA nie wykazuje dodatniego
odczynu, próbka pozostaje bezbarwna.

-40-

6.LIPIDY

Lipidy występują w komórkach wszystkich organizmów żywych. W organizmach zwierząt są one
obecne w większej ilości w różnych komórkach narządach lub w postaci wyodrębnionej tkanki
tłuszczowej. Obecność lipidów w pożywieniu jest niezbędna . Pełnią one zarówno funkcje
energetyczne jak i strukturalne. Są one ponadto źródłem i nośnikiem wielu substancji biologicznie
czynnych i witamin. Lipidy (tłuszcze) występujące w przyrodzie dzieli się na proste (tłuszcze
właściwe, woski) i złożone (fosfolipidy, glikolipidy, sfingolipidy) oraz prekursory i pochodne
lipidów (kwasy tłuszczowe, glicerol , sfingozyna).

Lipidy proste (tłuszcze właściwe) są estrami glicerolu i wyższych jednokarboksylowych kwasów
tłuszczowych. Glicerol może tworzyć wiązanie estrowe z jedną , dwiema, lub trzema resztami
kwasów tłuszczowych. Powstające w ten sposób związki noszą nazwę monoacylo-,diacylo-,lub
triacylogliceroli:

Kwasy tłuszczowe występujące w lipidach nadają im odpowiedni charakter fizykochemiczny. Im
większa masa cząsteczkowa kwasów tłuszczowych , tym wyższa jest temperatura topnienia lipidów.
Temperatura ta będąca jakościowym wyrazem stosunku kwasów tłuszczowych nasyconych do
nienasyconych w lipidach maleje wraz ze wzrostem procentowego udziału kwasów nienasyconych.
Lipidy o dużej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych są zazwyczaj ciekłe i oleiste.

Niektóre kwasy tłuszczowe występujące w organizmach zwierzęcych

Liczba

atomów

węgla

Liczba

wiązań

podwój-

nych

Nazwa

potoczna

Wzór

kwas laurynowy

kwa mirystynowy

kwas palmitynowy

kwas stearynowy

kwas arachidowy

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

(CH

)

COO

kwas palmitooleinowy

kwas oleinowy

kwas linolowy

kwas linolenowy

kwas arachidonowy

(CH

)

CH=CH(CH

)

COO

(CH

)

CH=CH(CH

)

COO

(CH

)

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

(CH

)

(CH=CHCH

)

(CH

)

COO

monoacyloglicerol diacyloglicerol triacyloglicerol

-41-

Woski to estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol .Spełniają w przyrodzie
rolę ochronną alkohole i kwasy tłuszczowe wosków są związkami nasyconymi o dłuższych
łańcuchach węglowych (od 26 do 42) niż kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach właściwych.
Lipidy złożone to materiał budulcowy wszystkich komórek, głównie błon plazmatycznych, a także
osłon włókien nerwowych. Występują szczególnie obficie w tkance nerwowej , krwi, limfie, wątrobie
żółtku jaj. Łączą je podobne właściwości fizykochemiczne i biologiczne.

I. Fosfolipidy – składnikiem alkoholowym jest glicerol którego dwie grupy hydroksylowe
zestryfikowane są kwasami tłuszczowymi nasyconymi i nienasyconymi a trzecia kwasem
fosforowym. Przedstawicielami są lecytyny oraz kefaliny.

II. Sfingolipidy różnią się pod względem budowy od innych lipidów. Zamiast glicerolu występuje w
nienienasycony 18-węglowy aminoalkohol sfingozyna (np. ceramidy, sfingomieliny)

III. Glikolipidy występują we wszystkich tkankach na zewnętrznej stronie błony komórkowej. W
ich skład wchodzą sfingozyna, kwas tłuszczowy i reszta oligosacharydowa (cerebrozydy,
gangliozydy)

6.1.Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych

6.1.1. Rozpuszczalność lipidów
Zasada: Lipidy- tłuszcze są nierozpuszczalne w wodzie , natomiast rozpuszczają się w
rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform, aceton, gorący alkohol. Przy wytrąceniu
lipidów wodą powstaje emulsja, czyli zawiesina kuleczek tłuszczu, które szybko łączą się ze sobą tak,
że powstaje wyraźna granica między dolną fazą wodną i górną fazą tłuszczową. Zawiesinę tłuszczu
w wodzie można utrwalić przez dodanie substancji absorbujących się na granicy obu faz. Substancje
takie, zwane emulgatorami, obniżają napięcie powierzchniowe i powodują rozdrobnienie cząsteczek
tłuszczu zawieszonych w wodzie. Działanie emulgujące posiadają białka, sole kwasów żółciowych
oraz mydła.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
alkohol
aceton
chloroform
woda

Do dwóch probówek wlać po 1 ml wody, jedną pozostawić zimną, drugą podgrzać nad palnikiem,
Do kolejnych probówek wlać w takiej samej ilości (tzn. po 1 ml) alkohol, chloroform i aceton, a
następnie do wszystkich probówek dodać po około 0,5 ml oleju. Obserwując roztwory stwierdzić
różnicę rozpuszczalności w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach.

6.1.2.Badanie składu lipidów prostych –próba akroleinowa
Zasada

: próba ta pozwala wykryć w cząsteczce lipidów prostych obecność glicerolu

(trójwodorotlenowy alkohol, dobrze rozpuszczalny w wodzie). Obecność jego wykrywa się
przeprowadzając go w nienasycony aldehyd – akroleinę

-42-

H
/
CH

— OH C = O



-2H



CH — OH

→



KHSO



— OH CH

Wynikiem reakcji jest ostra i nieprzyjemna woń będąca połączeniem zapachu SO

i spalonego

tłuszczu. Odwodnienie glicerolu zachodzi pod wpływem kwaśnego siarczanu potasu, który ulega przy
tym redukcji do SO

o charakterystycznym zapachu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
KHSO

krystaliczny

Do trzech kropli oleju w probówce dodać szczyptę krystalicznego KHSO

Podgrzać nad palnikiem.

Po podgrzaniu wytwarza się po pewnym czasie akroleina, którą poznaje się po charakterystycznym
dławiącym zapachu spalonego tłuszczu.

6.1.3. Reakcja zmydlania.
Zasada: hydroliza lipidów pozwala na wykazanie obecności kwasów tłuszczowych w cząsteczce
tłuszczu. Lipidy pod wpływem podgrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie dając glicerol i wolne
kwasy tłuszczowe zgodnie z poniższą reakcją:



OH R



COOH





+ 3H

O CH



OH + R



COOH





OH R



COOH

Triacyloglicerol glicerol kwasy tłuszczowe

Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH lub NaOH), z tym że
otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane mydłami, a sam proces
nosi miano zmydlania tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych dobrze rozpuszczają
się w wodzie , tworząc micelarne roztwory koloidowe.

-O- CO-(CH

)

— CH

- OH



CH-O- CO- (CH

)

— CH

+ 3NaOH

→

CH – OH + 3 CH

(CH

)

COONa



- O- CO- (CH

)

— CH

- OH

Trójstearynian glicerolu glicerol stearynian sodu

Mydła tworzą koloidy hydrofilowe lub hydrofobowe w zależności od środowiska. W roztworze
wodnym grupy polarne (



COONa) skierowane są na zewnątrz a rodniki hydrofobowe

(węglowodorowe) do wnętrza micelarnych kuleczek mydła. W rozpuszczalnikach organicznych
układ tych grup jest odwrotny (mielca odwrócona). Grupy hydrofilowe i hydrofobowe mydła
ustawiają się zatem w charakterystyczny sposób na granicy faz i zmniejszają napięcie
powierzchniowe. Związki zmniejszające napięcie powierzchniowe są dobrymi emulgatorami poza
mydłami należą do nich detergenty i kwasy żółciowe.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: margaryna
2 M NaOH
H

W erlenmajerce umieścić kawałek margaryny i ogrzewać na płytce nad palnikiem z 10 ml wody i 2
ml (2M) NaOH. Po pewnym czasie powstaje klarowny, lekko opalizujący i pieniący się roztwór: jest
to mydło sodowe .

