Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów

1

I. Reakcje charakterystyczne dla mocznika i kreatyniny

Mocznik, czyli diamid kwasu węglowego jest związkiem bardziej zasadowym niż

monoamidy kwasów karboksylowych, stąd tworzy łatwo sole z mocnymi kwasami.
Przykładem może być wytrącanie mocznika z roztworów wodnych pod wpływem kwasu
azotowego (V).Tworzy się wtedy trudno rozpuszczalny azotan (V) mocznika. W trakcie
ogrzewania mocznika in substantia tworzy się dimocznik, czyli biuret oraz wydziela
amoniak. W środowisku zasadowym biuret występuje w formie enolowej i tworzy z jonami
Cu

2+

związki kompleksowe, o charakterystycznym fioletowym zabarwieniu. Tego typu

kompleksy tworzą także peptydy oraz białka. Ponadto mocznik, podobnie jak aminy
alifatyczne I-rzędowe, może reagować z kwasem azotowym (III). Następuje wtedy
wydzielenie gazowego azotu, przy czym mocznik ulega degradacji do dwutlenku węgla i
wody. Z kolei w reakcjach kreatyniny z nitroprusydkiem sodu bądź kwasem pikrynowym
(odczyn Weyla i Jaffego) powstają barwne kompleksy.

1. Reakcja z kwasem azotowym (V)

Mocznik, reagując z kwasem azotowym (V), tworzy trudno rozpuszczalny azotan (V)
mocznika. Kroplę stężonego roztworu mocznika umieścić na szkiełku podstawowym i dodać
kroplę stężonego roztworu HNO

3

. Po chwili tworzą się kryształy, które należy oglądać pod

mikroskopem.

C

O

NH

2

NH

2

C

O

H

NH

NH

2

C

O

H

NH

NH

3

+

HNO

3

+

NO

3

2. Odczyn biuretowy (odczyn Piotrowskiego)

Około 100 mg mocznika ogrzewać w suchej probówce tak długo, aż zacznie wydzielać się
amoniak. Po ostudzeniu rozpuścić powstały biuret w roztworze NaOH i dodać 3-4 krople
rozcieńczonego roztworu CuSO

4

. Powstaje fioletowe zabarwienie roztworu.

C

O

NH

2

NH

2

NH

3

C

O

NH

2

NH

C

O

NH

2

OH

C

O

H

NH

NH

C

O

H

NH

Cu

2+

, 2OH

2H

2

O

C

O

NH

NH

C

O

N
H

Cu

3. Reakcja z kwasem azotowym (III)

Do probówki wlać 1 ml stężonego roztworu mocznika, a następnie dodać 3-4 krople roztworu
azotanu (III) sodu i dodać ok. 1 ml rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego lub solnego.
Mocznik ulega wtedy rozkładowi z wydzieleniem azotu.

C

O

NH

2

NH

2

2HNO

2

+

CO

2

2N

2

+

+

3H

2

O

4. Odczyn Weyla

Do probówki wlać 2 ml roztworu kreatyniny, a następnie dodać 4-5 kropli nasyconego
roztworu nitroprusydku sodu i 1ml 10% roztworu NaOH. Pojawia się czerwone zabarwienie
znikające po dodaniu roztworu kwasu octowego. Odczyn jest mało swoisty. Jeżeli kreatyninę
oznacza się w surowicy krwi mogą reagować występujące tam substancje ketonowe z tym, że
wtedy czerwone zabarwienie roztworu utrzymuje się jeszcze po dodaniu kwasu octowego.

Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów

2

5. Odczyn Jaffego

Do probówki wlać l mi roztworu kreatyniny, a następnie dodać 2 mi nasyconego roztworu
kwasu pikrynowego i 0,5 ml 10% roztworu NaOH. Powstaje kompleks o barwie
pomarańczowoczerwonej.

O

-

NO

2

NO

2

O

2

N

+

O

-

NO

2

NO

2

O

2

N

C

H

2

N

+

C

NH

C

O

NH

C

H

3

pikrynian kreatyniny

kwas pikrynowy

kreatynina

C

H

2

N

C

NH

C

O

NH

CH

3

II. Oznaczanie stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi metodą Sterna i Shapiro

Zasada metody: W metodzie Sterna i Shapiro wykorzystuje się ekstrakt triacylogliceroli (TG)
uzyskany z surowicy krwi przy użyciu izopropanolu. Wyekstrahowane TG poddaje się
hydrolizie w obecności roztworu wodorotlenku sodu. Powstałe po hydrolizie wolne reszty
kwasów tłuszczowych reagują z hydroksyloaminą tworząc kwasy hydroksamowe. Otrzymane
kwasy

hydroksamowe

w środowisku kwaśnym tworzą kompleksy o barwie

czerwonofioletowej w obecności jonów żelaza na trzecim stopniu utlenienia (Fe

3+

).

Środowisko kwaśne zabezpiecza przed strąceniem trudno rozpuszczalnego osadu
wodorotlenku żelaza (III). Intensywność powstałego zabarwienia jest wprost proporcjonalna
do stężenia uwolnionych podczas hydrolizy reszt kwasów tłuszczowych.

