1

ZAKŁAD BIOCHEMII

UMCS

BIOCHEMIA II

I rok I stopnia

Biochemia

OCZYSZCZANIE LAKAZY Z CERRENA UNICOLOR

Wstęp

Lakaza (EC 1.10.3.2) należy do dużej grapy enzymów określanych jako miedzioproteidy, czyli

zawierające atomy miedzi w centrum aktywnym, do której należy również oksydaza kwasu askorbinowego i

ceruloplasmina. Enzym ten został odkryty w lateksie sumaka garbarskiego (Rhus vernicifera) w 1883 roku przez

Yoshidę - nazwa angielska tego drzewa to „lacquer tree”, stąd pochodzi nazwa enzymu. Lakaza występuje u

roślin, grzybów, bakterii i owadów.

Lakaza pełni bardzo istotne funkcje biologiczne:



Uczestniczy w procesach biosyntezy ligniny u roślin wyższych.



Uczestniczy w regeneracji uszkodzonych części komórek roślin wyższych.



Bierze udział w relacjach patogen – żywiciel.



Spełnia istotną rolę w detoksyfikacji środowiska naturalnego.



Bierze udział w procesie mikrobiologicznej depolimeryzacji ligniny.

Wspólną cechą wszystkich lakaz są jej katalityczne właściwości, jest to enzym o stosunkowo niskiej

specyficzności substratowej zależnej w dużym stopniu od źródła, z którego wyizolowano enzym. Lakaza jest w

stanie utlenić każdy aromatyczny związek będący donorem wodoru - katalizuje usunięcie elektronu i protonu z

grupy hydroksylowej fenolu lub aromatycznej grupy aminowej, by w konsekwencji utworzyć odpowiednie

wolne rodniki fenolowe i aminowe.

E-Cu

2+

+ AH

2

→ ECu

+

+ (AH

2

)

+

gdzie: E - enzym

AH

2

- substrat

(AH

2

)

+

- substrat utleniony

W końcowej fazie katalizy następuje utlenienie zredukowanego enzymu kosztem cząsteczkowego tlenu, przy

współudziale pochodzących z substratu protonów:

E-Cu

+

+ ½O

2

+ H

+

→ E-Cu

2+

+ ½H

2

O

Obecnie można wyliczyć co najmniej kilka praktycznych i potencjalnych zastosowań dla lakazy:



w procesie delignifikacji przy produkcji papieru,



produkcja etanolu jako źródła energii,



sensory enzymatyczne w analizie leków,



przemysł spożywczy,



przemysł tekstylny,



usuwanie zanieczyszczeń środowiska.

2

Wykonanie ćwiczenia:

I.

Kalibracja kolumny wypełnionej nośnikiem Sephadex G-25



Wykonać roztwór do kalibracji zawierający dwuchromian potasu i blue-dekstran;



Nanieść na kolumnę wypełnioną Sephadexem G-25 odpowiednią ilość roztworu do kalibracji

(1-1,5 ml) i skalibrować kolumnę;

II.

Oczyszczanie preparatu lakazy na kolumnie wypełnionej Sephadexem G-25



Rozpuścić zliofilizowaną lakazę w wodzie destylowanej tak aby uzyskać stężenie 1g/ml;



Następnie nanieść odpowiednią ilość preparatu na kolumnę;



Odsolić;



Oznaczyć aktywność (*) odsolonego preparatu oraz preparatu nieoczyszczonego;

III.

Badanie wpływu pH na aktywność lakazy

Wykonać oznaczenie aktywności lakazy (*) stosując bufory o pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5.

(*) Oznaczanie aktywności lakazy metodą Leonowicz & Grzywnowicz (1981)

W probówce zmieszać:

 500 µl buforu Mcllvaine’a pH 5,5

 350 µl wody destylowanej

 100 µl enzymu

 50 µl 0,5 mM roztworu syryngaldazyny UWAGA! dodać tuż przed pomiarem

Próba kontrolna:

 500 buforu Mcllvaine’a pH 5,5

 450 µl wody destylowanej

 50 µl 0,5 mM roztworu syryngaldazyny

Mierzyć zmiany absorbancji w czasie 120s przy długości fali 525 nm.

Aktywność lakazy w badanej próbie obliczyć ze wzoru:

Akt =

∆A

525

* V

całk

* 10

9

[nkat = nmol/s]

Akt = ∆A

525

* 2564 [nkat/l]

ε * ∆t * V

próby

gdzie:

∆A

525

– przyrost absorbancji

V

całk

– objętość całkowita mieszaniny reakcyjnej (1ml)

ε - molowy współczynnik absorpcji dla utlenionej syryngaldazyny 65000 (65 * 10

3

)

∆t – czas reakcji (60s)

3

V

próby

– objętość roztworu enzymu (0,1 ml)

Zaliczenie ćwiczenia:

Zachować preparat w podpisanej fiolce i przedstawić opis ćwiczenia w zeszycie

4

Odczynniki i sprzęt:



Kolumna chromatograficzna



Sephadex G-25



Blue Dextran



dwuchromian potasu



bufor Mcllvaine’a pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5



0,5 mM roztwór syryngaldazyny w etanolu (1,8 mg/l0ml)



liofilizowany preparat lakazy z Cerrena unicolor

Piśmiennictwo:

1. Leonowicz A., Grzywnowicz

K

., 1981. Quantitative estimation of laccase forms in some whiterot fungi

using siringaldazineas as substrate. Enzyme. Microbiol. Technol., nr 3, 55–57.

2. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.), 2005, Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa.