Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne

1

==========================================================================================

1. Sporządzanie roztworów

1. Sporządzanie roztworów

1. Sporządzanie roztworów

1. Sporządzanie roztworów

Roztwory mające służyć do oznaczeń jakościowych wystarczy zwykle przygotować z dokładnością do 1%.
Do oznaczeń ilościowych konieczne jest przygotowywanie roztworów z dokładnością 0.1% lub lepszą -
w zależności od żądanej dokładności pomiarów. W szczególności dotyczy to roztworów wzorcowych,
używanych do skalowania metod, np. do sporządzania krzywych kalibracyjnych przy oznaczeniach
spektrofotometrycznych.

1a. Przygotowanie roztworów do oznaczeń jakościowych

Przygotować po 100 ml roztworów wodnych, używając do ważenia wagi technicznej
i cylindrów miarowych do odmierzania objętości:

•

0.25 M sacharozy

•

0.9 % NaCl (w/v) - tzw. "roztwór fizjologiczny"

•

200 mM CuSO

4

•

5 % octanu sodu (w/v)

•

80% etanol w H

2

O (v/v)

1b. Przygotowanie roztworów wzorcowych do oznaczeń ilościowych

Przygotować 25 ml 4.8 mM roztworu glukozy w H

2

O i 25 ml 400 mM roztworu CuCl

2

w 0.9% roztworze NaCl (roztworze fizjologicznym). Ponieważ przygotowanie
bezpośrednio takiego roztworu wymaga ważenia małych ilości odczynnika, najpierw
należy przygotować roztwór o stężeniu wyższym ok. 2 rzędy wielkości, np. 1 M lub
480 mM. Użyć wagi (pół)analitycznej i kolb miarowych.

2. Oznaczenie stężenia CuCl

2. Oznaczenie stężenia CuCl

2. Oznaczenie stężenia CuCl

2. Oznaczenie stężenia CuCl

2

22

2

- bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia

- bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia

- bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia

- bezpośredni spektrofotometryczny pomiar stężenia

chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.

chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.

chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.

chromoforu z użyciem krzywej kalibracyjnej.

Ponieważ jon Cu

2+

jest barwny (jest chromoforem), można oznaczać jego stężenie w próbce na podstawie

absorpcji światła o określonej długości fali - najlepiej w maksimum absorpcji. W celu wyznaczenia
zależności absorbancji od stężenia należy wykonać krzywą kalibracyjną, tj. serię pomiarów roztworów tej
samej substancji w tym samym środowisku o znanym stężeniu.

•

Przygotować serię rozcieńczeń wzorcowego roztworu CuCl

2

(z p. 1b) roztworem

fizjologicznym: 6.25, 12.5, 25, 50, 100 i 200 mM.

•

Dla próbki 100 mM wyznaczyć maksimum absorpcji (

λ

max

) na spektrofotometrze

Metertek metodą kolejnych przybliżeń, z dokładnością 5 nm.

•

Zmierzyć absorbancje próbek serii rozcieńczeń wzorcowych i próbki badanej

(otrzymanej od prowadzącego ćwiczenia) przy maksimum absorpcji.
UWAGA: wszystkie pomiary wykonać względem próbki odniesienia - roztworu
fizjologicznego.

Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne

2

==========================================================================================

•

Odręcznie wykreślić krzywą kalibracyjną i określić stężenie badanej próbki. Wyliczyć

molowy współczynnik absorbancji jonów Cu

2+

w roztworze fizjologicznym.

3. Oznaczanie stężenia jonów Cu

3. Oznaczanie stężenia jonów Cu

3. Oznaczanie stężenia jonów Cu

3. Oznaczanie stężenia jonów Cu

2+

2+

2+

2+

w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym

w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym

w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym

w roztworze o nieznanym składzie (alkalicznym

roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca

roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca

roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca

roztworze albuminy) - przykład zastosowania metody dodatku wzorca

Składniki roztworu mogą bardzo silnie wpływać na własności spektroskopowe chromoforów, zmieniając
zarówno położenie maksimum absorpcji jak i molowy współczynnik absorbancji. W warunkach, gdy skład
próbki nie jest znany, do przybliżonego oznaczenia stężenia chromoforu można użyć metody dodatku
wzorca.

•

2 ml otrzymanej od prowadzącego próbki, zawierającej jony Cu

2+

w alkalicznym

roztworze albuminy surowicy bydlęcej umieścić w kuwecie spektrofotometrycznej.

•

Wyznaczyć

λ

max

próbki (w zakresie 500-650 nm); zmierzyć absorbancje przy maksimum

i przy długości fali tła - 900 nm. Pomiary wykonywać względem powietrza.

•

Dodać 25

µ

l 400 mM roztworu CuCl

2

(z p. 1b), odczekać 2 min i powtórzyć pomiary.