C

H

2

C

H

C

H

2

O

O

O

C

C

C

R

R

R

O

O

O

+

3H

2

O

OH

-

R C

OH

O

3

C

H

2

C

H

C

H

2

OH

OH

OH

+

R C

OH

O

N

H

2

OH

+

H

+

O

H

2

kwas hydroksamowy

R C

O

N OH

H

N

O

H

R

C

O

R C

O

N O

H

Fe

R

C

O

N

O

H

barwny kompleks

Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów

3

Materiał i odczynniki

Surowica krwi
Izopropanol

Roztwór wzorcowy trioleinianu o stężeniu 50 mg/dl (50 mg oliwy przenieść ilościowo

do kolby miarowej o objętości 100 cm

3

a następnie rozpuścić w 50 cm

3

izopropanolu

o czym uzupełnić izopropanolem do tej objętości)

14% roztwór chlorowodorku hydroksyloaminy (odczynnik nietrwały i należy go

przygotować bezpośrednio przed wykonaniem oznaczenia)

3,8 M roztwór HCl (do kolby miarowej o objętości 100 cm

3

dodać 20 cm

3

wody

destylowanej a następnie 29 cm

3

stężonego HCl; po wymieszaniu uzupełnić wodą

destylowaną do 100 cm

3

)

10% roztwór wodorotlenku sodu

10% roztwór chlorku żelaza (III) w 0,1 M roztworze HCl

Wykonanie oznaczenia

Ekstrakcja TG: do probówki wprowadzić 1,9 cm

3

izopropanolu i 0,1 cm

3

surowicy

krwi. Następnie próbę dokładnie wytrząsnąć i pozostawić na 10 minut w temperaturze
pokojowej. Po zakończonej inkubacji zwirować próbę 2000 obr/min przez 5 min. Do
dalszej części oznaczenia wykorzystać warstwę izopropanolową (ekstrakt zawierający
TG).

Następnie wykonać oznaczenie zgodnie z zapisem w Tab. 1.

Tabela 1.

Próba

ślepa

Próba

badana

Próba

wzorcowa

Ekstrakt TG [cm

3

]

-

1,0

-

Roztwór wzorcowy tioleinianu
o stężeniu 50 mg/dl [cm

3

]

-

-

1,0

Izopropanol [cm

3

]

1,0

-

-

10% roztwór NaOH [cm

3

]

0,5

0,5

0,5

14% roztwór hydroksyloaminy [cm

3

]

0,5

0,5

0,5

Próby wymieszać a następnie inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej

3,8 M roztwór HCl [cm

3

]

0,5

0,5

0,5

10% roztwór FeCl [cm

3

]

0,5

0,5

0,5

Próby wymieszać a następnie inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej. Odczytać

A

530

A

530

Stężenie TG wyznaczyć z zależności:

gdzie A

B

oznacza absorbancję próby badanej a A

W

absorbancję próby wzorcowej.

Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów

4

III. Wykrywanie indykanu w moczu

Prawidłowa ilość indykanu w moczu jest nieznaczna (do 20 mg na dobę). Indykan powstaje

w wyniku działania bakterii jelitowych, szczególnie Escherichia coli na tryptofan powstały w
przewodzie pokarmowym z rozkładu białek. W reakcjach skracania łańcucha bocznego Trp
przechodzi kolejno w kwas indolooctowy, skatol i indol. Indol za pośrednictwem bakterii
jelitowych dostaje się do krwioobiegu, a następnie trafia do wątroby, gdzie jest utleniany do
silnie toksycznego indoksylu. Indoksyl, podobnie jak inne związki takie jak krezol czy fenol,
traci właściwości toksyczne po połączeniu z kwasem siarkowym (VI) lub kw. glukuronowym.
Kwasy indoksylosiarkowy lub indoksyloglukuronowy występują najczęściej w postaci soli
potasowych, które nazywane są indykanem. Ilość wydzielanego indykanu jest miarą nasilenia
procesów gnilnych w jelicie. Dużo indykanu w moczu pojawia się na skutek niedrożności
jelit, gruźlicy jelit, zapalenia otrzewnej, ropowicy lub duru brzusznego.

COOH

NH

2

N
H

COOH

N
H

CH

3

N
H

N
H

tryptofan

kw. indolooctowy

skatol

indol

OH

N
H

indoksyl

OSO

3

H

N
H

kw. indoksylosiarkowy

Wykrywanie indykanu opiera się na reakcji rozbicia tego związku na indoksyl i odpowiedni
kwas. Powstały indoksyl utlenia się w obecności FeCl

3

, H

2

O

2

lub KMnO

4

. Wytworzony

barwnik – indygo ekstrahuje się za pomocą chloroformu, który zabarwia się najczęściej na
niebiesko.

Biochemia II rok biologii i biotechnologii
materiały uzupełniające do ćwiczenia 13: Katabolizm białek i tłuszczów

5

OH

N
H

O

H

N
H

+

+

O

2

O

N
H

O

N
H

+

2H

2

O

indygo

1. Zmodyfikowana próba Obermayera

Do 8 ml moczu dodać 2 ml 5% (CH

3

COO)

2

Pb; otrzymaną próbę przesączyć. Do 1 ml

przesączu dodać 1 ml 0,4% roztworu FeCl

3

w stężonym HCl, 1 ml płynu Lugola oraz 2 ml

chloroformu. Całość zatkać korkiem i wytrząsać. Warstwa chloroformowa przyjmuje barwę
różową świadczącą o obecności indykanu.

2. Próba Denigesa

Do 2 ml moczu dodać 2 ml stężonego HCl, 5 kropli 1% roztworu H

2

O

2

(lub 5 kropli 0,02 M

roztworu KMnO

4

) i 2 ml chloroformu. Całość zatkać korkiem i wytrząsać. Warstwa

chloroformowa przyjmuje barwę niebieską świadczącą o obecności indykanu.