METODY

MOLEKULARNE

Małgorzata Repa

Lekarski III rok

GS. 45

SEKWENCJONOWANIE

DNA

SEKWENCJONOWANIE DNA

To metoda polegająca na ustaleniu rodzaju i kolejności nukleotydów w DNA, którą

przeprowadza się przy użyciu specjalnych aparatów. Jest najbardziej czułą metodą

wykrywania zmian w materiale genetycznym, co pozwoliło na dokładne poznanie

genomu człowieka.

Typy sekwencjonowania:

 Metoda Sangera (dideoksy)-metoda terminacji łańcucha-metoda

enzymatyczna

 Metoda automatyczna -oparta na znakowaniu fluroescnecyjnym

 Metoda chemicznej degradacji -Maxama i Gilberta

 Metoda cykliczna

 Pirosekwencjonowanie

 Sekwencjonowanie hybrydyzacyjne

PODSTAWY SEKWENCJONOWANIA:

 Czynnością poprzedzającą sekwencjonowanie jest wyznakowanie jednego z

końców cząsteczki DNA np.

izotopem promieniotwórczym

. Następne czynności

mają na celu ustalenie pozycji poszczególnych nukleotydów.

 Przeprowadza

się cztery niezależne reakcje chemiczne

, w których wyniku

cząsteczka DNA jest przecinana odpowiednio w miejscu wystąpienia tyminy,
adeniny, guaniny, cytozyny.

 Warunki reakcji są tak dobrane, aby cząsteczki DNA zostały przecięte możliwie w

jednym miejscu. Miejsce cięcia jest przypadkowe.

 Uzyskanie wielu odcinków sekwencjonowanego oligonukleotydu różniących się

długością. Różnice w długości są związane z pozycjami, jakie w stosunku do końca
wyznakowanego radioaktywnie zajmują poszczególne nukleotydy.

 Elektroforeza mieszaniny fragmentów w żelu poliakryloamidowym porządkująca je

w zależności od wielkości. Produkty każdej z czterech reakcji rozdziela się
niezależnie.

 Ostatnim etapem jest

autoradiografia

i analiza otrzymanych wyników.

METODA SANGERA (METODA DIDEOKSY)

Metoda kontrolowanej terminacji syntezy łańcuchów DNA

Wyparła metodę chemicznego zrywania wiązań jest bardziej wydajna i prosta. Jej

podstawą jest

enzymatyczne kopiowanie cząsteczki DNA

, której sekwencja ma być

określona- do kopiowania wykorzystuje się polimerazę DNA.

 DNA poddawany sekwencjonowaniu nazywa się matrycą.

 Musi być otrzymany w czystej postaci i być homogenny tj. musi zawierać cząsteczki

DNA o tej samej sekwencji (używane najpowszechniej matryce- oczyszczone
plazmidy zawierające klonowane DNA lub DNA otrzymane w reakcji PCR).

 Matrycą jest jednoniciowy DNA odpowiedni do kopiowania przez polimerazę DNA

Początkowo uzyskiwany poprzez:

1.

Klonowanie DNA w wektorze fagowym M13po infekcji E. coli
zrekombinowanym fagiem  tworzyły się jednoniciowe kopie klonowanej
sekwencji.

2.

Obecnie wytwarza się w znacznie szybszy sposób  poprzez alkaliczną lub
termiczną denaturację dwuniciowej matrycy DNA (bez klonowania E.coli).

Do reakcji sekwencjonowania używa się

kilku różnych polimeraz:

 Fragment DNA polimerazy I z E.coli  ragment Klenowa.
 Modyfikowana genetycznie polimeraza z faga T7 sekwenaza.
 Polimeraza DNA Taq.

Polimerazy wymagają do zainicjowania syntezy DNA na jednoniciowej matrycy

krótkiego fragmentu dwuniciowego DNA tworzy się go poprzez dodanie krótkich

jednoniciowych cząsteczek DNA zwanych oligonukleotydowymi starterami

wytwarzanymi na drodze syntezy chemicznej.

Sekwencja starterów tak dobrana, by były komplementarne do matrycy DNA, co

powoduje ich hybrydyzację i formowanie się krótkich dwuniciowych fragmentów

stanowiących miejsce rozpoczęcia syntezy.

Aby zsekwencjonować cząsteczkę DNA, przygotowuje się cztery oddzielne
reakcje enzymatyczne. Każda z nich zawiera:

 Jednoniciowy DNA matryca

 Polimeraza DNA

 Trifosforany nukleotydów (dNTP)- substrat do syntezy DNA

 Starter

 Dideoksynukleotydy difosforanu

(ddNTP) - zmodyfikowane
nukleotydy  cztery ddNTP
odpowiadające czterem zasadom w
DNA (od normalnej dNTP różnią się

brakiem grupy hydroksylowej

przy

węglu cukru rybozy, a każda z
czterech reakcji zawiera inny
ddNTP.

ddNTP są włączane przez polimerazę DNA do wydłużanego polinukleotydu

ALE brak grupy 3’hydroksylowej

Zapobiega formowaniu się wiązań fosfodiestrowych z następnym nukleotydem

Brak dalszego wydłużania syntezowanego polinukleotydu DNA

ddNTP są zatem specyficznymi inhibitorami syntezy DNA.