-43-

Na otrzymanym roztworze mydła sodowego wykonać poniższe reakcje !!!!

a. wysalanie mydeł
Zasada: jest to odwracalny proces fizyczny, polegający na odwodnieniu koloidalnych cząsteczek
mydła. Cząsteczki mydła są otoczone warstewką wody związanej, dzięki czemu utrzymują się w
roztworze. Dodanie do roztworu mydła dobrze rozpuszczalnej, obojętnej soli powoduje odwodnienie
koloidalnych cząsteczek mydła, zmniejsza ich rozpuszczalność i następuje wytrącenie mydła w
postaci osadu. Po dodaniu wody mydło rozpuszcza się ponownie.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
NaCl in substantia

Do 2 ml mydła dodać NaCl in substantia, aż do nasycenia. Wytrąca się mydło wysolone w postaci
osadu. Płyn znad osadu odlać , a do osadu czyli wytrąconego mydła dodać wody. Mydło rozpuszcza
się.

b. wytrącanie wolnych kwasów tłuszczowych
Zasada : pod wpływem kwasów (siarkowego lub solnego) z mydeł zostają uwalniane kwasy
tłuszczowe:

2 CH

(CH

)

COONa + H

→

2CH

(CH

)

COOH

+ Na

mydło stearynowe kwas stearynowy

Wydzielone kwasy tłuszczowe po ogrzaniu do wrzenia zbierają się na powierzchni roztworu i po
oziębieniu tworzą „plaster”. Kwasy te są nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczają się jedynie w
alkoholu, eterze, chloroformie i chloroformie tłuszczach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
papierki lakmusowe
H

stężony

Do probówki nalać około 3 ml mydła, zakwasić go (wobec papierka lakmusowego) stężonym
kwasem siarkowym. Po ogrzaniu na powierzchni tworzy się warstwa wytrąconych kwasów
tłuszczowych, która po oziębieniu krzepnie.

c. działanie emulgujące mydeł
Zasada: mydła zawierają w swej cząsteczce grupę hydrofobową ( łańcuch węglowodorowy), nie
rozpuszczającą się w wodzie tylko w tłuszczach oraz grupą hydrofilową (grupa karboksylowa –
COOH) łatwo rozpuszczalną w wodzie. Mydła w roztworze umieszczają się na granicy fazy wodnej i
tłuszczowej, przy czym ich dysocjowane grupy COOH, naładowane ujemnie łączą się z wodą, a
grupy hydrofobowe rozpuszczają się w kuleczkach tłuszczu. W wyniku tego zostaje zniesiona granica
faz, poszczególne kuleczki tłuszczu nie łączą się z sobą i powstaje emulsja tłuszczowa. Emulsja jest
formą cieczy złożonej z dwu, nie mieszających się z sobą faz – rozproszonej i rozpraszającej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
olej
H

Do probówki wlać 1 ml oleju a następnie dodać 5 ml wody i 1 ml mydła. Po wytrząśnięciu w
probówce tworzy się trwała emulsja tłuszczowa. Do drugiej probówki wlać 1 ml oleju i tylko 5 ml
wody, a następnie mocno wytrząsnąć . Utworzy się nietrwała emulsja tłuszczowa.

-44-

6.1.4. Wykazanie obecności w lipidach nienasyconych kwasów tłuszczowych – reakcja H

ü bla

Zasada: podwójne wiązania nienasyconych kwasów tłuszczowych nadają im specyficzne cechy
chemiczne. W miejscach „nienasycenia” kwasy tłuszczowe przyłączają łatwo atomy wodoru, tlenu i
innych pierwiastków , np., chlorowców ulegając przy tym przekształceniu w pochodne kwasów
nienasyconych. Specjalne znaczenie ma przyłączenie J

, ponieważ reakcja jodowania jest kryterium

jakościowej charakterystyki lipidów. Reakcja ta pozwala na oznaczenie liczby wiązań podwójnych
w lipidach i kwasach tłuszczowych.

(CH

)

– CH=CH(CH

)

COOH + J

→

(CH

)

- CH- CH – (CH

)

COOH



J J
kwas tłuszczowy kwas dwujodotłuszczowy

Reakcja powyższa została wykorzystana w próbie H

übla, w której w obecności chlorku rtęciowego

HgCl

następuje przyłączenie jodu w miejscu podwójnego wiązania kwasu tłuszczowego. Po dodaniu

do kwasu tłuszczowego roztworu H

übla I (alkoholowy roztwór jodu), roztwór zabarwia się na kolor

brunatno-brązowy. Pod wpływem roztworu H

übla II (alkoholowy roztwór HgCl

) następuje

wbudowanie jodu w cząsteczkę kwasów tłuszczowych i mieszanina odbarwia się.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
odczynnik H

übla I (2,6% alkoholowy roztwór jodu)

odczynnik H

übla II (3% alkoholowy roztwór HgCl

)

Do 2 ml oliwy dodać kroplami odczynnik H

übla I. Roztwór zabarwia się na kolor brunatno-

brązowy. Następnie wkropić odczynnik H

übla II. Następuje odbarwienie roztworu.

6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.
Zasada: Jeżeli na lipidy zawierające kwasy tłuszczowe nienasycone podziała się substancją
utleniającą , dochodzi do rozerwania wiązania podwójnego z równoczesnym utlenieniem
znajdujących się w jego sąsiedztwie atomów węgla, kwas rozpada się na krótsze związki – w ten
sposób można określić miejsce położenia wiązania podwójnego cząsteczce kwasu.
Jako substancję utleniającą używa się nadmanganian potasu (KMnO

) , w którym mangan w

środowisku obojętnym przechodzi ze stopnia utlenienia +7 na stopień utlenienia +4

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
1 mol/l Na

0,01 mol/l KMnO

Do probówki wlać parę kropli oleju a następnie dodać 3 ml Na

Mieszaninę lekko podgrzać. Po

czym dodać kroplami KMno

, aż do utworzenia brunatnego osadu dwutlenku manganu (MnO

6.2.Tłuszcze złożone- badanie składu lecytyn
Lecytyny (fosfatydylocholiny) zbudowane są z cząsteczki glicerolu estryfikowanego dwoma
cząsteczkami kwasów tłuszczowych (nasyconego i nienasyconego) oraz z jednej cząsteczki kwasu
fosforowego estryfikowanego aminoalkoholem choliną (trimetyloetanolamina). Istnieje szereg
odmian lecytyn, różniących się między sobą rodnikami kwasów tłuszczowych oraz położeniem kwasu
fosforowego.

fosfatydylocholina

-45-

Lecytyny są substancjami żółtymi, woskowatymi. Na powietrzu łatwo się utleniają . Są to związki
higroskopijne, łatwo rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych oraz w wodnych roztworach
kwasów żółciowych. Nie rozpuszczają się w acetonie i wodzie z którą tworzą lepkie koloidalne
roztwory.

6.2.1.Wykrywanie glicerolu
Na suchej lecytynie wykonać reakcje akroleinową na obecność glicerolu.

6.2.2.Wykrywanie kwasów tłuszczowych:
Zasada: pod wpływem NaOH lecytyna ulega hydrolizie i tworzą się sole sodowe kwasów
tłuszczowych oraz powstająca z choliny trimetyloamina N(CH

)

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: lecytyna
20% NaOH

Umieścić kilka granulek lecytyny w probówce i nalać około 3 ml 20% NaOH. Ogrzewać przez kilka
minut. Podczas ogrzewania czuć woń trimetyloaminy. W roztworze tworzą się mydła.

6.2.3.Wykrywanie kwasu fosforowego
Zasada: podczas utleniania lecytyny w wysokiej temperaturze wszystkie jej składniki ulegaja
utlenieniu na substancje lotne. Fosfor jako ciało stałe pozostaje na dnie probówki, a po rozpuszczeniu
w rozcieńczonym HNO

można go wykryć molibdenianem amonu, z którym tworzy żółty osad

fosforomolibdenianu amonu

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki: lecytyna
mieszanina do spalań (KNO

+ K

w stosunku. 2:3)

HNO

rozcieńczony

molibdenian amonu

Do probówki wsypać kilka granulek lecytyny dodać dwukrotnie większą ilość mieszaniny do spalań
i trzymać nad płomieniem palnika tak długo, aż zawartość probówki przyjmie czarne zabarwienie.
Pozostałość w probówce rozpuścić w rozcieńczonym kwasie azotowym Zawartość probówki
przesączyć. Do otrzymanego przesączu wlać niewielką ilość molibdenianu amonu, aż do uzyskania
żółtego zabarwienia.

-46-

7. CHOLESTEROL

Cholesterol ( 5 cholesten-3-

-ol) wchodzi w skład lipidów budulcowych ustroju . Jest głównym

sterolem zwierzęcym. Wywodzi się on z 27-węglowego układu cholestenu i posiada jedno wiązanie
podwójne w pozycji 5 oraz grupę hydroksylową w pozycji 3.

