Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów
1
I. Reakcje charakterystyczne dla mocznika i kreatyniny
Mocznik, czyli diamid kwasu węglowego jest związkiem bardziej zasadowym niż
monoamidy kwasów karboksylowych, stąd tworzy łatwo sole z mocnymi kwasami.
Przykładem może być wytrącanie mocznika z roztworów wodnych pod wpływem kwasu
azotowego (V).Tworzy się wtedy trudno rozpuszczalny azotan (V) mocznika. W trakcie
ogrzewania mocznika in substantia tworzy się dimocznik, czyli biuret oraz wydziela
amoniak. W środowisku zasadowym biuret występuje w formie enolowej i tworzy z jonami
Cu
2+
związki kompleksowe, o charakterystycznym fioletowym zabarwieniu. Tego typu
kompleksy tworzą także peptydy oraz białka. Ponadto mocznik, podobnie jak aminy
alifatyczne I-rzędowe, może reagować z kwasem azotowym (III). Następuje wtedy
wydzielenie gazowego azotu, przy czym mocznik ulega degradacji do dwutlenku węgla i
wody. Z kolei w reakcjach kreatyniny z nitroprusydkiem sodu bądź kwasem pikrynowym
(odczyn Weyla i Jaffego) powstają barwne kompleksy.
1. Reakcja z kwasem azotowym (V)
Mocznik, reagując z kwasem azotowym (V), tworzy trudno rozpuszczalny azotan (V)
mocznika. Kroplę stężonego roztworu mocznika umieścić na szkiełku podstawowym i dodać
kroplę stężonego roztworu HNO
3
. Po chwili tworzą się kryształy, które należy oglądać pod
mikroskopem.
C
O
NH
2
NH
2
C
O
H
NH
NH
2
C
O
H
NH
NH
3
+
HNO
3
+
NO
3
2. Odczyn biuretowy (odczyn Piotrowskiego)
Około 100 mg mocznika ogrzewać w suchej probówce tak długo, aż zacznie wydzielać się
amoniak. Po ostudzeniu rozpuścić powstały biuret w roztworze NaOH i dodać 3-4 krople
rozcieńczonego roztworu CuSO
4
. Powstaje fioletowe zabarwienie roztworu.
C
O
NH
2
NH
2
NH
3
C
O
NH
2
NH
C
O
NH
2
OH
C
O
H
NH
NH
C
O
H
NH
Cu
2+
, 2OH
2H
2
O
C
O
NH
NH
C
O
N
H
Cu
3. Reakcja z kwasem azotowym (III)
Do probówki wlać 1 ml stężonego roztworu mocznika, a następnie dodać 3-4 krople roztworu
azotanu (III) sodu i dodać ok. 1 ml rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego lub solnego.
Mocznik ulega wtedy rozkładowi z wydzieleniem azotu.
C
O
NH
2
NH
2
2HNO
2
+
CO
2
2N
2
+
+
3H
2
O
4. Odczyn Weyla
Do probówki wlać 2 ml roztworu kreatyniny, a następnie dodać 4-5 kropli nasyconego
roztworu nitroprusydku sodu i 1ml 10% roztworu NaOH. Pojawia się czerwone zabarwienie
znikające po dodaniu roztworu kwasu octowego. Odczyn jest mało swoisty. Jeżeli kreatyninę
oznacza się w surowicy krwi mogą reagować występujące tam substancje ketonowe z tym, że
wtedy czerwone zabarwienie roztworu utrzymuje się jeszcze po dodaniu kwasu octowego.
Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów
2
5. Odczyn Jaffego
Do probówki wlać l mi roztworu kreatyniny, a następnie dodać 2 mi nasyconego roztworu
kwasu pikrynowego i 0,5 ml 10% roztworu NaOH. Powstaje kompleks o barwie
pomarańczowoczerwonej.
O
-
NO
2
NO
2
O
2
N
+
O
-
NO
2
NO
2
O
2
N
C
H
2
N
+
C
NH
C
O
NH
C
H
3
pikrynian kreatyniny
kwas pikrynowy
kreatynina
C
H
2
N
C
NH
C
O
NH
CH
3
II. Oznaczanie stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi metodą Sterna i Shapiro
Zasada metody: W metodzie Sterna i Shapiro wykorzystuje się ekstrakt triacylogliceroli (TG)
uzyskany z surowicy krwi przy użyciu izopropanolu. Wyekstrahowane TG poddaje się
hydrolizie w obecności roztworu wodorotlenku sodu. Powstałe po hydrolizie wolne reszty
kwasów tłuszczowych reagują z hydroksyloaminą tworząc kwasy hydroksamowe. Otrzymane
kwasy
hydroksamowe
w środowisku kwaśnym tworzą kompleksy o barwie
czerwonofioletowej w obecności jonów żelaza na trzecim stopniu utlenienia (Fe
3+
).
Środowisko kwaśne zabezpiecza przed strąceniem trudno rozpuszczalnego osadu
wodorotlenku żelaza (III). Intensywność powstałego zabarwienia jest wprost proporcjonalna
do stężenia uwolnionych podczas hydrolizy reszt kwasów tłuszczowych.