Synteza DNA kończona jest losowo w zależności czy włączony zostanie:

 ddNTP

blokowanie i zakończenie syntezy

 dNTP

kontynuowanie syntezy przez polimerazę

W efekcie każdej z czterech reakcji otrzymuje się serię cząsteczek DNA o

różnych długościach, a każda z nich zakończona jest w miejscu odpowiadającym

obecności danej zasady w matrycy DNA.

Czyli np. w reakcji sekwencjonowania zawierającej ddATP będzie syntezowana
seria cząsteczek DNA, z których każda zakończona będzie na A, co odpowiada T
w matrycy.

 Po zakończeniu reakcji sekwencjonowania zsyntezowane cząsteczki rozdziela

się wg ich wielkości, za pomącą elektroforezy w żelach poliakryloamidowych.

 Produkty każdej z czterech reakcji są rozdzielane w odrębnej sąsiedniej

ścieżce.

Poprzez dodanie do reakcji dNTP z
radioaktywnym fosforem lub siarką

wykrywanie tego fragmentu przez
umieszczenie żelu
poliakryloamidowego na kliszy
rentgenowskiej autoradiografia.

Po wywołaniu kliszy widoczna seria
prążków tworzących drabinkę.
Sekwencja odczytywana przez
identyfikacje prążków od
najmniejszego do największego.

Sekwencjonowania DNA metodą Sangera

z użyciem znakowanych

dideoksynukleotydów.

A – przykładowa sekwencja DNA

B – przyłączenie startowego
oligonukleotydu do nici matrycowej i
kierunek syntezy DNA

C – produkty syntezy DNA, zakończone
fluorescencyjnie znakowanymi
dideoksynukleotydami (kolorowe litery)

D – elektroforegram rozdziału otrzymanej
mieszaniny fragmentów w elktroforezie
kapilarnej

SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE:

Technika umożliwiająca wykorzystanie systemów półautomatycznych, w których

elektroforeza DNA, wykrywanie i analiza produktów reakcji sekwencjonowania są

przeprowadzane przez urządzenia kontrolowane komputerowo.

 Wykorzystana jest tu właściwość fluorochromów, które mają różną długość emisji

fal.

 Podstawowe zasady reakcji nie ulegają zmianie.

 Cztery rodzaje ddNTP są znakowane kowalencyjnie przyłączonymi barwnikami w

różnych kolorach.

 Reakcję przeprowadza się w jednej mieszaninie. Produkty są rozdzielane za

pomocą elektroforezy w żelach poliakrylamidowych i podczas opuszczania żelu są
wykrywane przez laser który wzbudza fluorescencję barwnika, wykrywaną
następnie przez detektor urządzenia. Na podstawie długości fali emitowanej
fluorescencji przyrząd identyfikuje barwnik (czyli zasadę na końcu każdej cząsteczki
DNA) i na jej podstawie zapisuje kolejność zasad przechodzących przez detektor.

 Automatyczne systemy sekwencjonowania przewyższyły tradycyjne „ręczne”

metody, gdyż:

Sekwencjonowanie prowadzi się w jednej probówce, a produkty rozdziela się w jednej

ścieżce żelu podczas gdy „ręczna” analiza wymagała czterech oddzielnych reakcji i

czterech ścieżek żelu. Ułatwienie to znacznie zwiększyło ilość dostępnych informacji o

sekwencjach DNA.

W ostatnich latach ilość danych sekwencyjnych wzrosła gwałtownie i osiągnęła taki
poziom, że niezbędne stało się zorganizowanie ich w bazach danych:

 Główna baza w Europie- EMBL

 Baza amerykanska- Genbank

Bazy te zawierają zbiory sekwencji genów

człowieka i genów innych gatunków.

HYBRYDYZACJA KWASÓW

NUKLEINOWYCH

HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

 sondy molekularne

 metoda Southerna

 metoda „Northern”

 hybrydyzacja in situ – FISH

 metoda CGH

 metoda mikromacierzy CGH

 technika mikromacierzy ekspresyjnych

HYBRYDYZACJA:

 To zjawisko spontanicznego parowania się zasad pochodzących z różnych nici

kwasów nukleinowych. Poprzedzone denaturacją dwuniciowych kwasów
nukleinowych:

w silnie zasadowym pH

w wysokiej temperaturze

 Może zachodzić pomiędzy dwiema cząsteczkami

-DNA-DNA

-RNA-DNA

-RNA-RNA

 Stabilność przyłączonych odcinków zależy od ilości zasad tworzących wiązania.

 Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów

nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce.