Cholesterol występuje w komórkach wszystkich tkanek i narządów, przeważnie jako wolny, ale także
może być związany estrowo z kwasami tłuszczowymi. Wolny cholesterol stanowi niezbędny składnik
błon cytoplazmatycznych i błon organellowych.W obrębie cytoplazmy cholesterol może być
magazynowany w postaci pęcherzyków zawierających estry cholesterolu. Najwięcej tych
pęcherzyków jest w komórkach kory nadnerczy oraz gonad gdzie cholesterol jest substratem
koniecznym do syntezy hormonów steroidowych. W wątrobie z cholesterolu powstają kwasy
żółciowe.

7.1.Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu

7.1.1 Reakcja Salkowskiego
Zasada: Po podwarstwieniu chloroformowego roztworu cholesterolu stężonym kwasem siarkowym,
faza dolna kwasu fluoryzuje na zielono, natomiast warstwa górna chloroformowa barwi się na
czerwono. .Przypuszcza się , że barwa reakcji pochodzi od utworzonych dodatkowo wiązań
podwójnych lub kondensacji dwu cząsteczek cholesterolu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: cholesterol
chloroform
H

stężony

Niewielką ilość cholesterolu wsypać do suchej probówki (obecność wody przeszkadza w reakcji !) i
dodać 2 ml chloroformu , a następnie bardzo ostrożnie po ściankach probówki wlać 2 ml stężonego
kwasu siarkowego tak , aby płyny nie zmieszały się. Otrzymaną reakcję oglądać pod lampa
kwarcową !. Warstwa dolna kwasu siarkowego wykazuje zabarwienie żółte z zieloną fluorescencją,
natomiast warstwa górna , chloroformowa jest zabarwiona na czerwono.

6.1.2.Reakcja Libermana – Burcharda

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: cholesterol
chloroform
bezwodnik kwasu octowego
H

stężony

W suchej probówce szczyptę cholesterolu rozpuścić w 2 ml chloroformu i dodać 10 kropli
bezwodnika kwasu octowego, następnie bardzo ostrożnie wlać po ściankach probówki 1-2 kropli
stężonego kwasu siarkowego. Roztwór zabarwia się kolejno na czerwono- fiołkowo- niebiesko-
zielono.

47-

8 .KWASY ŻÓŁCIOWE.

Sole kwasów żółciowych są polarnymi pochodnymi cholesterolu. Związki te są wysoce efektywnymi
detergentami, ponieważ ich cząsteczki zawierają zarówno polarne, jak i niepolarne rejony. Sole
kwasów żółciowych są syntetyzowane w wątrobie, magazynowane, zagęszczane w pęcherzyku
żółciowym i uwalniane stamtąd do jelita cienkiego. Sole te, będące głównym składnikiem żółci,
działają emulgująco na tłuszcze pokarmowe. Skuteczne zwiększenie powierzchni cząsteczek
lipidów ma dwie konsekwencje: ułatwia hydrolizę tłuszczów przez lipazy i ich wnikanie do ściany
jelita. Sole kwasów żółciowych są również głównym produktem rozpadu cholesterolu.

8.1.Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych:

8.1.1.Próba Haya
Zasada: kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy – siarka lub talk w obecności żółci
nie utrzymuje się na powierzchni , lecz szybko opada na dno

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
talk
H

Do 2 probówek wlać po 5 ml wody. Do jednej dodać kroplę żółci i dokładnie wymieszać. Do obu
probówek wsypać szczyptę talku. W probówce do której dodano żółć (czyli kwasy żółciowe) talk
szybko opada na dno, natomiast probówce gdzie jest tylko woda talk utrzymuje się na powierzchni.

8.1.2.Emulgujące działanie żółci
Zasada: obniżenie napięcia powierzchniowego w obecności kwasów żółciowych umożliwia
tworzenie się emulsji.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
olej
H

Do 2 probówek nalać po 5 ml wody i 5 kropli oliwy. Do jednej z nich dodać 3 krople żółci – obie
probówki silnie wstrząsnąć i odstawić. Po paru minutach w probówce bez żółci nastąpi rozdzielenie
warstw wody i oliwy, natomiast w probówce drugiej powstaje zawiesina tłuszczu.

8.1.3. Próba Pettenkofera

Zasada: w środowisku silnie kwaśnym fruktoza tworzy 5-hydroksymetyelenofurfural, który
kondensuje z kwasami żółciowymi na barwne pochodne

Sole kwasów żółciowych

Kwas glikocholowy

Kwas taurocholowy

-48-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
fruktoza lub sacharoza
H

stężony

Do 1 ml rozcieńczonej żółci dodać kilka kryształków fruktozy lub sacharozy i po rozpuszczeniu cukru
ostrożnie po ściankach probówki wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego Na pograniczu obu
warstw tworzy się czerwony pierścień.

9.HORMONY STEROIDOWE

Cholesterol jest prekursorem pięciu głównych klas hormonów steroidowych: progestagenów,
glukokorykoidów, mineralokortykoidów, androgenów i estrogenów.

cholesterol (C

)

↓

pregnenolon (C

)

↓

progestageny (C

)

glikokortykoidy (C

) androgeny (C

)

mineralokorykoidy (C

)

estrogeny (C

)

Progesteron, hormon grupy progestagenów, przygotowuje podłoże macicy do umiejscowienia jaja.
Progesteron jest również niezbędny do utrzymania ciąży. Androgeny (testosteron, androsteron,
androstendion) są odpowiedzialne za rozwój drugorzędowych męskich cech płciowych, natomiast
estrogeny (estradiol, estron, estriol)konieczne do wytworzenia drugorzędowych cech płciowych
żeńskich. Estrogeny wspólnie z progesteronem uczestniczą również w cyklu owulacyjnym.
Glikokorykoidy (kortyzol, kortyzon, kortykosteron) pobudzają glukoneogenezę i tworzenie
glikogenu oraz wzmagają rozkład tłuszczu i białka. Umożliwiają reakcję zwierząt na stres .
Mineralokortykoidy (głównie aldosteron) powodują zwiększenie resorpcji Na

i wydzielanie K

i H

przez kanaliki nerkowe, co prowadzi do wzrostu objętości i ciśnienia krwi.

Głównymi miejscami syntezy tych grup hormonów są dla : progestegenów – ciałko żółte, estrogenów
– jajnik, androgenów – jądra, glukokortykoidów i mineralokortykoidów – kora nadnerczy.

Synteza progesteronu i kortykoidów.

Progesteron jest syntetyzowany z pregnenolonu w dwóch etapach. Grupa 3-hydroksylowa
pregnenolonu jest utleniania do grupy 3-ketonowej i wiązanie r

izomeryzuje do wiązania r

Koryzol , główny glukokortykoid tworzy się z progesteronu przez hydroksylację przy C-17, C-21, i
C-11.
Początkowym etapem syntezy aldosteronu, głównego mineralokortykoidu jest hydroksylacja
progesteronu przy C-21. Powstały deoksykortykosteron jest hydroksylowany przy C-11. Kątowa
grupa metylowa C-18 zostaje utleniona do aldehydu i powstaje aldosteron.

-49-

Synteza androgenów i estrogenów
Synteza androgenów rozpoczyna się od hydroksylacji progesteronu przy C-17. Boczny łańcuch
zawierający C-20 i C-21 jest odszczepiany i powstaje androstendion. Testosteron jest tworzony przez
redukcję grupy ketonowej przy C-17 androstendionu. Estrogeny są syntetyzowane z androgenów
przez usunięcie kątowej grupy metylowej przy C-19 i utworzenie aromatycznego pierścienia A. Z
androstendionu powstaje estron , natomiast estradiol powstaje z testosteronu.

-50-

9.1.Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych:

9.1.1.Reakcja Zimmermanna
Zasada:

w środowisku alkalicznym

17-ketosteroidy

(androsteron, androstendion,

dehydroepiandrosteron) kondensują z m-dwunitrobenzenem na pochodne o barwie fiołkowo-
różowej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :alkohol etylowy absolutny (100%)
96% alkohol etylowy
2% m-dwunitrobenzen
2,5 mol/l KOH w alkoholu etylowym

Do probówki wsypać około 10

g androsteronu, a następnie dodać kolejno przy pomocy pipety

automatycznej (200

0,2 ml alkoholu etylowego absolutnego (100%)

2. 0,2 ml 2% m-dwunitrobenzenu
3. 0,2 ml 2,5mol/lKOH,

po czym inkubować roztwór przez okres minimum 30 minut w ciemności w temperaturze
pokojowej. Po tym okresie w celu zahamowania reakcji dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego.
Powstaje zabarwienie fiołkowo-różowe.