C
H
2
C
H
C
H
2
O
O
O
C
C
C
R
R
R
O
O
O
+
3H
2
O
OH
-
R C
OH
O
3
C
H
2
C
H
C
H
2
OH
OH
OH
+
R C
OH
O
N
H
2
OH
+
H
+
O
H
2
kwas hydroksamowy
R C
O
N OH
H
N
O
H
R
C
O
R C
O
N O
H
Fe
R
C
O
N
O
H
barwny kompleks
Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów
3
Materiał i odczynniki
Surowica krwi
Izopropanol
Roztwór wzorcowy trioleinianu o stężeniu 50 mg/dl (50 mg oliwy przenieść ilościowo
do kolby miarowej o objętości 100 cm
3
a następnie rozpuścić w 50 cm
3
izopropanolu
o czym uzupełnić izopropanolem do tej objętości)
14% roztwór chlorowodorku hydroksyloaminy (odczynnik nietrwały i należy go
przygotować bezpośrednio przed wykonaniem oznaczenia)
3,8 M roztwór HCl (do kolby miarowej o objętości 100 cm
3
dodać 20 cm
3
wody
destylowanej a następnie 29 cm
3
stężonego HCl; po wymieszaniu uzupełnić wodą
destylowaną do 100 cm
3
)
10% roztwór wodorotlenku sodu
10% roztwór chlorku żelaza (III) w 0,1 M roztworze HCl
Wykonanie oznaczenia
Ekstrakcja TG: do probówki wprowadzić 1,9 cm
3
izopropanolu i 0,1 cm
3
surowicy
krwi. Następnie próbę dokładnie wytrząsnąć i pozostawić na 10 minut w temperaturze
pokojowej. Po zakończonej inkubacji zwirować próbę 2000 obr/min przez 5 min. Do
dalszej części oznaczenia wykorzystać warstwę izopropanolową (ekstrakt zawierający
TG).
Następnie wykonać oznaczenie zgodnie z zapisem w Tab. 1.
Tabela 1.
Próba
ślepa
Próba
badana
Próba
wzorcowa
Ekstrakt TG [cm
3
]
-
1,0
-
Roztwór wzorcowy tioleinianu
o stężeniu 50 mg/dl [cm
3
]
-
-
1,0
Izopropanol [cm
3
]
1,0
-
-
10% roztwór NaOH [cm
3
]
0,5
0,5
0,5
14% roztwór hydroksyloaminy [cm
3
]
0,5
0,5
0,5
Próby wymieszać a następnie inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej
3,8 M roztwór HCl [cm
3
]
0,5
0,5
0,5
10% roztwór FeCl [cm
3
]
0,5
0,5
0,5
Próby wymieszać a następnie inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej. Odczytać
A
530
A
530
Stężenie TG wyznaczyć z zależności:
gdzie A
B
oznacza absorbancję próby badanej a A
W
absorbancję próby wzorcowej.
Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów
4
III. Wykrywanie indykanu w moczu
Prawidłowa ilość indykanu w moczu jest nieznaczna (do 20 mg na dobę). Indykan powstaje
w wyniku działania bakterii jelitowych, szczególnie Escherichia coli na tryptofan powstały w
przewodzie pokarmowym z rozkładu białek. W reakcjach skracania łańcucha bocznego Trp
przechodzi kolejno w kwas indolooctowy, skatol i indol. Indol za pośrednictwem bakterii
jelitowych dostaje się do krwioobiegu, a następnie trafia do wątroby, gdzie jest utleniany do
silnie toksycznego indoksylu. Indoksyl, podobnie jak inne związki takie jak krezol czy fenol,
traci właściwości toksyczne po połączeniu z kwasem siarkowym (VI) lub kw. glukuronowym.
Kwasy indoksylosiarkowy lub indoksyloglukuronowy występują najczęściej w postaci soli
potasowych, które nazywane są indykanem. Ilość wydzielanego indykanu jest miarą nasilenia
procesów gnilnych w jelicie. Dużo indykanu w moczu pojawia się na skutek niedrożności
jelit, gruźlicy jelit, zapalenia otrzewnej, ropowicy lub duru brzusznego.
COOH
NH
2
N
H
COOH
N
H
CH
3
N
H
N
H
tryptofan
kw. indolooctowy
skatol
indol
OH
N
H
indoksyl
OSO
3
H
N
H
kw. indoksylosiarkowy
Wykrywanie indykanu opiera się na reakcji rozbicia tego związku na indoksyl i odpowiedni
kwas. Powstały indoksyl utlenia się w obecności FeCl
3
, H
2
O
2
lub KMnO
4
. Wytworzony
barwnik – indygo ekstrahuje się za pomocą chloroformu, który zabarwia się najczęściej na
niebiesko.
Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów
5
OH
N
H
O
H
N
H
+
+
O
2
O
N
H
O
N
H
+
2H
2
O
indygo
1. Zmodyfikowana próba Obermayera
Do 8 ml moczu dodać 2 ml 5% (CH
3
COO)
2
Pb; otrzymaną próbę przesączyć. Do 1 ml
przesączu dodać 1 ml 0,4% roztworu FeCl
3
w stężonym HCl, 1 ml płynu Lugola oraz 2 ml
chloroformu. Całość zatkać korkiem i wytrząsać. Warstwa chloroformowa przyjmuje barwę
różową świadczącą o obecności indykanu.
2. Próba Denigesa
Do 2 ml moczu dodać 2 ml stężonego HCl, 5 kropli 1% roztworu H
2
O
2
(lub 5 kropli 0,02 M
roztworu KMnO
4
) i 2 ml chloroformu. Całość zatkać korkiem i wytrząsać. Warstwa
chloroformowa przyjmuje barwę niebieską świadczącą o obecności indykanu.