SONDY MOLEKULARNE:

Są to fragmenty kwasów nukleinowych DNA lub RNA o ściśle określonej sekwencji

nukleotydowej, posiadające zdolność wiązania się z wykrywaną komplementarną

sekwencją, mające różnorodne właściwości umożliwiające jej wykrycie. Otrzymuje się

je na drodze klonowania lub syntezy chemicznej:

 sekwencje klonowanego DNA

 DNA otrzymane podczas PCR

 syntetyczne oligonukleotydy

 RNA otrzymane po transkrypcji in vitro sklonowanych sekwencji DNA

Sondy molekularne są odpowiednio wyznakowane:

 radioaktywnie – izotopami H3, P32, S35, C14 oraz I125; hybrydy emitują

promieniowane, detekcja opiera się na naświetlaniu klisz wrażliwych na
promieniowanie w procesie autoradiografii.

 fluorescencyjnie - świecące po wzbudzeniu światłem o określonej długości fali i

różnego typu fluorochromów (rodamina, fluoresceina), detekcja za pomocą
mikroskopu fluorescencyjnego.

 immunochemicznie – do sondy włącza się nukleozyd sprzężony z haptenem (np.

biotyną), wykrywane za pomocą specyficznych przeciwciał (np. awidyna – biotyna)

 enzymatycznie – do sondy włączany jest nukleozyd sprzężony z cząsteczką enzymu,

detekcja z wykorzystaniem barwnych reakcji

ETAPY HYBRYDYZAJCJI:

1.unieruchomienie zdenaturowanego DNA lub RNA na
nośniku stałym

2. inkubowanie w roztworze sondy

3.odpłukanie niezwiązanej sondy

4.wykrywanie hybrydów w zależności od zastosowanego
znacznika sondy

METODY HYBRYDYZACJI:

 hybrydyzajca w roztworach-rzadko stosowana (skomplikowana procedura)

 hybrydyzacja na nośniku stałym- najczęściej stosowany wariant

-metoda Southerna,

-metoda northern,

-hybrydyzacja punktowa,

-odcisk genetyczny,

-hybrydyzacja z replikami kolonii bakteryjnych

 hybrydyzacja in situ

Metoda Southern Blot

 Dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA.

 Wyszukiwanie komplementarnych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów po

trawieniu restryktazami.

 Wykorzystuje zjawisko osmozy do wymuszenia wędrówki przez żel odpowiednich

soli z jednoczesnym pociąganiem za sobą cząsteczek DNA.

PRZEBIEG HYBRYDYZACJI:

1. Trawienie DNA

enzymami restrykcyjnymi

2. Rozdział elektroforetyczny DNA na żelu agarozowym

3. Denaturacja  w warunkach alkalicznych, DNA do formy jednoniciowej

Depurynacja  fragmentacja dłuższych odcinków w celu ułatwienia przeniesienia

na membranę

Neutralizacja  przywraca obojętne pH żelu, co ułatwia wiązanie DNA z membraną

4. Przeniesienie kwasów nukleinowych na membranę nitrocelulozową lub nylonową

5. Utrwalenie poprzez naświetlanie UV, podwyższenie temperatury w celu
wytworzenia wiązań kowalencyjnych

6. Hybrydyzacja DNA z sondą

7. Znacznik uwidacznia kompleks w postaci prążka, intensywność jest pochodną ilości
komplementarnego DNA i aktywności sondy

Metoda Southern Blot

Hybrydyzacja Northern

 Wykorzystywana do

analizy RNA

i procesu transkrypcji poszczególnych genów.

 Można również ocenić długość RNA i intensywność transkrypcji.

 Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w

komórce.

 Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southerna.

 Nie ma konieczności fragmentacji kwasu nukleinowego, ponieważ cząsteczki RNA

są przenoszone z żelu na membraną z dużą wydajnością.

Hybrydyzacja northern obejmuje:

1.

Denaturację RNA i jego

rozdział w denaturującym

żelu agarozowym

(pomijana, gdy nie

interesuje nas długość

wykrywanego RNA).

2.

Przeniesienie RNA z żelu na

membranę i jej utrwalenie.

3.

Inkubacja i hybrydyzacja z

sondą.

4.

Detekcja- uwidacznianie

sondy związanej z

sekwencją RNA.

5.

Sonda daje sygnał

proporcjonalny do ilości

RNA obecnego na

membranie po

intensywności sygnału

można oszacować poziom

wykrytego RNA.

ZASTOSOWANIE:

 Ustalanie kolejności ekspresji genów na danym etapie rozwoju organizmu.

 Poznanie długości RNA badanych genów.

 Określenie intensywności ekspresji genów.

Hybrydyzacja in situ:

 Z łac. in situ - w miejscu naturalnego występowania.

Wykrywanie transkryptów mRNA w nienaruszonych komórkach. Znakowany polipeptyd

tworzy hybrydę z komplementarnymi sekwencjami znajdującego się w komórce kwasu

nukleinowego. Identyfikacja specyficznych sekwencji w:

• preparatach histologicznych
• chromosomach
• pojedynczych komórkach
• skrawkach tkanek
 Wykonywana bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez transferu na podłoże

stałe.

 Sonda podawana na skrawki tkanki pod mikroskopem wnika do cytoplazmy i

hybrydyzuje z mRNA.

 Wizualizacja hybrydów jako zabarwionych obszarów w komórce.
 Poza wykrywaniem określonych sekwencji w DNA i RNA możliwe też precyzyjne

określenie ich lokalizacji przestrzennej.

Hybrydyzacja in situ – FISH

 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization FISH)

 Jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale

genetycznym obecności określonej sekwencji DNA lub jej braku, za pomocą sond
DNA znakowanych odpowiednimi fluorochromami.

 Podczas analizy konieczne jest użycie mikroskopii fluorescencyjnej celem detekcji

sygnału świetlnego po wzbudzeniu fluorochromu w miejscu połączenia się sondy z
DNA badanym.

Najczęściej stosowane fluorochromy:

• FITC

– (

izotiocyjanian fluoresceiny) – zielona fluorescencja;

• TRITC

– (

izotiocyjanian tetrametylorodaminy) – czerwona fluorescencja;

• AMCA

– (amino-methylcoumarin-acetic acid) – niebieska fluorescencja.

Dzięki kombinacjom tych trzech fluorochromów można uzyskać większą

liczbę barw. Aby określić położenie sygnału stosuje się kontrastowe

barwienie jądra i chromosomów. Przed wykonaniem analizy należy

przeprowadzić wstępne badania określające wielkość autofluorescencji

badanej próbki. W tym celu wykonuje się hybrydyzację bez sondy lub z

użyciem sondy nonsensownej (ang. nonsense probe).

PROCEDURA FISH:

 denaturacja DNA (chromosomów komórki na etapie

METAFAZY!!!!!)

 denaturacja sondy

 hybrydyzacja

 obserwacja wybarwionych preparatów

ZASTOSOWANIE:

 Diagnostyka aberracji chromosomowych i mniejszych rearanżacji genomowych, np.

aneuploidii, mikrodelecji, mikroduplikacji, chromosomów markerowych, złożonych
translokacji lub translokacji ukrytych.



Identyfikacja punktów złamań chromosomów w aberracjach strukturalnych.



Ocena struktury genów i określenie ich lokalizacji.



Mapowanie chromosomów.

Modyfikacje FISH:

 M-FISH polega na zastosowaniu kilku fluorochromów. Odmiany M-FISH:

 cenM-FISH z wykorzystaniem sond specyficznych dla regionów centromerowych.

 SKY - widmo światła o różnej długości fal emitowanych przez fluorochromy

analizowane jest spektrofotometrycznie.

 GISH wykorzystuje jako sondę cały DNA jednego z gatunków.

 fiber-FISH polega na hybrydyzacji rozciągniętej chromatyny, co pozwala na analizę

DNA w dużej rozdzielczości.

 micro-FISH to połączenie hybrydyzacji z procedurą mikrodysekcji chromosomów.

 immuno-FISH to immunochemiczna metoda lokalizacji białek w połączeniu z

lokalizacją DNA.

Metoda CGH Genomowa hybrydyzacja porównawcza (ang.

comparative genomie hybridization CGH)

 Postęp w diagnostyce zmian liczby kopii sekwencji DNA

 Pozwala na identyfikację zmian (delecji, duplikacji i amplifikacji) bez konieczności

prowadzenia hodowli komórkowej.

 To metoda stosowana w diagnostycznej cytogenetyce molekularnej do identyfikacji

niektórych typów nowotworów.

 Polega na podwójnej hybrydyzacji z sondami pochodzącymi ze zdrowych i

nowotworowych komórek.

 Do przeprowadzenia badania niezbędne jest szkiełko mikroskopowe, na którym

utrwalono dzielące się komórki o prawidłowym, wzorcowym kariotypie.

 Z badanych komórek izoluje się DNA i hybrydyzuje w stosunku 1:1 z wzorcowymi

chromosomami metafazowymi. Uprzednio DNA badane i kontrolne zostało
wyznakowane różnymi fluorochromami, co pozwala wykryć nieprawidłowości.

WYKONANIE:

 Na preparacie zawierającym prawidłowe komórki z męskim kariotypem

przeprowadza się hybrydyzację.

 Jako sondy używa się znakowanego DNA:

-

genomowego

DNA pacjenta znakowanego kolorem

zielonym

-

kontrolnego

(prawidłowego) genomowego DNA znakowanego kolorem

czerwonym.

 Sondy będą konkurowały o DNA chromosomu na preparacie.

 Jeżeli dany region intensywniej wybarwia sonda znakowana na

kolor czerwony,

oznacza to ubytek tego regionu w próbce pacjenta (delecja).

 Jeżeli dany region intensywniej wybarwia sonda znakowana na

kolor zielony

,

oznacza to, że region ten jest obecny w dodatkowej kopii (amplifikacja lub
duplikacja).

Metoda Mikromacierzy CGH:

 Mikromacierz- to płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych

pozycjach mikroskopowej wielkości polami, zawierającymi różniące się od siebie
sekwencją fragmenty DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez
hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA.