9.1.2.Reakcja Kobera
Zasada: w obecności stężonego kwasu siarkowego, estrogeny z hydrochinonem tworzą różowo-żółte
zabarwienie o zielonej fluorescencji. Jest to reakcja specyficzna dla aromatycznego pierścienia A
estrogenów.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: estradiol
odczynnik Kobera (70%H

+ hydrochinon)

Do probówki wlać około 10

l estradiolu i dodać 2 ml odczynnika Kobera. Następnie ogrzewać we

wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut. Po tym okresie oziębić probówkę pod bieżącą zimną wodą.
Po oziębieniu dodać 0,2 ml H

O i ponownie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na okres 10 minut. Po

oziębieniu powstaje żółto- kremowe zabarwienie które pod lampa kwarcową daje zieloną
fluorescencję .

9.1.3.Reakcja Portera-Silbera
Zasada: jest to reakcja charakterystyczna tylko dla 17-hydroksykortykosteroidów, czyli
posiadających grupę hydroksylową przy C

(kortyzon, kortyzol). Z chlowodorkiem

fenylohydrazyny, w obecności kwasu siarkowego powstaje żółty hydrazyn.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kortyzol lub kortyzon
odczynnik Portera-Silbera (chlorowodorek fenylohydrazyny + kwas siarkowy)

Do probówki wlać około 10

l kortyzolu a następnie dodać 1 ml odczynnika Portera_Silbera.

Probówkę wstawić do gorącej łaźni wodnej na około 5 minut, powstaje żółte zabarwienie.

9.1.4.Reakcja z błękitem tetrazoliowym.
Zasada: reakcję tę dają wszystkie kortykosteroidy posiadające ugrupowanie

-ketalowe w łańcuchu

bocznym przy C

( kortyzol, kortyzon, aldosteron). Redukują one błękit tetrazoliowy do różowego , a

przy dużych ilościach sterydu do niebieskiego formazonu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kortyzol lub kortyzon
roztwór błękitu tetrazoliowego (1mg błękitu w 1ml 2mol/l NaOH)

Do probówki wlać 10

l kortyzolu po czym dodać 1 ml roztworu błękitu tetrazoliowego. Powstaje

różowe zabarwienie.

-51

10.HEMOGLOBINA

Warunkiem wiązania tlenu przez hemoglobinę, białka należącego do grupy hemoprotein jest
obecność jednostki niebiałkowej, a mianowicie grupy hemowej. Składa się ona z części organicznej i
atomu żelaza. Część organiczna protoporfiryna, zbudowana jest z czterech pierścieni pirolowych,
połączonych mostkami metanowymi w pierścień tetrapirolowy. Do tego pierścienia przyłączone są
łańcuchy boczne, z których cztery są grupami metylowymi, dwa – grupami winylowymi i dwa –
resztami kwasu propionowego.

Atom żelaza w grupie hemowej , umieszczony w centrum pierścienia protoporfiryny, wiąże się z
czterema atomami azotu wiązaniami koordynacyjnymi, piąte wiązanie – z tlenem (zachodzi proces
utlenowania), a szóste wiązanie koordynacyjne służy do połączenia z białkiem przez pierścień
imidazolowy histydyny.

W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-
O

). W przypadku utleniania żelazo zmienia swój stopień utlenienie z Fe

do Fe

z jednoczesnym

przyłączeniem cząsteczki H

O, powstaje methemoglobina (Met-Hb).

Hemoglobina jest przenośnikiem tlenu w organiźmie w postaci oksyhemoglobiny. tj. hemoglobiny
utlenowanej. Cząsteczka hemoglobiny może przyłączyć 4 cząsteczki tlenu atmosferycznego, 1g
hemoglobiny wiąże 1,36 ml tlenu. Proces utlenowania hemoglobiny i trwałość powstałej
oksyhemoglobiny zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu, tzn. od jego stężenia.
Oksyhemoglobina pod działaniem kwasów, zasad i rozpuszczalników organicznych, jak etanol lub
aceton, przechodzi w parahematynę, inaczej nazywaną hemichromogenem. Część białkowa jest tu
zdenaturowana, a żelazo – w postaci Fe

. Redukując hemichromogen otrzymuje się hemochromogen,

zbudowany z hemu i zdenaturowanej globiny .

Grupa winylowa

Grupa metylowa

Reszta kwasu propionowego

Sposób połączenia hemu z białkiem

-52-

Hematyna może powstać z hemoglobiny przez działanie na nią zasadą (hematyna zasadowa) lub
kwasem (hematyna kwasowa), w warunkach tlenowych, zawiera ona Fe

i nie ma części białkowej.

Zarówno kwasy, jak i zasady rozbijają hemoglobinę, przy czym uwolniony hem utlenia się tlenem z
Hb-O

na hematynę, a globina ulega denaturacji. Oksyhemoglobina pod działaniem gorącego

stężonego roztworu CH

COOH i NaCl traci białko i w ten sposób powstaje hemina z żelazem Fe

+3.

Hemina rozpuszczona w wodorotlenku przechodzi w hematyną zasadową.
Łagodne, nie denaturujące globinę, środki utleniające hemoglobinę, jak H

2,, ,

[Fe(CN)

KMnO

, zmieniaja ją w methemoglobinę (Met-Hb), w której zamiast hemu występuje hematyna z

żelazem Fe

HbO

+ [Fe(CN)

]

→

Met-Hb + [Fe(CN)

]

+ O

Barwniki hematynowe nie wiążą tlenu, CO i dają barwne pochodne z cyjankami
(cyjanomethemoglobina). Trujące działanie cyjanków polega na blokowaniu układu hemowego
enzymów biorących udział w utlenieniach tkankowych.
Z hemoglobiną 300-krotnie silniej niż tlen łączy się tlenek węgla, w wyniku czego powstaje
hemoglobina tlenkowowęglową,- karboksyhemoglobina (Hb-CO). Zdolność wiązania CO mają
chromoproteiny zawierające hem, natomiast proteiny hemetynowe właściwości tej nie wykazują.
Silne toksyczne działanie tlenku węgla wiąże się z wyłączeniem hemoglobiny z udziału w
transportowaniu tlenu i blokadą oksydazy cytochromowej, uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.

10.1.Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych:

10.1.1.Otrzymywanie methemoglobiny

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: krew (nie rozcieńczona)
K

[Fe(CN)

]

Do probówki wlewamy około 0,5 ml krwi nie rozcieńconej a następnie dodajemy parę kropli
roztworu heksacyjanożelazianu (żelazicyjanku) potasowego K

[Fe(CN)

]. Pod działaniem tego środka

utleniającego Hb-O

przechodzi w Met-Hb. Krew przybiera zabarwienie brunatne.

10.1.2.Otrzymanie hematyny kwasowej

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 10-krotnie rozcieńczona krew
2 MHCL

-53-

Do probówki wlać 2 ml rozcieńczonej krwi , następnie dodać 3-4 krople 2M HCl. Roztwór zmienia
barwę na brunatną ponieważ hemoglobina ulega rozkładowi na globinę i hematyną kwasową. Z
hematyny w obecności jonów Cl

tworzy się chlorowodorek hematyny – hemina.

10.1.3.Otrzymanie hematyny zasadowej i hemochromogenu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:10-krotnie rozcieńczona krew
5%NaOH
Na

krystaliczny

Do probówki wlać około 2 ml rozcieńczonej krwi dodać 5 kropli 5% NaOH i łagodnie podgrzać.
Zawartość probówki przybiera zabarwienie brunatne wskutek utworzenia hematyny zasadowej. Po
dodaniu kilku kryształków Na

barwa zmienia się na czerwoną w wyniku powstania

hemochromogenu. Reakcję oglądać pod światłem!. Dwutionian sodu redukuje hematynę do hemu ,
który ze zdenaturowaną globiną tworzy hemochromogen.

10. PRODUKRY ROZKŁADU HEMU

Normalne krwinki czerwone (erytrocyty) człowieka żyją około 120 dni. Stare komórki są usuwane z
obiegu i rozkładane przez śledzionę. Część białkowa hemoglobiny ulega hydrolizie do składników –
aminokwasów. Pierwszy etap rozpadu grupy hemowej do bilirubiny to rozszczepienie jej mostka

-metinowego i utworzenie biliwerdyny, łańcuchowego tetrapirolu. Powstająca biliwerdyna (o barwie

zielononiebieskiej) występuje w dwóch formach tautomerycznych ; jedna z nich zawiera dwie grupy
–OH na końcu układu, zaś druga dwie grupy karbonylowe. W następnej reakcji biliwerdyna pod
wpływem specyficznej reduktazy biliwerdyny współdziałającej z NADPH + H

, jest zredukowana

do bilirubiny ( o barwie pomarańczowo-żółtej).