•

Do tej samej próbki dodać powtórnie 25

µ

l 400 mM roztworu CuCl

2

i wykonać pomiary

jeszcze raz.

•

Obliczyć stężenie jonów Cu

2+

w próbce badanej zakładając addytywność absorbancji w

badanym roztworze i przyjmując zmierzone wartości A

800nm

za tło. Obliczyć molowy

wspólczynnik absorbancji Cu

2+

w tych warunkach i porównać z otrzymanym w

ćwiczeniu 2.

4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą

4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą

4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą

4. Oznaczanie stężenia glukozy metodą Somogyi-Nelsona - oznaczanie

Somogyi-Nelsona - oznaczanie

Somogyi-Nelsona - oznaczanie

Somogyi-Nelsona - oznaczanie chromoforu

chromoforu

chromoforu

chromoforu

wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.

wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.

wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.

wytworzonego w ilościowej reakcji chemicznej z badaną substancją.

W celu oznaczenia związków nie zawierających grup chromoforowych wykorzystać można reakcje
chemiczne badanej substancji, prowadzące do ilościowego wytworzenia substancji absorbującej światło.
Do oznaczania stężenia cukrów redukujących wykorzystuje się ich zdolność redukowania jonów Cu

2+

do

Cu

+

, które następnie redukują odczynnik arsenomolibdenowy do błękitu molibdenowego, silnie

absorbującego światło przy

λ

max

=520 nm. W celu uzyskania wysokiej dokładności do wzorcowania tego typu

metod używa się zazwyczaj serii roztworów wzorcowych poddawanych obróbce chemicznej jednocześnie z
próbką badaną.

•

Przygotować "odczynnik miedziowy" Somogyi-Nelsona: zmieszać roztwór

węglanu/winianu z roztworem CuSO

4

w stosunku 25:1 (obliczyć ilość gotowego roztworu

potrzebną do wykonania oznaczeń!).

•

Z wykonanego wcześniej 4.8 mM roztworu wzorcowego glukozy przygotować po 1 ml

roztworów szeregu rozcieńczeń: 75, 150, 300 600

µ

M, 1.2, 2.4, 4.8 mM.

•

Oznaczenia wykonać dla powyższego szeregu rozcieńczeń (krzywa kalibracyjna), próby

ślepej (roztwór fizjologiczny) i (3 powtórzenia) dla próbki otrzymanej od prowadzącego.
Czynności dla wszystkich próbek przeprowadzać jednocześnie!

Roztwory - obliczenia, przygotowanie. Doświadczenia jakościowe i ilościowe. Oznaczenia spektrofotometryczne

3

==========================================================================================

Procedurę oznaczenia dla pojedynczej próbki przeprowadzać jak następuje:
UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na

UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na

UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na

UWAGA! Wszystkie odczynniki wkraplać NA DNO probówki, tak aby nie zostawały na
ściankach !!!

ściankach !!!

ściankach !!!

ściankach !!!

•

W standardowej szklanej probówce umieścić 200

µ

l "odczynnika miedziowego"

•

Energicznie dodać 200

µ

l badanej próbki

•

W wylocie probówki umieścić chłodniczkę zwrotną i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej

przez co najmniej 15 min.

•

Ostudzić i dodać 200

µ

l odczynnika arsenowo-molibdenowego. Silnie mieszać do zaniku

pienienia, następnie dodać 5 ml H

2

O.

•

Mierzyć absorbancję przy

λ

=520 nm względem wody.

Na podstawie uzyskanych wyników (odejmując absorbancję ślepej próby od wszystkich
pozostałych absorbancji) wykreślić odręcznie krzywą kalibracyjną i określić stężenie
badanej próbki oraz błąd (rozrzut) przeprowadzonego oznaczenia.

Odczynniki i materiały:
sacharoza, glukoza, NaCl, CuSO

4

⋅

5H

2

O, octan sodu bezwodny i trójwodny, CuCl

2

: w oryginalnych

opakowaniach; etanol 96% (skażony acetonem), roztwory do oznaczania glukozy met. Somogyi-Nelsona, 1%
roztwór BSA w 1.5M KOH (lub białko jajka kurzego rozcieńczone 10-krotnie 1.5M KOH); próbki glukozy w
wodzie, CuCl

2

w roztworze fizjologicznym i w alkalicznym roztworze białka jako zadania

Sprzęt:
waga techniczna, waga (pół)analityczna, naczynka do ważenia, komplet pipet automatycznych, końcówki
do pipet, cylindry miarowe, kolby miarowe 25 ml, zlewki 200 ml, probówki szklane standardowe,
chłodniczki zwrotne, spektrofotometry Metertek, kuwety plastikowe, wrząca łażnia wodna