 Różnego typu mikromacierze mają wiele zastosowań, z których najczęstsze to

badanie ekspresji genów. Dzięki miniaturyzacji możliwe jest jednoczesne badanie
wielu genów w próbce. Na powierzchni kilku cm2, w mikrometrowych odstępach,
umieszczone są sondy pozwalające badać ekspresję nawet kilkudziesięciu tysięcy
sekwencji jednocześnie

Metoda mikromacierzy CGH różni się od klasycznego CGH wykorzystaniem do

hybrydyzacji krótkich fragmentów DNA lub oligonukleotydów zamiast komórki

z całym kariotypem.

 Fragmenty DNA lub oligonukleotydy mogą być nanoszone na różne matryce.

Pierwotnie były to krążki bibułowe i paski, współcześnie są to szkiełka, płytki
i membrany.

 Do nanoszenia oligonukleotydów zamiast nakrapiania stosuje się systemy

mikrodrukowania.

 Ogólna zasada hybrydyzacji i odczytu jest taka sama jak w klasycznym CGH.

Mikromacierz ekspresyjna:

Jest to technika wykorzystywana w analizie transkryptomicznej. Mikromacierze

zawierają 11-20 sond oligonukleotydowych obejmujących fragmenty 3' każdego ze

znanych transkryptów danego organizmu.

ZASTOSOWANIE MIKROMACIERZY:

DO BADANIA (w bilogii molekularnej):

o ekspresji genów

o metabolizmu obcych dla organizmu

substancji

o cyklu komórkowego

o stresów, np. oksydacyjny

o apoptozy

o polimorfizmów punktowych

o aberracji chromosomowych

o interakcji białko-DNA

o identyfikacji alternatywnego splicingu

o metylacji DNA

o identyfikacji profili mikroRNA

W ONKOLOGII ponieważ umożliwiają:

o identyfikację zarówno czynników

powodujących powstawanie i rozwój
nowotworu, jak i mechanizmów
obronnych organizmu

o postawienie odpowiednio wczesnej i

prawidłowej diagnozy

o właściwy dobór terapii

o poznanie czynników wpływających na

skuteczność terapii.

PRZEBIEG:

1. Zebranie próbki i izolacja RNA
(standardowo kilka mikrogramów)

2. Synteza cDNA na matrycy wyizolowanego
RNA

3. Synteza wyznakowanego cRNA na
podstawie cDNA (lub wyznakowanie cDNA)

4. Hybrydyzacja wyznakowanego kwasu
nukleinowego z mikromacierzą

5. Płukanie mikromacierzy, w celu usunięcia
niesparowanych sekwencji

6. Skanowanie obrazu mikromacierzy

7. Przekształcenie obrazu w zbiór danych
wartości ekspresji dla każdej sondy

Technika Western Blotting

Technika Western Blotting

 Służy

do wykrywania określonych białek

. Wykorzystywana min. w diagnostyce

boreliozy, WZW C

Procedura składa się z kilku części.

1.

Pierwszym etapem jest rozdzielenie mieszaniny białek w żelu poliakrylamidowym.

2.

Następnie białka przenoszone są na membranę, która niespecyficznie wiąże wszystkie
białka. Transfer odbywa się w kierunku elektrody dodatniej.

3.

Po rozdziale elektroforetycznym w obecności SDS-u (jonowego, naładowanego

ujemnie, detergentu) białka są zdenaturowane i wszystkie posiadają ładunek ujemny
proporcjonalny do ich masy. Wszystkie zatem będą wędrować w kierunku elektrody
dodatniej.

 Rozdzielenie elektroforetyczne białek na żelu poliakrylamidowym i przeniesienie na

membranę nitrocelulozową lub nylonową.

 Naniesienie przeciwciał I-rzędowych łączących się swoiście z szukanymi białkami.

 Naniesienie znakowanych przeciwciał II-rzędowych łączących się z przeciwciałami

I-rzędowymi.

Przeciwciała II-rzędowe znakowane są grupami umożliwiającymi detekcję

enzymatyczną, chemiluminescencyjną lub fluorescencyjną.

WYKRYWANIE:

 Analogicznie do metody ELISA.

W metodzie western blot można używać:

o jednego przeciwciała związanego

ze znacznikiem

(metoda bezpośrednia)

o dwóch rodzajów przeciwciał

(metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle:

o enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną)

o Fluorochromem

o izotopem radioaktywnym

RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphisms)

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)- polimorfizm

długości fragmentów restrykcyjnych

To polimorfizm fragmentów DNA powstających w następstwie działania endonukleaz

restrykcyjnych na nić DNA.

 Polimorfizm ten może być efektem:

 tranzycji
 transwersji
 delecji
 insercji

 Prowadzi do zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne.

Mutacje zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają długość fragmentów
restrykcyjnych, które można wykryć np. metodą Southerna.

 Analiza RFLP umożliwia mapowanie genów związanych z mało poznanymi

chorobami dziedzicznymi. Dzięki analizie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych udało
się m.in. ustalić na chromosomie X położenie genu odpowiedzialnego za dystrofie
mięśniową Duchenne’a.