Degradacja hemu do bilirubiny

-54-

Bilirubina wytworzona w śledzionie oraz w innych tkankach poza wątrobowych musi być
dostarczona do wątroby , tam bowiem zachodzi jej dalszy metabolizm. Tak więc bilirubina w
kompleksie z albuminą surowicy jest transportowana do wątroby, gdzie staje się bardziej
rozpuszczalna przez przyłączenie reszt cukru . Produkt sprzężenia bilirubiny z dwoma
glukuronianami, zwany diglukuronidem bilirubiny , dostaje się do żółci, a następnie wraz z nią
przedostaje się do jelita.

W ostatnim odcinku jelita cienkiego i na początku jelita grubego, pod wpływem bakteryjnej hydrolizy
następuje hydroliza mono- jak i diglukuronianów bilirubiny. Uwolniona wtedy bilirubina jest
następnie zredukowana do mezobilirubiny (związku o barwie żółtej). W trakcie dalszych reakcji
następuje redukcja grup metanowych, a także dochodzi do likwidacji wiązań podwójnych w
pierścieniach pirolowych, co ostatecznie prowadzi do powstania bezbarwnego urobilinogenu
( zwanego także sterkobilinogenem). Większość tworzonego urobilinogenu jest w jelicie grubym przy
udziale enzymów bakteryjnych utleniana do barwnej urobiliny i wydalana z kałem.

-55-

11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych

11.1.1.Próba Gmelina
Zasada: stężony kwas azotowy utlenia barwniki żółciowe na pochodne o zmieniającej się barwie od
zielonej, poprzez niebieską, fioletową, czerwoną do żółtej. Barwy te odpowiadają kolejnym
produktom utlenienia bilirubiny.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki rozcieńczona żółć
HNO

stężony

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie bardzo ostrożnie! po ściankach
probówki wlać 1 ml stężonego kwasu azotowego. Ostrożnie ,ale bardzo dokładnie wymieszać
zawartość probówki.. Po 5 do 10 minutach na pograniczu obu płynów powstaje warstwa
czerwona i zielona.

11.1.2 .Próba Rosina
Zasada: próba polega na utlenieniu barwników żółciowych barwnikiem utleniającym w tej reakcji
jest roztwór jodu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
5% roztwór jodu

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie ostrożnie dodać 2-3 kropli jodu.
Bilirubina utlenia się na zieloną biliwerdynę.

11.1.3 Próba Cole’a

Zasada: barwniki żółciowe mogą zostać zaadsorbowane przez siarczan baru (BaSO

w kwaśnym,

etanolowym roztworze. Dodając chloran potasu (KClO

), można utlenić bilirubinę i biliwerdynę na

połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
MgSO

nasycony

10%BaCl

etanol
H

stężony

2%KClO

W erlenmajerce zagotować 5 ml żółci, następnie dodać 2 krople nasyconego MgSO

i około 1ml

10% chlorku baru (BaCl

)

Wytrąca się osad. Roztwór z osadem ponownie zagotować. Po

zagotowaniu przesączyć roztwór do probówki. Pobrać trochę osadu z sączka przy pomocy bagietki
szklanej lub metalowej do kolejnej probówki , dodać 4 ml etanolu oraz 3 krople stężonego H

kroplę KCLO

. Nie mieszać!!!!.

Gotować na płytce nad palnikiem przez 30 sek., po czym odstawić probówkę na 2 -5 minut. Po
opadnięciu osadu BaSO

warstwa etanolu zabarwia się na kolor zielono –niebieski. Jest to

utleniona bilirubina i biliwerdyna.

11.1.4.Próba Schlesingera
Zasada: jest to próba pozwalająca wykryć obecność urobiliny w moczu, jako produkt utleniania
urobilinogenu. Urobilina z solami cynku daje zieloną fluorescencję.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocz
5 % roztwór J

10% alkoholowy roztwór octanu cynku

Do probówki wlać około 3 ml moczu a następnie dodać 1-3 kropel 5% roztworu jodu. Odstawić na 5
minut , po czym dodać 3 ml 10% roztworu octanu cynku. Wymieszać i pozostawić do opadnięcia

osadu .Oglądać zieloną fluorescencję pod lampą kwarcową !

-56-

12.WITAMINY

Witaminy są cząsteczkami organicznymi, niezbędnymi w małych ilościach w pożywieniu zwierząt
wyższych. Spełniają one prawie taka sama rolę we wszystkich organizmach , ale tylko zwierzęta
wyższe utraciły zdolność ich syntezy. Witaminy dzielimy na rozpuszczalne w wodzie i rozpuszczalne
w tłuszczach
Rozpuszczalnymi w wodzie są: witamina C, grupa związków znana jako witaminy B kompleks oraz
witamina H.
Witamina C to zjonizowana forma kwasu askorbinowego. Objawem awitaminozy kwasu
askorbinowego jest schorzenie nazywane szkorbutem (gnilecem). Są to uszkodzenia naczyń
włosowatych i związane z tym krwawienie dziąseł i wypadaniem zębów. Występuje głownie w
świeżych owocach i warzywach. Kwas askorbinowy spełnia w organizmie funkcje czynnika
redukujcego w wielu reakcjach do których zalicza się syntezę kolagenu, amin katecholowych oraz
biosyntezę kwasów żółciowych.

Tiamina (witamina B

aneuryna) Pirofosforan tiaminy jej ufosforylowana forma jest koenzymem

transferaz. Awitaminoza witaminy B

nosi nazwę beri-beri i występuje przy odżywianiu się

wyłącznie odtłuszczonym ryżem. Jest poważnym problemem w krajach Dalekiego Wschodu. Podczas
tej choroby występują schorzenia neurologiczne i kardiologiczne, które objawiają się uszkodzeniami
obwodowego układu nerwowego, bólem nóg i rąk, osłabieniem mięśni i zmianami wrażliwości skóry
Serce może być powiększone i występuje niewydolność krążenia. Beri-beri jest schorzeniem które
spotkać można u chronicznie niedożywionych alkoholików.

Ryboflawina (witamina B

) jest grupa czynną koenzymów oksydoredukcyjnych (FMN, FAD)

Awitaminoza tej witaminy powoduje u zwierząt zahamowanie wzrostu i schorzenia skórne, u
człowieka są to zapalenia skóry oraz zmiany zapalne w okolicy warg.

-57-

Amid kwasu nikotynowego (niacyna, witamina PP) to amid kwasu pirydyno-3-karboksylowego
jest grupą czynną koenzymów osydoredukcyjnych (NAD

, NADP

). Niedobór kwasu nikotynowego

prowadzi do zmian skórnych zwanych pelegrą oraz do biegunki i delirium.

Kwas pantotenowy (kompleks B

jest dwupeptydem , który w połączeniu z cysteaminą tworzy

pantoteinę będącą składnikiem koenzymu A. Pełni funkcję jego prekursora. Brak kwasu
pantotenowego powoduje siwienie włosów u szczurów, pelagrę u drobiu. U człowieka jednak
objawy nie są znane.

Folian (kompleks B

) jest pochodną pterydyny, a formą czynną biochemicznie jest kwas

tetrahydrfoliowy , który jest koenzymem transferaz. U człowieka niedobór folianu objawia się
przede wszystkim zamianami obrazu krwi – anemią. Przyczyną tych zmian patologicznych jest nie
tyle niedobór folianu w pokarmie , ile zaburzenia w jego wykorzystaniu..

Pirydoksyna (witamina B

) jest pochodną pirydyny i stanowi składnik fosforanu pirydoksalu,

będącego ważnym koenzymem w przemianie aminokwasów .Niedobór witaminy B

nie daje

typowego obrazu chorobowego. U dzieci obserwowane są drgawki epileptyczne, które spowodowane
są zaburzeniami w przemianie kwasu glutaminowego. Niekiedy występują również objawy łojotoku .

-58-

Kobalamina (B

) jest czynnikiem zapobiegającym anemii złośliwej. Już małe jej ilości leczą u

człowieka objawy tej choroby, która przejawia się znacznym zmniejszeniem ilości erytrocytów we
krwi. Awitaminoza ta spowodowana jest jednak nie brakiem witaminy w pożywieniu, a zaburzeniami
w resorpcji jej z przewodu pokarmowego .Pochodne kobalaminy uczestniczą w reakcjach
przekształceń wewnątrzcząsteczkowych. Funkcjonują miedzy innymi jako koenzymy w reakcji
przekształcania metylomalonylo-CoA do bursztynylo-CoA

Biotyna (witamina H) jest koenzymem transferaz.

U zwierząt objawy awitaminozy polegają na

zmianach skórnych i wypadaniu włosów. Awitaminozę tę powoduje podawanie specyficznego białka
awidyny (białko jaja kurzego) które silnie wiąże biotynę i w ten sposób ją inaktywuje.

