2015-04-24

1

Metody i techniki badań

stosowane w medycznym

laboratorium diagnostycznym

Katarzyna Bergmann

Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy

Podział metod oznaczeń parametrów

laboratoryjnych

1. Ze względu na technikę
oznaczeń/pomiarów:
• optyczne:
- spektrometria (w tym

spektrofotometria)

- nefelometria i turbidymetria
- reflektometria
- mikroskopia
• chromatograficzne
• elektroforetyczne
• elektrochemiczne
• cytometria
• oparte o właściwości fizyko-

chemiczne analitów

2

. Ze względu na rodzaj

zjawiska/reakcji:

• Kolorymetryczne

• Zmętnieniowe

• Enzymatyczne

• Immunochemiczne

• Rozdzielcze

• Elektryczne/elektrochemiczne

3. Ze względu na sposób
wykonania badania:

• Manualne

• Półautomatyczne

• Automatyczne

2015-04-24

2

Spektrometria (spektroskopia)

•

Spektroskopia - badanie oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią.

W zależności od rodzaju substancji, długości fali promieniowania oraz warunków pomiaru

można obserwować różne efekty związane z oddziaływaniem promieniowania

elektromagnetycznego z badaną próbką: np. absorpcję, dyfrakcję, rozpraszanie,

luminescencję. Zastosowanie metod spektroskopowych do celów analitycznych polega na

wykorzystaniu efektów specyficznych dla danej substancji (atomów pierwiastka, cząsteczek

związku chemicznego, kryształów ciała stałego) do jej identyfikacji i pomiaru jej zawartości.

•

Spektroskopia UV-VIS - spektrofotometria:

Metoda analityczna wykorzystująca absorpcję promieniowania elektromagnetycznego

w zakresie ultrafioletu (100-400 nm) i światła widzialnego (400-800 nm), wynikającą ze

wzbudzeń elektronów walencyjnych w cząsteczkach naświetlanych substancji.

Spektroskopię UV-VIS wykorzystuje się do oznaczania zawartości substancji absorbujących,

zwłaszcza związków organicznych zawierające wiązania wielokrotne oraz związki metali

przejściowych. Może być też ona stosowana do identyfikacji substancji.

Spektrofotometria UV-VIS

Prawo Lamberta-Beera: absorbancja (A) jest wprost proporcjonalna do
stężenia (c) i grubości warstwylroztworu (l), przez który przechodzi
promieniowanie:

A=k*c*l

k – stała proporcjonalności (współczynnik pochłaniania promieniowania, często nazywany współczynnikiem absorpcji)

2015-04-24

3

Spektrometria oparta o zjawiska luminescencji:

•

Definicje:

a) Luminescencja – zjawisko emisji fal świetlnych przez ciała (luminofory), wywołane inną
przyczyną niż rozgrzanie ich do wysokiej temperatury, co oznacza, że luminescencja nie jest
promieniowaniem cieplnym.

 Ze względu na czynnik wzbudzający do świecenia, rozróżnia się następujące zjawiska:

- chemiluminescencja – wytworzona w trakcie niektórych reakcji chemicznych

- elektroluminescencja – świecenie pod wpływem stałego lub zmiennego prądu elektrycznego

-

fotoluminescencja – wywołana przez pochłonięcie promieniowania elektromagnetycznego z
obszaru widzialnego, ultrafioletu lub podczerwieni. Pochłonięta energia jest następnie
wyemitowana także w postaci światła, na ogół o energii mniejszej niż energia światła
wzbudzającego.

b) Fluorescencja – jeden z rodzajów luminescencji – zjawisko emitowania światła przez
wzbudzony atom lub cząsteczkę. Zjawisko uznaje się za fluorescencję, gdy po zaniku czynnika
pobudzającego następuje szybki zanik emisji w czasie około 10−8 s. Gdy czas zaniku jest
znacznie dłuższy, to zjawisko jest uznawane za fosforescencję.