 Badania genetyczne metodą RFLP polegają na wykrywaniu różnic w rozmiarach

fragmentów DNA, dzięki czemu organizmy mogą być rozpoznawane poprzez

analizę wzorów pochodzących z podziału ich DNA.

 RFLP oznacza odmienność fragmentów kodu genetycznego pochodzącego od

różnych osobników, pociętych specyficznymi enzymami restrykcyjnymi.

Odmienność ta polega na różnicach w długości fragmentów DNA, które powstają

w wyniku mutacji, powodowanych przez tworzenie lub usuwanie miejsc

rozpoznanych przez określone enzymy.

 DNA genomu badanej osoby przecinane jest przez enzym restrykcyjny z grupy

endonukleaz w określonych miejscach o charakterystycznej sekwencji
nukleotydów, precyzyjnie rozpoznawanej przez ów enzym.

 W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości pomiędzy nimi,

otrzymujemy określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o specyficznej długości.
Zastosowanie techniki RFLP polega właśnie na analizie różnic badanych
fragmentów DNA.

Analiza metodą RFLP obejmuje etapy:

 pobranie i izolacja DNA,

 trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi,

 rozdzielenie elektroforetyczne,

 przygotowanie hybrydyzacji Southerna,

 hybrydyzacja DNA z radioaktywną sondą i wykrywanie polimorfizmu długości fragmentów

restrykcyjnych.

Komplet uzyskanych w ten sposób obrazów składa się na pełny profil analizowanego

RFLP wykorzystuje się do analizy markerów polimorficznych, co pozwala na

diagnozowanie chorób uwarunkowanych genetycznie, dla których nie jest

znany produkt badanego genu ani molekularny charakter zmian

prowadzących do wystąpienia schorzenia.

Do różnicowania alleli danego markera polimorficznego badanie może być

wykonywane na DNA chromosomowym za pomocą hybrydyzacji z

odpowiednio wyznakowaną sondą molekularną lub za pomocą metody

PCR.

Analiza DNA metodą RFLP znajduje wiele zastosowań we współczesnym świecie.

Jest kluczowym narzędziem stosowanym do rozpoznawania DNA. Łatwość

identyfikacji DNA przy badanu krwi, włosów śliny i innych wydzielin sprawiła, że

metoda ta jest m.in. szeroko wykorzystywana w kryminalistyce.

Ponadto, powszechnie w medycynie przy badaniach defektów genetycznych i

dziedziczenia cech osobniczych. Metoda ta, może służyć do potwierdzania lub

negowania pokrewieństwa między osobnikami, na podstawie występowania lub

braku występowania różnych alleli.

Metoda RFLP jest również wykorzystywana w bioprzemyśle, w której organizmy

mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA.

Badanie sposobu dziedziczenia zmutowanego genu jest badaniem

rodzinnym.

RFLP powinna być wykonana zarówno dla probanda, jak i jego rodziców.

 Wynik analizy, w którym udało się prześledzić sposób dziedziczenia:

zmutowanych alleli od każdego z rodziców wynik informacyjny (100%).

 Wynik, na którego podstawie ustalono dziedziczenie allela tylko ze strony

jednego z rodziców wynik częściowo informacyjny (50%).

 Określony wynik RFLP jest charakterystyczny tylko dla jednej rodziny.

TESTY PRZESIEWOWE

BADANIA PRZESIEWOWE:

Badania przesiewowe noworodków urodzonych w Polsce to masowe badania

przeprowadzane obowiązkowo od maja 1994r, które mają celu wczesne wykrycie

wrodzonych chorób przed wystąpieniem objawów klinicznych i tym samym na

wdrożeniu odpowiedniego leczenia. Obecnie w Polsce wykonuje się badania

przesiewowe w kierunku:

 Wrodzonej niedoczynności tarczycy (hipotyreoza)

 oznaczenie poziomu TSH

 Fenyloketonurii

 oznaczenie poziomu fenyloalaniny

 Mukowiscydozy

 oznaczenie trypsynogenu

Badania skriningowe przeprowadzane są na oddziałach noworodkowych. Do

wykonania testu należy pobrać krew włośniczkową noworodka z nakłucia z pięty

najwcześniej w 73 godzinie życia (optymalnie w 4-5 dobie życia) na specjalną bibułę

testową na którą wpisuje się dane dziecka. Krwią nasącza się 6 krążków na bibule, a po

jej wysuszeniu trwającym około 2h jak najszybciej przekazuje się do odpowiedniego

laboratorium.

WŁAŚCIWOŚCI TESTÓW PRZESIEWOWYCH:

 Powszechność-

Oczekuje się, że wszystkie noworodki objęte będą badaniem

przesiewowym.

 Czułość testu-

Zdolność metody do wykrycia wszystkich dzieci z daną chorobą. Określa

się ją jako stosunek liczby dzieci chorych wykrytych w badaniu przesiewowym do
liczby dzieci chorych w całej populacji. Test idealny daje 100% czułości - czyli wszystkie
chore dzieci zostały wykryte w badaniach przesiewowych. Czułość testu określa
równocześnie ryzyko ,,zgubienia'' dziecka chorego w badaniu przesiewowym.

 Selektywność testu-

Zdolność metody do wykrywania jedynie dzieci chorych w

badanej populacji. Określa się ją jako stosunek liczby chorych w populacji do liczby
wyników dodatnich w teście przesiewowym. Idealny test daje 100% gdy nie wykazuje
wyników fałszywie dodatnich czyli choroba jest potwierdzona u każdego dziecka
wezwanego do dodatkowej diagnostyki

 Użyteczność kliniczna-

Badanie przesiewowe jest użyteczne klinicznie jeśli wynik testu

uzyskany jest w pierwszych tygodniach życia, tak aby rozpoczęte leczenie zapewniało
ochronę przed wadami następowymi choroby wrodzonej.

 Ekonomiczność-

Obejmuje relatywną analizę kosztów oraz tzw. kosztów społecznych.

W specjalistycznym laboratorium z krwi znajdującej się na bibule testowej oznaczane jest

stężenie hormonu tyreotropowego (TSH) oraz stężenie fenyloalaniny we krwi. W

zależności od uzyskanego wyniku możliwe jest następujące postępowanie:

 Jeśli wynik analizy jest w zakresie normy

badanie zostaje zakończone, a

laboratorium nie wysyła wyników do rodziców.

 Jeśli wynik analizy znajduje się w granicznym przedziale(niskie prawdopodobieństwo

choroby)

laboratorium wysyła "drugą bibułę"do matki dziecka listownie, na

którą pielęgniarka w przychodni zdrowia pobiera próbkę krwi dziecka, po czym bibuła
ta jest odsyłana do laboratorium. Po wykonaniu analizy z "drugiej bibuły"
laboratorium wysyła do rodziców potwierdzenie, że wynik analizy jest w normie co
wyklucza chorobę, lub wzywa matkę z dzieckiem na dalsze badania określając termin
oraz miejsce badania.

 Jeśli wynik analizy jest poza normą (wysokie prawdopodobieństwo choroby)

Laboratorium wysyła do rodziców zawiadomienie telegraficzne z prośbą o natychmiastowe

zgłoszenie się z dzieckiem do wytypowanej przychodni specjalistycznej celem dalszej

diagnostyki choroby.

 Wezwanie dziecka na specjalistyczne badania oznacza znaczne

prawdopodobieństwo wystąpienia wady wrodzonej, jednak w tej grupie dzieci

potwierdzenie choroby uzyskuje się u 25% - 50% dzieci.

Z tych samych plam krwi wykonuje się badanie przesiewowe w kierunku

mukowiscydozy

polegające na oznaczaniu immunoreaktywnego trypsynogenu (IRT).

 Jeśli matka opuszcza szpital przed pobraniem krwi na bibułę to otrzymuje ona

bibułę z naklejonym kodem próbki i adresem laboratorium do którego należy ją

wysłać. Po pobraniu przez pielęgniarkę krwi na bibułę w 5-7 dniu życia dziecka i

wysuszeniu, bibułę należy odesłać do laboratorium. W przypadku zgubienia bibuły

lub jej zniszczenia konieczne należy udać się do szpitala w którym odbył się poród

w celu pobrania krwi na nową bibułę.

 Dzieci z niską wagą urodzeniową (poniżej 1500g) muszą mieć pobraną drugą

próbkę krwi w wieku 14 – 21 dni, zależnie od stanu dziecka, dlatego też przy

pierwszym pobieraniu wypełnia się i przekazuje matce drugą bibułę.

Oznaczanie poziomu tyreotropiny

(TSH - Thyroid Stimulating Hormone):

Stosowane jest do wykrywania

hipotyreozy (wrodzonej niedoczynnośći tarczycy).

Jedyną możliwością wykrycia choroby jest wykonanie testu przesiewowego, gdyż

objawy choroby w pierwszych dniach życia są bardzo niecharakterystyczne. Wyniki

badania klasyfikują dziecko do jednej z 3 grup:

 Stężenie TSH w normie (< 15 mIU/L)  dziecko zdrowe.

 Stężenie TSH nieco podwyższone (15-35 mIU/L) oznacza małe

prawdopodobieństwo choroby, ale do rodziców dziecka wysyłana jest druga bibuła
w celu zweryfikowania rozpoznania.

 Stężenie TSH mocno podwyższone (≥35 mIU/L)  dzieci takie są natychmiast

wzywane do Poradni Endokrynologicznej, gdzie prowadzi się dalszą diagnostykę i
ustala rozpoznanie choroby oraz prowadzi leczenie.

Oznaczanie poziomu fenyloalaniny (Phenylalanine - Phe) stosowane

jest do wykrywania fenyloketonurii.

Do roku 1997 w całej Polsce do oznaczania poziomu fenyloalaniny we krwi

stosowany był

test Guthrie.

Jest to test mikrobiologiczny polegający na wzrokowej ocenie wielkości wzrostu

bakterii wokół krążka z próbką krwi noworodka ułożonego na specjalnym podłożu.