Rozpuszczalne w tłuszczach to witaminy A, D, E i K

Witamina A (retinol) jest prekursorem retinolu, wrażliwej na światło rodopsyny i innych barwników
wzrokowych. Brak tej witaminy prowadzi do niedowidzenia o zmierzchu (tzw. kurzej ślepoty).
Ponadto młode zwierzęta potrzebują witaminy A do wzrostu. Kwas retinowy, aktywuje transkrypcję
specyficznych genów, które pośredniczą we wzroście i rozwoju.

-59-

Cholesterol jest prekursorem witaminy D , która odgrywa zasadniczą rolę w kontrolowaniu
metabolizmu wapnia i fosforu. 7-dehydrocholesterol (prowitamina D

), w wyniku reakcji

fotochemicznej zachodzącej pod wpływem promieniowania nadfioletowego, zmienia się w witaminę
D

3. .

Brak witaminy D w dzieciństwie powoduje krzywicę charakteryzującą się zaburzeniami w

wapnieniu chrząstek i kości. U dorosłych brak tej witaminy prowadzi do rozmiękania i osłabiania
kości w procesie zwanym ostemolacją.

Witaminę E (

-tokoferol) odkryto jako czynnik zapobiegający bezpłodności samic szczura.

Objawami niedoboru tej witaminy są: u samic resorpcja płodu a u samców atrofia męskich gruczołów
rozrodczych i dystrofia mięśni.

Witamina K , jest potrzebna do prawidłowego krzepnięcia krwi . Spośród czynników biorących
udział w procesie krzepnięcia zmiany dotyczą przede wszystkim protrombiny, która w przypadku
niedoboru tej witaminy nie jest syntetyzowana w wystarczającej ilości.

-60-

12.1.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie:

12.1.1.Wykrywanie obecności witaminy B

– metoda Jensena

Zasada: jest to metoda tiochromu polegająca na łagodnym utlenieniu witaminy B

żelazicyjankiem

potasu K

Fe(CN)

w środowisku alkalicznym. Powstały produkt utlenienia tiaminy – tiochrom silnie

fluoryzuje na niebiesko w świetle nadfiołkowym.
Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór witaminy B

metanol
1%K

Fe(CN)

30% NaOH
alkohol izobutylowy

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

a następnie dodać 1 ml metanolu oraz przy ciągłym

mieszaniu 0,1ml 1% roztworu K

Fe(CN)

i 1 ml NaOH. Tak przygotowaną mieszaninę odstawić do

statywu na około 1 minutę. Po upływie tego czasu dodać 6 ml alkoholu izobutylowego i silnie
wytrząsnąć. Po oddzieleniu warstwy alkoholowej oglądać reakcję pod lampą kwarcową

11.1.2.Wykrywanie obecności witaminy B

2 –

metoda Eulera i Adlera

Zasada: roztwory wodne witaminy B

, w środowisku obojętnym dają żółto-zieloną fluorescencję

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór wodny witaminy B

mieszanina pirydyny, wody i metanolu

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

dodać 2 ml mieszaniny pirydyny , wody i metanolu.

Reakcję oglądać pod lampą kwarcową – widoczna jest żółto-zielona fluorescencja witaminy B

12.1.3.Wykrywanie witaminy B

– metoda Greena

Zasada: Witamina B

z chlorkiem żelazowym tworzy połączenia o barwie czerwonej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór witaminy B

10% FeCl

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B

dodać kilka kropel 10 % FeCl

- powstaje czerwone

zabarwienie.

12.2.Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach;

12.2.1. Wykrywanie witaminy A - metoda Carra i Price’a
Zasada: chloroformowy roztwór witaminy A z odczynnikiem Cara i Price’a (chloroformowy roztwór
trójchlorku antymonu SbCl

) daje niebieskie zabarwienie.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: chloroformowy roztwór witaminy A
odczynnik Cara i Price’a

Do probówki nalać 1 ml odczynnika Carra i Price’a a następnie 3 do 5 kropel witaminy A – pojawia
się niebieskie zabarwienie.

-61-

12.2.2.Wykrywanie witaminy D

w tranie

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: chloroformowy roztwór tranu (1:1)
chloroformowy roztwór bromu (1: 60)

Do suchej probówki wlać 1 ml chloroformowego roztworu tranu i 1 ml roztworu bromu. Przez krótki
okres czasu utrzymuje się zielone zabarwienie.

12.2.3.Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe

Zasada: podczas utleniania tokoferolu za pomocą Fe

przechodzi on w tokoferolochinon o

zabarwieniu czerwonym.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: etanolowy roztwór witaminy E
0,2% FeCl

(w bezwodnym etanolu)

Do probówki wlać 2 ml roztworu witaminy E dodać 0,5 ml roztworu FeCl

. Po dokładnym

wymieszaniu pojawia się czerwone zabarwienie.

-62-

12.3. Ilościowe oznaczanie witaminy C w liściach kapusty

Zasada: Metoda oznaczania oparta jest na wykorzystaniu własności redukujących kwasu
askorbinowego. Ilość kwasu askorbinowego w analizowanym materiale biologicznym oznacza się
przez miareczkowanie mianowanym roztworem soli sodowej 2,6-dichlorofenoloindofenolem. Jest to
barwnik będący równocześnie wskaźnikiem końcowego punktu miareczkowania. W środowisku
kwaśnym przybiera on barwę różową , a w zasadowym – niebieską.

Barwnik utlenia kwas askorbinowy do 2,3-dehydroaskorbinowego, a sam redukuje się do
bezbarwnego związku. Analizowana próbka pozostaje bezbarwna, dopóki zawiera kwas askorbinowy.
Nadmiar barwnika, nie ulegający redukcji, powoduje wystąpienie różowego zabarwienia
roztworu.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: liście kapusty
2% kwas szczawiowy
2,6 –dichlorofenoloindofenol

Odważyć 12,5 g pokrojonych liści kapusty. Rozetrzeć bardzo dokładnie odważoną kapustę w
moździerzu porcelanowym z 20 ml 2 % roztworu kwasu szczawiowego. Rozdrobniony materiał
przenieść ilościowo do 50 ml cylindra miarowego i uzupełnić do objętości 50 ml
2% roztworem kwasu szczawiowego. Wymieszać bardzo dokładnie i przesączyć przez sączek do
suchej zlewki.
Z przesączu odpipetować do dwóch 50 ml kolbek po 5 ml przesączu i szybko !!!!! miareczkować
roztworem barwnika do momentu wystąpienia różowego trwałego zabarwienia.
Wiedząc, że 1 ml barwnika utlenia 88

g kwasu askorbinowego , obliczyć stężenie kwasu

askorbinowego w analizowanym materiale. Wyniki podać w mg/100mg

12.4.Ilościowe oznaczenie witaminy C w mleku

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : mleko
CH

COOH lodowaty

2,6 –dichlorofenoloindofenol

Do 200 ml kolbki odpipetować 10 ml mleka , dodać 1 ml kwasu octowego lodowatego i 40
ml wody destylowanej. Wymieszać i natychmiast miareczkować roztworem 2,6-
dichlorofenoloindofenolem aż do uzyskania różowego zabarwienia analizowanej próbki.
Wyniki podać w mg/100ml mleka.

Sprawozdanie z ćwiczeń:

Napisać sprawozdanie z ćwiczeń w którym przedstawić obliczenia stężenie witaminy C w kapuście i

w mleku.

-63-

13.ENZYMY

Enzymy to białka o własnościach katalitycznych, które posiadają zdolność zwiększania szybkości
reakcji chemicznej. Obniżają energie aktywacji , same jednak nie ulegają przemianie , dlatego też nie
zużywają się bezpośrednio w wyniku reakcji. Większość enzymów składa się z części białkowej
czyli apoenzymu oraz z części niebiałkowej czyli grupy prostetycznej lub koenzymu. Na powierzchni
enzymu znajduje się zagłębienie będące miejscem wiązania substratu nazywane centrum aktywnym.
Przestrzenne dopasowanie substratu do centrum aktywnego enzymu umożliwia ich związanie i
wytworzenie kompleksu enzym substrat (ES)
Ogólnie równanie reakcji enzymatycznej można przedstawić w następujący sposób:

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu
reakcji katalizowanej:
Klasa 1: Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji (np. dehydrogenaza,
reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza, peroksydaza)
Klasa 2: Transferazy- enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi
związkami (np. transaldolaza, transketolaza, , amino-, petptydylo-,acylo-, metylo-, glukozylo-, fosfo-
transferaza, kinaza)
Klasa 3: Hydrolazy – enzymy katalizujące rozkład różnych wiązań chemicznych z udziałem
cząsteczki wody ( np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, lipaza, amylaza,
peptydaza)
Klasa 4: Liazy (syntazy) – enzymy katalizujavce odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczki
wody lub dołączenie grup do wiązań podwójnych (np. dekarboksylaza, aldolaza, hydrataza,
dehydrtataza)
Klasa 5: Izomerazy – enzymy katalizujące reakacje izomeracji ( np.racemaza, epimeraza)
Klasa 6: Ligazy ( syntetazy) – enzymy katalizujące wytworzenie wiązań pomiędzy atomami w
cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)
Aktywność enzymu:

Międzynarodowa jednostka enzymu (U)– jest to aktywność enzymu która katalizuje

przemianę 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w temp. 30

C w optymalnych warunkach

Katal (kat)- aktywność enzymu który przekształca 1 mol substratu w casie 1 sekundy w

temperaturze 30

C w optymalnych warunkach.