Najczęściej stosowane techniki pomiarowe:

•

Spektrofluorymetria (spektroskopia fluorescencyjna, fluorymetria) – rodzaj
spektroskopii promieniowania, w której analizuje się fluorescencję próbki wywołaną światłem
ultrafioletowym lub promieniowaniem rentgenowskim.

•

Elektrochemiluminescencja – rodzaj spektroskopii promieniowania, w której analizuje się
fluorescencję próbki wywołaną pod wpływem czynników chemicznych i elektrycznych

Fotoluminescencja

•

Zasada metody: Padający foton wzbudza elektron w cząsteczce lub
atomie. Wzbudzenie to wiąże się z przejściem elektronu do wzbudzonego
stanu singletowego. Przy przejściu elektronu ze wzbudzonego stanu
singletowego do stanu podstawowego następuje emisja światła. Długość
fali promieniowania (wyemitowanego światła) jest dłuższa od długości fali
zaabsorbowanej. Wynika to z degradacji części energii podczas przejść
termicznych i bezpromienistych. Jest to tzw. przesunięcie Stokesa.

2015-04-24

4

Elektrochemiluminescencja

Elektrochemiluminescencja wykorzystuje substancje, które emitują światło pod
wpływem stymulacji elektrochemicznej.
Ruten i TPA są utleniane na powierzchni elektrody platynowej, które jest pod
napięciem. TPA traci proton, redukuje ruten i powoduje jego przejście w stan
wzbudzony, czemu towarzyszy emisja światła. Ruten nie zużyty w reakcji, może być
wzbudzany tak długo, jak TPA jest obecny. Wiele cykli wzbudzenia/emisji wzmacnia
sygnał, który jest odczytywany przez detektor.

Turbidymetria i nefelometria

•

Turbidymetria to jedna z metod spektrofotometrycznych w chemii
analitycznej, która służy do pomiaru mętności zawiesin. Istota metody jest
analogiczna, jak w przypadku innych metod spektrofotometrycznych i opiera
się na pomiarze relacji pomiędzy ilością światła emitowanego przez źródło, a
ilością światła docierającą do detektora spektrofotometru, po przejściu przez
kuwetę z badaną próbką. Relacja ta zależy głównie od stężenia cząstek
zawiesiny, na których zachodzi dyspersja światła.

•

Nefelometria polega na oznaczaniu ilościowym zawiesiny koloidalnej w
badanej próbce przez pomiar natężenia światła przepuszczanego przez tę
próbkę, przy czym detektor jest umieszczony pod pewnym kątem (najczęściej
90 st.) względem kierunku biegu wiązki świetlnej wychodzącej ze źródła
światła, pozwalającym mierzyć natężenie światła rozproszonego.

2015-04-24

5

• Reflektometria – technika polegająca na

pomiarze intensywności światła odbitego przez
barwną substancję.

• W diagnostyce laboratoryjnej metoda

wykorzystywana np. w analizatorach do testów
paskowych stosowanych do badania ogólnego
moczu, w glukometrach i innych aparatach do
diagnostyki w trybie POCT

Chromatografia

•

Chromatografia - efekt rozdziału (separacji) mieszaniny substancji na jej składniki,
obserwowany podczas przepływu fazy ruchomej wzdłuż powierzchni fazy nieruchomej.
Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej
unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się
wolniej. Fazą ruchomą może być gaz lub ciecz, zaś fazą nieruchomą - ciecz, żel lub
porowate ciało stałe.
Zastosowanie chromatografii w analityce chemicznej polega na separacji mieszaniny
substancji (związków chemicznych) na proste składniki, a następnie na pomiarze ich
ilości. Wykorzystywanie różnych faz ruchomych i nieruchomych, oraz odmiennych co do
fizykochemicznej natury oddziaływań powodujących rozdział chromatograficzny,
doprowadziło do powstania wielu różnych technik chromatograficznych.