Test Guthriego

dzięki swej prostocie był powszechnie stosowany w całym świecie. Test

ten ma jednak szereg wad:

 Odczyt polega na wzrokowym porównaniu wielkości wzrostu bakterii wokół próbki

badanej z wielkością wzrostu wokół próbki wzorcowej (próbki o znanym poziomie
fenyloalaniny). Taki sposób odczytu jest odczytem nieobiektywnym tzn. ta sama
próbka może być różnie oceniona przed różne osoby odczytujące. Powoduje to
możliwość błędnego odczytu poziomu i zgubienia chorego dziecka

 Prawdopodobieństwo popełnienia błędu rośnie wraz z ilością czytanych prób czyli

wraz z narastającym zmęczeniem osoby czytającej.

 Próbki krwi (krążki bibuły o średnicy 5 mm) układane są na płytkach ręcznie co może

powodować pomyłki przy identyfikacji danych dziecka od którego pobrano daną
próbkę.

 Wzrost bakterii nie występuje gdy próbka krwi zawiera antybiotyki którymi leczone

było dziecko przed pobraniem próbki.

 Odczyt poziomu fenyloalaniny wykonywany był kilka dni od otrzymania próbki - tak

długi czas wynikał z konieczności dodatkowego przygotowania próbki krwi.

W roku 1997 w Pracowni rozpoczęto masowe oznaczanie fenyloalaniny za

pomocą

testu ilościowego kolorymetrycznego

.

Testy ilościowe wykonywane na czytnikach mikropłytek pozwalają na automatyzację

oraz, co ważne, na kontrolę komputerową z zastosowaniem etykiet z kodem

paskowym.

Pozwoliło to również na ujednolicenie procedur badań dla testu w kierunku
fenyloketonurii i hipotyreozy. Znacznie skrócony został czas po którym uzyskuje się
wynik  wynik może być uzyskany w tym samym dniu (lub w następnym), w którym
próbka krwi dociera do laboratorium.

Obecnie w całej Polsce stosowany jest

test ilościowy (kolorymetryczny) firmy IBL.

Wysoka czułość testu kolorymetrycznego pozwoliła na zlikwidowanie

dodatkowego pobierania próbek moczu od dzieci w wieku 3-4 tygodni. Próbka ta

służyła do oznaczania obecności kwasu pirogronowego w moczu pojawiającego się

w przypadku wysokiego poziomu fenyloalaniny we krwi. Oznaczanie kwasu

pirogronowego w moczu wynikało z niskiej czułości testu Guthriego, dodatkowo

skuteczność pobierania próbek moczu była niska.

Wyniki badania klasyfikują dziecko do jednej z 3 grup:

 Stężenie fenyloalaniny w normie

(< 3mg/dl)– dziecko zdrowe.

 Stężenie fenyloalaniny nieco podwyższone

(3-8mg/dl), co oznacza małe

prawdopodobieństwo choroby, ale do rodziców dziecka wysyłana jest druga
bibuła w celu zweryfikowania rozpoznania.

 Stężenie fenyloalaniny mocno podwyższone

(≥8mg/dl) – dzieci takie są

natychmiast wzywane do Poradni Endokrynologicznej lub Poradni Wad
Metabolicznych gdzie prowadzi się dalszą diagnostykę i ustala rozpoznanie
choroby oraz prowadzi leczenie.

Oznaczeniu immunoreaktywnej trypsyny (IRT)

w kierunku mukowiscydozy:

Strategia obecnych badań przesiewowych w kierunku mukowiscydozy (CF) opiera się na:

 oznaczeniu

immunoreaktywnej trypsyny (IRT)

we krwi na bibule

 analizie DNA, polegającej na

identyfikacji mutacji w genie CFTR

(Cystic Fibrosis

Transmembrane Conductance Regulator).

1.

Jako pierwsze wykonywane jest oznaczenie IRT (IRT1) ilościową metodą ELISA z
wysuszonych kropli krwi pobranych pomiędzy 3 a 6 dobą życia (w szpitalu krew jest
pobierana na jedną wspólną dla hipotyreozy, fenyloketonurii i mukowiscydozy bibułę).

2.

W przypadku stężenia IRT1 powyżej normy tj. powyżej 99,4 centyla, wykonywana
jest - po uzyskaniu pisemnej zgody rodziców - analiza DNA, a także pobierana jest
krew na drugą bibułę w celu ponownego oznaczenia stężenia IRT (IRT2) pomiędzy 21
a 28 dobą życia noworodka.

Badania przesiewowe polegające na oznaczaniu immunoreaktywnego

trypsynogenu (IRT) w wysuszonych plamach krwi. Wyniki badania

klasyfikują dziecko do jednej z 2 grup:

 Test IRT z bibuły

ujemny

: dziecko zdrowe

 Test IRT z bibuły

dodatni

: wezwanie na dalszą diagnostykę obejmujące

badanie DNA, test potowy.

Dziękuję za uwagę! 