Stężenie enzymu wyraża się jako stężenie aktywności w płynie biologicznym czyli liczbę zawartych
w 1 l roztworu (U/l lub kat/l) bądź w mol/l (M) . W celach diagnostycznych w płynach biologicznych
(surowica, mocz) oznacza się stężenie enzymów takich jak fosfataza alkaliczna, kwaśna, amylaza,
dehydrogenza mleczanowa, aminonotransferaza asparaginowa i alaninowa)

Mechanizm katalizowanej reakcji z udziałem jednego substratu

E - enzym, S - substrat, P - produkt, k

i k

- stałe szybkości reakcji przebiegających w prawą stronę,

-1

i k

-2

- stałe szybkości reakcji zachodzących w lewą stronę. W założeniach modelu kinetyki

Michaelis-Mentena zakłada się, że produkt (P) nie może ulec powrotnemu przekształceniu w
wyjściowy substrat, w reakcji ze stałą szybkości k

-2

-64-

13.1.Kinetyka reakcji enzymatycznych
Badaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności
pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu.
Szybkość reakcji zależy od wielu różnych czynników, a mianowicie od chemicznej struktury
reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu)
od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.
Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między
szybkością reakcji , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji
w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.
Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i
oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten
przyrost (ubytek) nastąpił.

r x
V =
r t
V = szybkość reakcji enzymatycznej
x = stężenie produktu
t = czas (min. sek)

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić
następująco:

rx
V = = k (a –x)
rt
r = przyrost
v = prędkość
t = czas
a = stężenie substratu
x = stężenie produktu
k = stała reakcji

powyższy wzór można zapisać jako równanie :
rx/ rt = k( a-x )
aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

k = 1 ln a = 2.303 x log a
t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303
a
log a - x
k = x 2.303

-1

t
k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min

-1

, sek

-1

itd.

-65-

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

13.1.1. Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy
sacharozy
Zasada

: sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością

cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość
powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża
się w dowolnych jednostkach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony)
6 M HCL
10% NaOH
0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy)
1% kwas pikrynowy

Przygotować 7 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml
6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z
roztworem NaOH ( czas t = O). Do kolejnych probówek z 10% NaOH wprowadzać po 1 ml
hydrolizatu po upływie: 5, 10, 15, 20, 25, i 30 minut.
Następnie dodać do wszystkich probówek po 2ml 1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i
wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić i dodać do każdej po
4 ml wody, próbki są gotowe do pomiaru absorbancji.
Wartość absorbancji oznaczyć przy

= 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).

Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu
sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowej
Standardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5
– 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą

↓

Nr .

probówki

Standard

(ml)

10%NaOH

(ml)

6M HCL

(ml)

1% kwas

pikrynowy

(ml)

Łaźnia

Wodna

100

(ml)

„0”

0,5

5 min.

0,1

0,4

0,5

0,2

0,3

0,5

0,3

0,2

0,5

0,4

0,1

0,5

-66-

0znaczyć wartość absorbancji przy

= 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a

następnie: wykreślić krzywą standardową na papierze milimetrowym na podstawie podanego
poniżej przykładu

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas

(t)

( min.)

Stężenie

produktu

(x)

Stężenie

substratu

(a – x)

a-x

Log

a - x

Wykonać sprawozdanie z przeprowadzonych ćwiczeń:

Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu
2. stałą k dla reakcji I rzędu

-67-

13.2 .Enzymy - reakcje barwne

I. Oksydoreduktazy:
Katalaza i peroksydaza
Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w
erytrocytach, a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H

ze środowiska

reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form
tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą
(donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega
zgodnie z równaniem
H

+ H

→

+ 2H

Peroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym
ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach
katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne
związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru .

+ H

→

A + 2H

13.2.1. Wykrywanie katalazy
Zasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru
po dodaniu kilku kropli krwi

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10
3% H

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej
probówki wlewamy około 1 ml 3% H

.Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie

tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod
kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H

Banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ

enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

13.2.2. Wykrywanie peroksydazy
Zasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z
nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10
CH

COOH

3% H

benzydyna – nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli
3% H

i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

II.Oksydazy
Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i
elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie
komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce
śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi
do powstania wody zgodnie z równaniem:

+ ½ O

→

A + H

-68-

13.2.3.Wykrywanie oksydazy fenolowej
Zasada: enzym ten katalizuje proces utleniania fenolu. Fenol utlenia się najpierw do pirokatcholu, a
następnie do chinonu, który daje pochodne o barwie brązowej.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: sok – miąższ ziemniaczany
1% roztwór fenolu

Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie
dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie
brązowe, które z czasem nasila się.

13.2.4. Wykrywanie oksydazy polifenolowej
Zasada: oksydaza polifenolowa katalizuje utlenianie wielofenoli do barwnych chinonów, które dalej
kondensują na pochodne, zabarwione żółto lub brązowo. Z pirogallolu powstaje żółta purpurogallina.
Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym Cu

+2.

. Występuje w wielu warzywach i owocach.

Wykonanie oznaczenia
Odczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany
1% roztwór pirogallolu

Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W
wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.

III. Hydrolazy
Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w
wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej.

13.2.5.Rozkład mocznika pod wpływem ureazy.
Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH
7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO

i NH

ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego.

Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy:

CO + H



+ 2NH

→

(NH

)

+ H

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocznik
ureaza
fenoloftaleina

Do probówki wlać 1 ml mocznika ,a następnie dodać 1 ml roztworu urazy oraz 2 krople
fenoloftaleiny. Bezbarwny początkowo roztwór czerwienieje po paru minutach.

-69-

13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę
Zasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy
wiązania pomiędzy

-D-glukopiranozą i

-D-fruktofuranozą w sacharozie, która jest nieredukującym

disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: świeże drożdże
1% roztwór sacharozy
Fehling I i I

Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech
probówek (1,2,3)

Probówka – 1

Probówka - 2

Probówka - 3

1ml zawiesiny drożdży

2 ml sacharozy

2 ml wody

zagotować nad palnikiem

Łaźnia wodna 37

C -2 min

Odstawić do statywu

2 ml sacharozy; odstawić

Reakcja Fehlinga

Reakcja dodatnia

Reakcja Fehlinga
Reakcja ujemna

Reakcja Fehlinga: do probówki wlać 1 ml Fehlinga I i 1ml Fehlinga II oraz 1 ml z zawartość

probówki -1, powtórzyć tę samą czynność z probówkami 2 i 3 . Następnie probówki umieścić we
wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. O obecności cukrów redukujących świadczy pomarańczowo
ceglasty osad. Jest to dodatni wynik reakcji Fehlinga.

Reakcja i zabarwienie pierwszej probówki (1) wskazuje na obecność enzymu inwertazy w
drożdżach ponieważ nastąpiła hydroliza sacharozy na cukry proste posiadające własności redukujące.
W probówce drugiej (2) wykazano ,że sam roztwór drożdży nie zawiera substancji redukujących
.Reakcja w próbówce trzeciej (3) wykazała że drożdże posiadają zdolność hydrolizy sacharozy, lecz
enzymy biorące udział w tej reakcji są nieczynne pod wpływem wysokiej temperatury.

13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta
Zasada: amylaza śliny to enzym zaliczany do hydrolaz (podklasa glikozydazy) jest aktywowana
jonami chlorkowymi. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych typu

-1,4 wewnątrz cząsteczek

łańcucha polisacharydowego skrobi.
Wyróżniamy:

- amylazy

α−

amylaza (endoamylaza dekstrynotwórcza) hydrolizuje cząsteczkę skrobi od środka łańcucha,

rozrywając wiązania

-1-4-glikozydowe z pominięciem

-1-6 glikozydowych. Powstają wówczas

nisko-
cząsteczkowe dekstryny oraz

-maltoza, nie dająca zabarwienia z jodem

β−

amylaza (egzoamylaza dekstyrnotwórcza) hydrolizuje co drugie wiązanie

-1-4 glikozydowe,

począwszy od końca nie aldehydowego, w wyniku czego następuje hydroliza łańcucha skrobi i
powstaje

-maltoza i wysoko-cząsteczkowe dekstryny dające zabarwienie z jodem

Oprócz śliny amylaza występuje również w trzustce.

