1 

 

 

ZAKŁAD BIOCHEMII 

UMCS 

BIOCHEMIA II 

I rok I stopnia 

Biochemia 

 

 

OCZYSZCZANIE LAKAZY Z CERRENA UNICOLOR 

 

Wstęp 

 

Lakaza  (EC  1.10.3.2)  należy  do  dużej  grapy  enzymów  określanych  jako  miedzioproteidy,  czyli 

zawierające  atomy  miedzi  w  centrum  aktywnym,  do  której  należy  również  oksydaza  kwasu  askorbinowego  i 

ceruloplasmina. Enzym ten został odkryty w lateksie sumaka garbarskiego (Rhus vernicifera) w 1883 roku przez 

Yoshidę  -  nazwa  angielska  tego  drzewa  to  „lacquer  tree”,  stąd  pochodzi  nazwa  enzymu.  Lakaza  występuje  u 

roślin, grzybów, bakterii i owadów. 

Lakaza pełni bardzo istotne funkcje biologiczne: 



 

Uczestniczy w procesach biosyntezy ligniny u roślin wyższych. 



 

Uczestniczy w regeneracji uszkodzonych części komórek roślin wyższych. 



 

Bierze udział w relacjach patogen – żywiciel. 



 

Spełnia istotną rolę w detoksyfikacji środowiska naturalnego. 



 

Bierze udział w procesie mikrobiologicznej depolimeryzacji ligniny. 

Wspólną  cechą  wszystkich  lakaz  są  jej  katalityczne  właściwości,  jest  to  enzym  o  stosunkowo  niskiej 

specyficzności substratowej zależnej w dużym stopniu od źródła, z którego wyizolowano enzym. Lakaza jest w 

stanie utlenić każdy aromatyczny związek będący donorem wodoru - katalizuje usunięcie elektronu i protonu z 

grupy  hydroksylowej  fenolu  lub  aromatycznej  grupy  aminowej,  by  w  konsekwencji  utworzyć  odpowiednie 

wolne rodniki fenolowe i aminowe.  

 

E-Cu

2+

 + AH

2

 → ECu

+

 + (AH

2

)

+

 

gdzie:  E - enzym 

AH

2

 - substrat 

(AH

2

)

+

 - substrat utleniony 

 

W  końcowej  fazie  katalizy  następuje  utlenienie  zredukowanego  enzymu  kosztem  cząsteczkowego  tlenu,  przy 

współudziale pochodzących z substratu protonów: 

 

E-Cu

+

 + ½O

2

 + H

+

 → E-Cu

2+

 + ½H

2

O 

 

Obecnie można wyliczyć co najmniej kilka praktycznych i potencjalnych zastosowań dla lakazy:  



 

w procesie delignifikacji przy produkcji papieru, 



 

produkcja etanolu jako źródła energii, 



 

sensory enzymatyczne w analizie leków, 



 

przemysł spożywczy, 



 

przemysł tekstylny, 



 

usuwanie zanieczyszczeń środowiska. 

2 

 

 

Wykonanie ćwiczenia: 

 

I. 

Kalibracja kolumny wypełnionej nośnikiem Sephadex G-25 



 

Wykonać roztwór do kalibracji zawierający dwuchromian potasu i blue-dekstran; 



 

Nanieść na kolumnę wypełnioną Sephadexem G-25 odpowiednią ilość roztworu do kalibracji 

(1-1,5 ml) i skalibrować kolumnę; 

 

II. 

Oczyszczanie preparatu lakazy na kolumnie wypełnionej Sephadexem G-25 



 

Rozpuścić zliofilizowaną lakazę w wodzie destylowanej tak aby uzyskać stężenie 1g/ml; 



 

Następnie nanieść odpowiednią ilość preparatu na kolumnę; 



 

Odsolić; 



 

Oznaczyć aktywność (*) odsolonego preparatu oraz preparatu nieoczyszczonego; 

 

III. 

Badanie wpływu pH na aktywność lakazy 

Wykonać oznaczenie aktywności lakazy (*) stosując bufory o pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5. 

 

 

(*) Oznaczanie aktywności lakazy metodą Leonowicz & Grzywnowicz (1981) 

 

W probówce zmieszać: 

  500 µl buforu Mcllvaine’a pH 5,5 

  350 µl wody destylowanej 

  100 µl enzymu 

  50 µl 0,5 mM roztworu syryngaldazyny UWAGA! dodać tuż przed pomiarem 

 

Próba kontrolna: 

  500 buforu Mcllvaine’a pH 5,5 

  450 µl wody destylowanej 

  50 µl 0,5 mM roztworu syryngaldazyny 

 

Mierzyć zmiany absorbancji w czasie 120s przy długości fali 525 nm. 

 

Aktywność lakazy w badanej próbie obliczyć ze wzoru: 

Akt = 

∆A

525

 * V

całk

 * 10

9

 

[nkat = nmol/s] 

       Akt = ∆A

525

 * 2564 [nkat/l] 

ε * ∆t * V

próby

 

 
gdzie: 

∆A

525

 – przyrost absorbancji 

V

całk

 – objętość całkowita mieszaniny reakcyjnej (1ml) 

ε - molowy współczynnik absorpcji dla utlenionej syryngaldazyny 65000 (65 * 10

3

) 

∆t – czas reakcji (60s) 

3 

 

 

V

próby

 – objętość roztworu enzymu (0,1 ml) 

 

 

Zaliczenie ćwiczenia: 

 

Zachować preparat w podpisanej fiolce i przedstawić opis ćwiczenia w zeszycie 

 

 

4 

 

 

Odczynniki i sprzęt: 

 



 

Kolumna chromatograficzna 



 

Sephadex G-25 



 

Blue Dextran 



 

dwuchromian potasu 



 

bufor Mcllvaine’a pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 



 

0,5 mM roztwór syryngaldazyny w etanolu (1,8 mg/l0ml) 



 

liofilizowany preparat lakazy z Cerrena unicolor 

 

 

Piśmiennictwo: 

 

1.  Leonowicz A., Grzywnowicz 

K

., 1981. Quantitative estimation of laccase forms in some whiterot fungi 

using siringaldazineas as substrate. Enzyme. Microbiol. Technol., nr 3, 55–57. 

2.  Kłyszejko-Stefanowicz  L.  (red.),  2005,  Ćwiczenia  z  biochemii.  Wydawnictwo  Naukowe  PWN, 

Warszawa.