Sprawozdanie 3. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 1 z 5 
Data zajęć: 2008/11/07 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 3. 

Preparacja aldolazy z mięśni królika 

według metody Taylora i wsp. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 3.  Wstęp 

Preparacja białek polega na izolowaniu danego białka z próbki biologicznej. Dobrze dobrana 

metoda pozwala na uzyskanie „czystego” białka do dalszych badań. 

Taylor  i  współpracownicy  opracowali  metodę  preparacji  aldolazy  z  mięśni  królika.  Jak  każda 

preparacja jest wieloetapowa (Rysunek 1.). Składa się zasadniczo z: dwóch wysalań (50% i 52% 

wysyconym  roztworem  siarczanu  amonu),  dwóch  wirowań  oraz  końcowej  krystalizacji. 

Za każdym razem osad się odrzuca. Metoda jest dość prosta i krótka, jednak mało specyficzna. 

 Rysunek 1. – Etapy preparacji aldolazy metodą Taylora i wsp. 

Wydajność (masowa) preparacji aldolazy jest stosunkiem masy aldolazy w danym przesączu 

do  teoretycznej  masy  całkowitej  izolowanej  aldolazy  w  próbce.  Najczęściej  wydajność 

preparacji 

 wyraża  się  w  procentach.  Założono,  że  w  przesączu  pierwszym  masa  aldolazy 

jest równa masie aldolazy zawartej w mięśniach (czyli 100%), wówczas 



 wyraża wzór (1). 

 







ald

przesączu 



ald

calłkowita

· 100% 

Akt

spec

przesączu 1

Akt

spec

przesączu 2

· 100% 

(1) 

Ćwiczenie 3.  Cel 

Izolacja aldolazy z mięśni królika. 

Ćwiczenie 3.  Wykonanie 

Rozmrożono, a następnie pokrojono i zmielono rozmrożone mięśnie królika. Zhomogenizowano 

w  100  ml  wody  dejonizowanej  w  zlewce.  Ekstrahowano  białka  mieszając  bagietką  przez 

10 min w łaźni lodowej. 

Przelano mieszaninę do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min, 

15  min,  2-4°C).  Supernatant  przelano  do  czystej,  schłodzonej  zlewki  przez  lejek  z  watą 

szklaną.  Pobrano  0,5  ml  mieszaniny  do  oznaczenia  aktywności  aldolazy  w  przesączu  1. 

Postępowano  zgodnie  z  Ćwiczeniem  1.  Zanotowano  objętość  pozostałej  mieszaniny. 

Pod wyciągiem miareczkowano mieszaninę 5% roztworem amoniaku do pH 7,5. Zanotowano 

objętość dodanego amoniaku. Wysalano białka dodając małymi porcjami 97,5 ml nasyconego 

roztworu  siarczanu  amonu  przygotowanego  w  Ćwiczeniu  2.  przez  5  min.  Zlewkę  trzymano 

w  łaźni  lodowej,  zawartość  mieszano  bagietką  przez  kolejne  15  min.  Sprawdzano 

pH mieszaniny. 

Przelano mieszaninę do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min, 

25  min,  2-4°C).  Supernatant  przelano  do  czystej,  schłodzonej  zlewki.  Pobrano  0,5  ml 

mieszaniny  do  oznaczenia  aktywności  aldolazy  w  przesączu  2.  Postępowano  zgodnie 

z  Ćwiczeniem  1.  Zanotowano  objętość  pozostałej  mieszaniny.  Wysalano  białka  dodając 

małymi porcjami 7,9 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu przygotowanego w Ćwiczeniu 2. 

przez  10  min.  Zlewkę trzymano  w  łaźni  lodowej,  zawartość mieszaną  bagietką.  Sprawdzano 

pH mieszaniny. 

Otrzymaną  mieszaninę  przelano  do  kolby  stożkowej  i  pozostawiono  w  temperaturze  5°C 

na tydzień do krystalizacji. 

 

rozmrożenie

i homogenizacja

ekstrakcja

wirowanie

wysalanie (50%) 

supernatantu 

wirowanie

wysalanie (52%) 

supernatantu

krystalizacja

i rekrystalizacje

Sprawozdanie 3. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 2 z 5 
Data zajęć: 2008/11/07 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 3. 

Preparacja aldolazy z mięśni królika 

według metody Taylora i wsp. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 3.  Wyniki 

Tabela 1. – Objętości roztworów 



przesącz 1

 

 ml" 



#NH

&

'



SO

&

*

 

 ml" 



przesącz 2

 

 ml" 



#NH

&

'



SO

&



 

 ml" 

95,0* 

97,5** 

190,0* 

7,9*** 

gdzie: 

 

*  zmierzona objętość 

 

**  miareczkowano do pH 7,5 dodając 25 kropli 5% roztworu amoniaku (1 kropla to ok. 100 μl) 



NH

+

·H



O

 25 kropli  2,5 ml 



#NH

&

'



SO

&

*

 

przesącz 1

. 

NH

+

·H



O

 

 

***  objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu, aby uzyskać 52% stopień wysycenia: 

100% · 

#NH

&

'



SO

&



. 50% · 

przesącz 2

 52% · /

przesącz 2

. 

#NH

&

'



SO

&



0 



#NH

&

'



SO

&





*

1



przesącz 2

 

Tabela 2. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych 

 

przesącz 1 

przesącz 2 

uwagi 



*2

 

 µl" 

100 

- 

4

56

 

 

0,6854 

0,3197 

odczyt 
ze spektrofotometru 

7

białek



 

 mg/ml" 

0,753 

0,351 

7

białek





;

<=

>

<=

=,?%

·@

 



2A

 

 µl" 

100 

- 

Akt

ald



 

 U/ml" 

0,8244 

0,4392 

Akt

ald



 C

2A

· Akt

ald

A

 

4

16

D

 

 

0,275 

0,14 

odczyt z wykresu 1. 

4

16

E

 

 

0,65 

0,34 

odczyt z wykresu 1. 

Δ4

16

/∆H 

 1/min" 

0,125 

0,0667 

Δ4

16

 4

16

E

J 4

16

D

 

∆H  3 min 

7

białek

A

 

 mg/ml" 

0,04183 

0,0195 

7

białek

A



L

białek



M

2+

 

Akt

ald

A

 

 U/ml" 

0,0458 

0,0244 

Akt

ald

A



N;

&=

/∆O

P

Q

·@

· 10

A

 

Akt

tot

A

 

 U" 

0,0824 

0,0439 

Akt

tot

A

 Akt

ald

A

· 

A

 

Akt

spec

A

 

 U/mg" 

1,095 

1,251 

Akt

spec

A



Akt

ald

+

L

białek

+

 

gdzie: 
 

długość drogi optycznej (szerokość kuwety): 

R  1 cm 

masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 

S

56

6,*%

 0,91 

ml

mg·cm

 

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): 

U

V

 2730 

1

M·cm

 

 

objętość: 



A

 1,5 ml . 200 µl . 100 µl  1800 µl  1,8 ml 

 

rozcieńczenie: 

C

2A



Z[

+

\Z

2+

Z

2+



Z

+

Z

2+



*566 µl

*66 µl

 18 

 

Sprawozdanie 3. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 3 z 5 
Data zajęć: 2008/11/07 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 3. 

Preparacja aldolazy z mięśni królika 

według metody Taylora i wsp. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Tabela 3. – Obliczenia dla pobranych próbek przesączu 

 

przesącz 1 

przesącz 2 

uwagi 

7

białek

*

 

 mg/ml" 

23,3 

10,9 

7

białek

*

 C

*2

· C

2A

· 7

białek

A

 C

*2

· 7

białek



 

Akt

ald

*

 

 U/ml" 

25,6 

13,6 

Akt

ald

*

 C

*2

· C

2A

· Akt

ald

A

 C

*2

· Akt

ald



 

Akt

tot

*

 

 U" 

2,43 ∙ 10

3

 

2,58 ∙ 10

3

  Akt

tot

*

 Akt

ald

*

· 

przesącz ]

 

Akt

spec

*

 

 U/mg" 

1,095 

1,251 

Akt

spec

*



Akt

ald

?

L

białek

?



M

?2

·M

2+

·Akt

ald

+

M

?2

·M

2+

·L

białek

+

 Akt

spec

A

 

^

białek

*

 

 g" 

2,21 

2,07 

całkowita masa białek 
^

białek

*

 7

białek

*

· 

przesącz ]

 

 

 %" 

100 

87,5 

zgodnie ze wzorem (1) 

gdzie: 

objętość: 





 3000 µl . 100 µl  3100 µl  3,1 ml 

 

rozcieńczenie: 

C

*2



Z[



\Z

?2

Z

?2



Z



Z

?2



A*66 µl

*66 µl

 31 

 

Ćwiczenie 3.  Wnioski 

Wysalanie białek przeprowadzano przez powolne dodawanie nasyconego roztworu siarczanu 

amonu  oraz  intensywne  mieszanie  w  celu  uniknięcia  miejscowego  przesycenia  roztworu. 

Stężenie białek w przesączu 2 jest mniejsze niż w przesączu 1. 

Kontrolowano ważne parametry podczas preparacji takie  jest temperatura i pH. Gdy wysalano 

to  pH  mieszaniny  z  aldolazą  utrzymywało  się  w  przedziale  7-7,5.  Nie  trzeba  dodawać  było 

amoniaku w celu alkalizacji odczynu roztworu. 