Za jednostkę wzorcową aktywności amylazy przyjmuje się w metodzie Wolghemuta
taką ilość enzymu, które w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn (nie dających
zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi
Wynik podaje się w ml 1% skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 ml śliny

-70-

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5
1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl
0,02 mol/l J

w KJ

ślina

Do probówki wlać 1 ml śliny (nie sączonej), a następnie dodać 4 ml buforu cytrynianowo-
fosforanowego i wymieszać. Uzyskuje się w ten sposób 5-cio krotne rozcieńczenie śliny.
W statywie przygotować 10 probówek, do pierwszej wlać 4 ml przygotowanej mieszaniny (ślina z
buforem) a do następnych po 2 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego. Z probówki pierwszej pobrać
2 ml mieszaniny i przenieść do probówki drugiej (wymieszać!). Z drugiej probówki pobrać 2 ml i
przenieść do probówki trzeciej i wymieszać! itd. Z probówki dziesiątej odrzucić 2 ml roztworu.

Uzyskuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny probówkach:
1 : 5; 1: 10; 1:20; 1 : 40; 1 : 80; 1: 160 itd.
Odpowiadają one następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4 ; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012 ml
itd.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 38

C na 5 minut, po czym do każdej

probówki dodać po 2 ml 1 % roztworu skrobi w 0,9% NaCl. Zawartość probówek bardzo
dokładnie wymieszać!!!!, i wstawić do łaźni wodnej (38

C) na okres 30 minut. Po upływie tego

czasy do każdej probówki wlać po 3 krople J

w KJ.( zacząć dodawać od probówki w której ślina jest

najbardziej rozcieńczona).
Zaobserwować w której probówce reakcja z jodem jest ujemna (stadium dekstryn nie dających
zabarwienia za jodem)
Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 1 % roztworu skrobi
rozłożonej w ciągu 30 minut.

Obliczenie wyników - przykład
Przypuśćmy , ze stadium dekstryn nie dających zabarwienia z jodem , wystąpił już w probówce
trzeciej. Ilość skrobi 1% w tej probówce równa jest 2 ml, czyli w probówce 3-ciej po 30 minutach
nastąpił rozkład 2-ch ml 1% roztworu skrobi. Ponieważ ta probówka zawierała 0,1 ml śliny
otrzymujemy proporcję:

0,1 ml śliny rozkłada po 30 minutach

→

2 ml 1% skrobi

1 ml śliny rozkłada po 30 minutach

→

x ml skrobi

2 ml
X = = 20 ml 1 % skrobi
0,1ml

czyli 1 ml śliny rozłożył 20 ml 1% skrobi = 20 mg skrobi w czasie 30 minut.
Aktywność amylazy wynosi więc 20 jednostek.

-71-

13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt
gospodarskich

Fosfatazy stanowią w organizmie ssaków grupę szeroko rozpowszechnionych enzymów które
katalizują reakcje hydrolizy estrów fosforanowych. Różnią się one właściwościami
fizykochemicznymi , a przede wszystkim optimum pH, dlatego wyróżnia się fosfatazy kwaśne
(pH 4-6) i zasadowe (pH 8-9). Fosfatazy kwaśne występują w większych ilościach w kościach, jelicie
oraz w wątrobie. Fosfataza zasadowa występuje w wątrobie , nerkach a także w śledzionie , łożysku
i erytrocytach. W obrębie komórek fosfatazy znajdują się przede wszystkim w lizosomach, siateczce
śródplazmatycznej, aparacie Goldiego oraz w cytoplaźmie.
Aktywność fosfataz oznacza się za pomocą syntetycznych substratów jak β-glicerofosforan,
fenylofosforan. W zależności od stosowanego substratu oznaczenie aktywności enzymu opiera się
na określeniu ilości uwolnionego po hydrolizie fosforu (metoda Bodeńskiego) lub ilości
odszczepionego fenolu (metoda Folina Ciocaltou).

W metodzie Bodańskiego fosfatazy surowicy krwi rozkładają β-glicerfosforan na glicerol i
nieorganiczny fosforan. Przebieg reakcji jest następujący:

Zasada: po inkubacji w temp. 37

C w środowisku zasadowym oznacza się ilość odszczepionego

fosforu nieorganicznego. Po dodaniu molibdenianu amonu w środowisku kwaśnym powstaje kwas
fosfomolibdenianowy , który redukuje się . Po dodaniu kwasu 1,2,4 –aminonaftosulfonowego
powstaje związek o niebieskim zabarwieniu

Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: surowica
KH

(zawiera 8μg fosforu w 1 ml)

0,5% β- glicerofosforan sodu
60% CCL

COOH

2,5% molibdenian amonu
0,25% eikonogen (kwas 1,2,4 –aminonaftosulfonowy)

Sporządzenie krzywe standardowej:



(ml)

Stężenie P w
probówkach

Probówka 1

0,5

2,5

→ 4 μg P /3 ml

Probówka 2

1,0

2,0

→ 8 μg P /3ml

Probówka 3

2,0

1,0

→ 16 μg P/3 ml

Probówka 4

3,0

→ 24 μg P/ 3ml

72-

Ślepa próba odczynnikowa:

Do probówki odmierzyć 500μl H

O , a następnie 4 ml β-glicerofosforanu i 500 μl 60%

CCl

COOH. Po dokładnym wymieszaniu odpipetować 1ml mieszaniny do probówki nr 5

a następnie dodać 2 ml H

Ślepa próba surowicy:
Służy do oznaczenia ilości fosforu występującego w stanie wolny w surowicy.

Do probówki dajemy 500μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu i natychmiast!!!! 500μl
CCl

COOH (w celu przerwania reakcji enzymatycznej). Próbkę przesączamy do kolejnej probówki

a następnie odpipetowujemy 1ml przesączu do probówki nr 6

i dodajemy 2ml H

Właściwe oznaczenie fosfatazy zasadowej w surowicy

Do probówki odmierzyć 500 μl surowicy i 4 ml β-glicerofosforanu , a następnie umieścić
probówkę w łaźni wodnej (37

C) na okres 30 minut. Po upływie tego czasu reakcję przerywamy

dodając 500

l CCl

COOH. Następnie próbkę przesączamy. 1ml przesączu odpipetowujemy do

probówki nr 7 i dodajemy 2 ml H

Ustawiamy probówki od 1-7 w statywie i w celu wywołania reakcji barwnej dodajemy do wszystkich
probówek 800 μl roztworu molibdenianu amonu i 200 μl eikonogenu. Bardzo dokładnie próbki
mieszamy i pozostawiamy na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po tym okresie mierzymy
absorbancję próbek przy fali o długości λ = 660nm wobec próby ślepej odczynnikowej

Na podstawie odczytanych wartości absorbancji wykreślić na papierze milimetrowym krzywą
standardową i odczytać ilość μg P znajdującego się w ślepej próbie surowicy i próbie właściwej. Od
ilości fosforu w badanej próbce odjąć wartość uzyskaną dla ślepej próby surowicy (ilość fosforu
występująca w stanie wolnym w surowicy). Różnica odpowiada ilości μg fosforu odszczepionego
czasie inkubacji przez enzymatyczną hydrolizę β-glicerofosfaranu pod wpływem alkalicznej fosfatazy
zawartej w 100μl surowicy

Stwierdzona ilość μg P/ 100 μl surowicy  ilość mg P/ 100ml surowicy = ilość jednostek
Bodeńskiego

Jednostka Bodeńskiego - jest to ilość fosfatazy zasadowej ,która powoduje odszczepienie
1 mg fosforu z β-glicerofosforanu w środowisku o pH 8,6 w ciągu godziny w temp. 37

Document Outline

3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów
- 3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena
Wykonanie oznaczenia:
- 3.1.3. Reakcja z ninhydryną
Wykonanie oznaczenia:
- 4.1.1 Wykazanie amfoterycznego charakteru białek
- 4.3 Denaturacja białek
Wykonanie oznaczenia
- -30-
- 4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów
4.4.Reakcje barwne białek
- 4.4.1 Reakcja biuretowa – wykrywanie białek
- Wykonanie oznaczenia:

Biochemia zwierząt skrypt UR

Document Outline