•

W diagnostyce laboratoryjnej wykorzystuje się następujące rodzaje chromatografii:

 Chromatografia gazowa (GC - gas chromatography) – analiza toksykologiczna (leki,

alkohol, narkotyki, inne toksyny)

 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - high performance liquid

chromatography) – oznaczanie białek, hormonów, analiza toksykologiczna

 Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - thin layer chromatography) – analiza

toksykologiczna (leki, narkotyki), szybkie testy diagnostyczne paskowe/płytkowe (np. na
obecność krwi utajonej w kale, testy ciążowe)

2015-04-24

6

•

Chromatografia gazowa (GC - gas chromatography) - metoda analityczna
wykorzystująca efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem gazu (np. He)
jako fazy ruchomej, oraz porowatego ciała stałego lub filmu polimeru
organicznego jako fazy nieruchomej.

•

•

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - high performance liquid
chromatography) - wykorzystuje efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem
cieczy jako fazy ruchomej. Skład fazy ciekłej i rodzaj fazy stacjonarnej jest
uzależniony od składu badanych próbek oraz typu oddziaływań wykorzystywanych
do osiągnięcia separacji ich składników.

2015-04-24

7

t

R

– czas retencji – wielkość

charakterystyczna dla danej
substancji (w określonych
warunkach)
powierzchnia piku –
odzwierciedla stężenie
substancji

• Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - thin layer

chromatography) - metoda analityczna, wykorzystująca jako fazę
stacjonarną cienką warstwę porowatego sorbentu, oraz ciecz jako
fazę ruchomą (eluent).

• Rozdział chromatograficzny zachodzi w wyniku przepływu eluentu

przez warstwę sorbentu, wciąganego przez sorbent na skutek
działania sił kapilarnych.

2015-04-24

8

Technika analityczna, stosowana w chemii klinicznej i biologii molekularnej. Jej
istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne
frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym (napięcia
od 50 V do nawet 30 kV). Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle
ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost
proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do
jej wielkości. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział, wyróżnić
można elektroforezę żelową i kapilarną.

•

Elektroforeza żelowa - ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane
substancje, jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów lub
agaru, uformowany w płytkę długości kilkunastu – kilkudziesięciu centymetrów i
grubości od ułamka do kilku milimetrów. Elektroforeza jest najczęściej
stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z krwi,
moczu, płynów z jam ciała lub bezpośrednio z komórek.

•

Elektroforeza kapilarna (CE, ang. Capillary Electrophoresis) - rozdział
mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0,5-
1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta
wypełniana jest buforem. Metoda ta jest często stosowana w biologii
molekularnej do analizy DNA lub w chemii klinicznej do rozdziału białek (np.
proteinogramy z surowicy/moczu, rozdział frakcji hemoglobiny, oznaczanie
hemoglobiny glikowanej HbA1c).

Elektroforeza

Elektroforeza żelowa

Elektroforeza kapilarna

2015-04-24

9

Metody kolorymetryczne

• Wykorzystują zjawisko powstawania reakcji barwnych pomiędzy

oznaczanym analitem a dodawaną do próbki badanej substancją
chemiczną, np.:

 jony wapnia reagują w środowisku alkalicznym z arsenawo III,

tworząc barwny kompleks (fiołkowy),

 w środowisku alkalicznym magnez reaguje z błękitem

ksylidylowym tworząc purpurowo zabarwiony związek,

 oznaczanie stęż. białka metoda biuretową - polega na dodaniu

do analizowanej mieszaniny roztworu silnej zasady oraz
siarczanu miedzi(II); jeżeli w roztworze obecne są związki
zawierające bliskie wiązania peptydowe, to roztwór zmienia
barwę z niebieskiej na fioletową

• Stężenie oznaczanej substancji ocenia się poprzez pomiar

spektrofotometryczny przy ustalonej długości fali, w oparciu o
wartości absorbancji roztworów wzorcowych o znanym stężeniu

Metody enzymatyczne

• Najpowszechniej stosowane metody do oznaczenia różnych

parametrów biochemicznych (enzymów, białek, lipidów,
glukozy, metabolitów itd. )

• Oparte o specyficzne reakcje oznaczanych analitów

przebiegające z udziałem enzymów, np.