Wyznaczając  szybkość  zmiany  absorbancji  na  wykresie  1.  dla  przesączu  2.  poprowadzono 

styczną  do  wykresu  pomijając  początkową  zmianę  absorbancji,  która  miała  charakter 

nieliniowy, w celu lepszego oszacowania faktycznej szybkości zmiany absorbancji. 

Aktywność specyficzna aldolazy w przesączu 1 wynosi 1,095 U/mg natomiast w przesączu 2 

wynosi  1,251  U/mg.  Im  wyższa  aktywność  specyficzna  tym  wyizolowana  aldolaza 

aktywniejsza („czystsza”). W Ćwiczeniu 1. z dnia 2008/10/17 aktywność specyficzna aldolazy 

z  mięśni  królika  wynosiła  7,58  U/mg.  Jest  to  znacząca  różnica.  Może  wynikać  ona  

z jakości użytego mięsa, ale przede wszystkim z wybranej lepszej metody preparacji. 

Aktywność totalna w kolejnych preparacjach powinna maleć, natomiast aktywność specyficzna 

powinna rosnąc. Uzyskano wydajność preparacji wynoszącą 87,5% dla przesączu 2. 

 

 

Sprawozdanie 3. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 4 z 5 
Data zajęć: 2008/11/07 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 
Zmiany  stężeń  białek  i  aktywności  aldolazy  przy  preparacji  aldolazy  w  Ćwiczeniu  3.  badano 

spektrofotometrycznie tak jak w Ćwiczeniu 1. 

Ćwiczenie 1.  Wstęp 

Aldolazy  to  enzymy  należące  do  klasy  liaz.  Występują  w  różnych  izoformach.  Izolowane 

są  z  tkanki  mięśniowej,  wątroby  i  mózgu.  Biorą  udział  w  jeden  z  reakcji  glikolizy  oraz 

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.). 

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

 

Reakcja 1. – Reakcja katalizowana przez aldolazę 

Stężenia  enzymu 

_ można  próbować  wyznaczyć  poprzez  pomiar  absorbancji 4 przy  280  nm 

oraz  stosując  prawo  Lamberta-Beera  (2),  gdzie 

S to  współczynnik  ekstynkcji,  a R to  długość 

drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń. 

 

4  S · R · _ 

(2) 

Aktywność  enzymu  wyznacza  się  poprzez  zmianę  stężenia  (poprzez  zmianę  absorbancji) 

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności 

U definiuje się zgodnie ze wzorem (3). 

 

U 

? µmol substratu

? min

 

(3) 

Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym 

oznaczaniu  zmiany  stężenia  hydrazonu  aldehydu  3-fosfoglicerynowego  (H)  przy  240  nm. 

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny 

w stosunku 1:1. 

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (4). 

 

C

]



Z

`

\Z

a

Z

a

 

(4) 

Ćwiczenie 1.  Cel 

Wyznaczenie stężenia aldolazy oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym. 

 

 

Sprawozdanie 3. 

Politechnika Wrocławska 

Wydział Chemiczny 

Strona 5 z 5 
Data zajęć: 2008/11/07 

Enzymologia (BTC4033l) 
laboratorium 
mgr inż. Dominika Bystranowska 
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 

Ćwiczenie 1. 

Zapoznanie się z metodą określania aktywności 

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy. 

Grupa IV 
Anna Dawiec 
Mateusz Jędrzejewski 
Aleksandra Korkuś 

 

Ćwiczenie 1.  Wykonanie 

W  części  I  wyznaczono  stężenie  aldolazy.  Odmierzono  3  ml  buforu  (10  mM  Tris/HCl,  1  mM 

EDTA). Zmieszano z 100 μl roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). Odnośnik sporządzono 

używając samego buforu. Zmierzono absorbancję 

4

56

 względem odnośnika przy 280 nm. 

W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny 

zawartym  w  roztworze  (100  mM  Tris/HCl,  1  mM  EDTA).  Zmieszano  z  200  μl  30  mM 

fruktozodifosforanu.  Odnośnik  sporządzono  analogicznie.  Wyzerowano  spektrofotometr 

względem  odnośnika.  Dodano  100  μl  roztworu  aldolazy  z  części  I,  natomiast  do  odnośnika 

dodano  taką  samą  objętość  buforu  (10  mM  Tris/HCl,  1  mM  EDTA).  Zmierzono  absorbancję 

4

16

 względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty. 

Ćwiczenie 1.  Wyniki 

Wyniki umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wyniki. 

 

Ćwiczenie 1.  Wnioski 

Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wnioski. 

 

 

Załączniki 

1.

 

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch preparacji (Wykres 1.). 

2.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi obliczeniami. 

3.

 

Instrukcja „Ćwiczenie 3.” wraz z bieżącymi obliczeniami.