 oznaczanie stęż. glukozy z heksokinazą/G-6-PDH

 oznaczanie cholesterolu całkowitego met. enzymatyczną

2015-04-24

10

Metody enzymatyczne

• W metodach tych wykorzystuje się pomiar

spektrofotometryczny (UV-VIS) końcowych produktów
reakcji w oparciu o wartości absorbancji roztworów
wzorcowych

• Pomiary w metodach enzymatycznych można

wykonywać dla punktu końcowego reakcji lub jako
pomiary dwupunktowe (początek i koniec reakcji) oraz
kinetyczne (w określonych odstępach czasu) – np.
badanie aktywności enzymów wątrobowych w
surowicy

• Reakcje enzymatyczne mogą być reakcjami

barwnymi, co pozwala zaliczyć niektóre metody także
do metod kolorymetrycznych

Metody immunochemiczne

•

Oparte na reakcjach immunologicznych pomiędzy oznaczanym analitem
(antygenem) a skierowanymi przeciwko niemu przeciwciałami. Można w
nich oznaczać również przeciwciała, które będą reagować z antygenami
znajdującymi się w roztworach odczynnikowych.

•

W metodach tych stosowane są odczynniki zawierające przeciwciała
wyznakowane odpowiednimi substancjami:

 enzymami – met. immunoenzymatyczne (EIA)
 zw. fluorescencyjnymi – met. immunofluorescencyjne (FIA)
 zw. luminescecyjnymi – met. immunoelektrochemiluminescencyjne

(ECLIA)

 radioizotopami – met. radioimmunologiczne (RIA)
•

Najczęściej stosowane w rutynowej diagnostyce są metody
immunoenzymatyczne – pozwalają oznaczać białka, hormony, markery
nowotworowe, czynniki zakaźne (np. wirusy), autoprzeciwciała, alergeny
itp. W metodach tych wykorzystuje się pomiary spektrofotometryczne
(UV-VIS)

•

Metody immunochemiczne mogą wykorzystywać również zjawisko
zmętnienia próbki pod wpływem reakcji pomiędzy Ag a przeciwciałem. W
reakcjach tych wykorzystuje się pomiary turbidymetryczne lub
nefelometryczne (immunoturbidymetria/nefelometria), np. oznaczanie
białka C-reaktywnego, Ig w klasach M, A, G, białek metabolizmu żelaza
– transferryny, ferrytyny itd.)

2015-04-24

11

Metody immunoenzymatyczne

•

Jednym z najbardziej popularnych rodzajów testów
immunoenzymatycznych jest test immunoenzymosorpcyjny (ELISA,
ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Przeprowadza się go przy
użyciu 96-dołkowych płytek, stanowiących fazę stałą, opłaszczoną:

 przeciwciałami skierowanymi przeciwko oznaczanemu analitowi – w

przypadku oznaczania białek, hormonów, leków (antygenów)

 antygenami reagującymi ze swoistymi przeciwciałami – w przypadku

oznaczania przeciwciał

•

Po dodaniu do dołków próbki badanej zawierającej odpowiednie
antygeny/ przeciwciała i inkubacji dodawane są przeciwciała znakowane
enzymami, np. peroksydazą chrzanową (HRP). Ilość związanych
wyznakowanych przeciwciał zależy od ilości poszukiwanej substancji w
próbie badanej.

•

W końcowych etapach testu do dołków dodaje się substrat reakcji
enzymatycznej (np. TMB), który powoduje powstanie reakcji barwnej
(dołki wybarwiają się na kolor niebieski). W celu zatrzymania reakcji
stosuje się tzw. roztwór STOP (np. 1 M HCl), który powoduje zmianę
zabarwienia dołków na żółtą. Intensywność zabarwienia dołków jest
mierzona spektrofotometrycznie przy określonej długości fali (UV-VIS) i
przeliczania na stężenie.

ELISA – rodzaje testów

1. Sandwich ELISA – absorbancja próbek jest wprost
proporcjonalna do stężenia oznaczanej substancji

2015-04-24

12

2. Test kompetycyjny – absorbancja odwrotnie proporcjonalna do stężenia

oznaczanego analitu

ECLIA - immunoelektrochemiluminescencja